phân lập và tuyển chọn một số dõng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC (CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP Cần thơ, tháng 11/2014 SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN DIỆP MINH TÂN MSSV: 3102681 LỚP: CNSHTT K36 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC (CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN DIỆP MINH TÂN MSSV: 3102681 LỚP: CNSHTT K36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Diệp Minh Tân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình học tập nghiên cứu Viện NC&PT Công nghệ Sinh học – trường Đại học Cần Thơ, nhận không động viên chân thành từ phía thầy cô giáo, gia đình bạn bè. Điều giúp cho nhiều, góp phần giúp cho hoàn thành khóa học đặc biệt trình thực luận văn tốt nghiệp. Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý thầy cô thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học quan tâm, tận tình dạy bảo truyền thụ kiến thức giúp cho tự tin hiểu biết chuyên môn nhiều hơn. Thầy PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học hướng dẫn tận tình, truyền đạt kinh nghiệm kiến thức quý báu lĩnh vực chuyên môn để giúp hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp. Cô ThS. Trần Thị Xuân Mai quan tâm, động viên theo sát suốt trình làm cố vấn học tập. Các anh chị bạn sinh viên làm việc phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ ủng hộ mặt tinh thần cho tôi. Đặc biệt quan tâm, chia sẻ khó khăn vật chất lẫn tinh thần gia đình người thân khoảng thời gian xa nhà để học tập hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý thầy cô tất bạn bè tôi. Cần thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2014 Nguyễn Diệp Minh Tân ____________________________________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ TÓM LƢỢC Ô nhiễm rác thải sinh hoạt vấn đề xã hội quan tâm nay. Thành phần rác thải hữu cellulose. Nếu biện pháp xử lý tốt ảnh hưởng xấu đến môi trường. Việc sử dụng vi khuẩn để xử lý rác thải hữu biện pháp hiệu cao, thân thiện với môi trường đem lại nhiều lợi ích khác. Từ phần đất dịch rác thu bãi rác huyện Ngã Năm tỉnh Sóc Trăng, dòng vi khuẩn phân lập khảo sát nhằm mục tiêu tuyển chọn vài dòng vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme cellulase cao. Mười tám dòng vi khuẩn phân lập môi trường chứa 1% CMC nguồn carbon nhất. Phần lớn dòng vi khuẩn có dạng que, Gram âm phản ứng dương tính với catalase. Kết khảo sát khả phân hủy cellulose nhờ phương pháp đục lỗ thạch nhỏ giọt vi khuẩn kết hợp với việc đo đường kính thủy phân sau nhuộm lugol trên môi trường thạch với nguồn cellulose CMC bột giấy. Qua đó, tuyển chọn dòng có khả tổng hợp cellulase để thủy phân cellulose tốt dòng vi khuẩn C.D.9 C.D.10. Định danh kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp sử dụng công cụ Blast nucleotide ngân hàng gen NCBI cho thấy dòng vi khuẩn C.D.9 C.D.10 nhận diện Bacillus flexus Bacillus subtilis với độ tương đồng 98% Từ khóa: Bacillus flexus, Bacillus subtilis, bột giấy, cellulase, cellulose. ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ MỤC LỤC Trang CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài . CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược cellulose enzyme cellulase 2.2 Cơ chế phân hủy cellulose 2.2.1 Quá trình phân hủy hiếu khí cellulose . 2.2.2 Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose 2.3 Giới thiệu số dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose . 2.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis. . 2.3.2 Vi khuẩn Bacillus flexus. . 2.3.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp . 2.3 Các nghiên cứu nước 2.3.1 Nghiên cứu nước 2.3.2 Nghiên cứu nước 2.4 Kỹ thuật PCR CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 10 3.1. Phương tiện nghiên cứu . 10 3.1.1 Thời gian, địa điểm 10 3.1.2 Nguyên vật liệu 10 3.1.3 Thiết bị, hóa chất . 10 3.2 Phương pháp nghiên cứu 12 3.2.1 Chuẩn bị mẫu vật . 12 3.2.2 Phân lập dòng vi khuẩn có khả phân hủy cellulose từ đất dịch rác thải: 13 3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase đặc điểm sinh hóa dòng vi khuẩn môi trường CMC. 16 ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ 3.2.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả phân hủy bột giấy dòng vi khuẩn có khả tổng hợp enzyme cellulase. 17 3.2.5 Nhận diện số dòng vi khuẩn . 18 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Kết phân lập . 20 4.2 Đặc tính khuẩn lạc 18 dòng vi khuẩn phân lập . 21 4.3 Đặc điểm tế bào vi khuẩn . 23 4.4 Hoạt tính catalase dòng vi khuẩn phân lập . 25 4.5 Kết kiểm tra Methyl red . 26 4.6 Hoạt tính enzyme cellulase môi trường CMC . 28 4.7 Kết khảo sát hoạt tính enzyme cellulase môi trường bột giấy 30 4.8 Nhận diện số dòng vi khuẩn 31 4.8.1 Dòng vi khuẩn C.D.9 . 31 4.8.2 Dòng vi khuẩn C.D.10 . 32 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị . 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn 12 Bảng 2. Môi trường thử khả phân hủy bột giấy . 12 Bảng 3. Môi trường glucose-phosphate 13 Bảng 4. Tóm tắt giai đoạn nhuộm Gram vi khuẩn . 16 Bảng 5. Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập . 21 Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập . 22 Bảng 7. Tỷ lệ hình thái khuẩn lạc . 23 Bảng 8.Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn phân lập môi trường CMC24 Bảng 9. Tỷ lệ đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn . 25 Bảng 10. Kết kiểm tra Methyl red dòng vi khuẩn . 27 Bảng 11. Hoạt tính enzyme cellulase dòng vi khuẩn môi trường CMC 30 Bảng 12. Hoạt tính enzyme cellulase dòng vi khuẩn môi trường bột giấy31 ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Sơ đồ biểu diễn chuỗi cellulose . Hình 2. Cơ chế hoạt động enzyme cellulase Hình 3. Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 4. Vi khuẩn Bacillus flexus Hình 5. Vi khuẩn Cellulomonas flavigena . Hình 6. Khuẩn lạc phát triển môi trường CMC sau 48 . 24 Hình 7. Tế bào vi khuẩn nhuộm Gram quan sát vật kính X40 . 26 Hình 8. Khả tổng hợp catalase vi khuẩn 27 Hình 9. Kết kiểm tra methyl red dòng vi khuẩn 28 Hình 10. Vi khuẩn tạo vòng thủy phân nhuộm Lugol 29 Hình 11. Vi khuẩn tạo vòng thủy phân môi trường bột giấy . 32 ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool DNA Deoxyribo Nucleic Acid mm milimet PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Bacillus flexus biết đến với khả tổng hợp tốt cellulase protease (Jyoti verma et al, 2013). Theo Zhao et al. (2008), Bacillus flexus mô tả vi khuẩn Gram dương, dạng que, có khả chuyển động, có khả sinh nội bào tử vi khuẩn hiếu khí. Chúng có khả sống môi trường với phổ pH rộng từ 4,012,5 nhiệt độ tối ưu để phát triển 37oC. Khả phân hủy cellulose Bacillus flexus nghiên cứu ứng dụng nhiều thực tiễn nông nghiệp trồng trọt, thực phẩm, công nghiệp dệt, chất tẩy rửa lĩnh vực khác (Ramesh Chander Kuhad, 2011). Ngoài theo Naveen Shankar et al. (2014), tận dụng khả thủy phân cellulase loài vi khuẩn cho việc sản xuất điện sinh học. 4.8.2 Dòng vi khuẩn C.D.10 So sánh độ tương đồng trình tự dòng C.D.10 ngân hàng gene NCBI cho kết C.D.10 Bacillus subtilis. Kết cho thấy dòng C.D.10 có độ tương đồng cao với Bacillus subtilis với độ tương đồng 98%. Dựa vào kết giải trình tự bước kiểm tra sinh hóa bản, xác dịnh C.D.10 Bacillus subtilis. Bacillus subtilis mô tả vi khuẩn Gram dương, dạng que, có sinh nội bào tử thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí kỵ khí tùy ý. Khi gặp nhiệt độ cao >80 oC hình thành nội bào tử (Ferguson et al.2000). Theo Trần Thị Ánh Tuyết et al. (2008), việc nghiên cứu cellulase Bacillus subtilis thực từ lâu, sử dụng để sản xuất enzyme quy mô công nghiệp sản xuất ethanol, chế biến thực phẩm cải tạo đất. Theo Saraswati Bai et al. (2012), Bacillus subtilis phát có khả tổng hợp cellulase cao, không gây hại điều kiện tối hảo để chúng tổng hợp cellulase nhiệt độ 30oC pH từ 6,5-7. ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu rác dịch rác huyện Ngã Năm tỉnh Sóc Trăng, phân lập 18 dòng vi khuẩn. Trong có 10 dòng có khả tổng hợp enzyme cellulase tốt. Sau khảo sát chất bột giấy chọn dòng có khả phân hủy cellulose mạnh để tiến hành giải trình tự C.D.9 C.D.10. Dựa vào kết giải trình tự vùng gene 16SrRNA bước kiểm tra sinh hóa dòng vi khuẩn C.D.9 C.D.10 cho thấy C.D.9 vi khuẩn Bacillus flexus C.D.10 vi khuẩn Bacillus subtilis, dòng có độ tương đồng 98%. 5.2 Đề nghị Sử dụng dòng vi khuẩn giải trình tự để khảo sát khả phân hủy cellulose điều kiện khác nhiệt độ, pH, . Bố trí thí nghiệm để khảo sát khả phân hủy cellulose rác thải hữu dòng C.D.9 C.D.10. ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Bài giảng thực hành vi sinh vật đại cương. Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, trang 5-6. Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, trang 34-45. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Công Nghệ Sinh Học (tập 2), thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia TP HCM, trang 36-43. Nguyễn Phú Cường. 2011. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phân hủy CMC từ sùng (Scarabaeiform larva). Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 2-12. Nguyễn Thị Diệu Hiền. 2009. Phân lập vi khuẩn có khả phân hủy cellulose trấu hoai mục. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ sinh học. Trường Đại học Cần Thơ. Võ Trí Đức, Võ Văn Song Toàn Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Phân lập vi khuẩn từ cỏ phân trâu, bò. Luận văn tốt nghiệp Đại học, Viện NC&PT Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ, trang 26-32. Phan Thị Mộng Tuyền. 2012. Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phân hủy cellulose từ dịch rác thải. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ sinh học. Trường Đại học Cần Thơ. Trần Cẩm Vân. 2005. Giáo trình Vi sinh vật học môi trường. Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 79-80. Trần Thị Ánh Tuyết Trương Quốc Huy. 2010. Khảo sát điều kiện nuôi cấy chiết tách enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Tuyển tập báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đà Nẵng, trang 378-384. Tiếng Anh ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Clark, W. M., and H. A. Lubs. 1915. The differentiation of bacteria of the colonaerogenes family by the use of indicators. J. Infect. Dis. 17:160-173. Ferguson, C.M.J, N.A. Booth and E.J. Allan. 2000. An ELISA for the detection of Bacillus subtilis L-form bacteria confirms their symbiosis in strawberry. Letters in Applied Microbiology, 31:390-394. Hiromi Tanaka, Kenji Koike, Shuji Itakura and Akio Enoki. 2009. Degradation of wood and enzyme production by Ceriporiopsis subvermispora. Enzyme and Microbial Technology journal, 45:385-390. Jyoti Verma, Sangeeta Saxena, and Shikha. 2013. 16S rDNA Based Identification of Alkaline Protease Producing Alkaliphilic Bacillus sp. Isolated From Dairy Industry Soil And Evaluation of the Enzyme Potential In Detergent Formulation. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 4(4):1339-1349. Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, pp.115-175. Li-Jung Yin, Hsin-Hung Lin and Zheng-Rong Xiao. 2010. Purification and Characterization of a cellulose from Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology, 61:466-471. Lee SM and Koo YM. 2001. Pilot-scale production of cellulose using Trichoderma reesei Rut C-30 in fed-batchmode. J. Microbiol. Biotechnol, 11: 229-233. Naoko Fujimoto, Tomoyuki Kosaka, Toshihiko Nakao and Mamoru Yamada. 2011. Bacillus licheniformis Bearing a High Cellulose-Degrading Activity, which was Isolated as a Heat-Resistant and Micro-Aerophilic Microorganism from Bovine Rumen. The Open Biotechnology Journal, 5:7-13. Naveen Shankar, Arun Panchapakesan, Suhas Bhandari and H N Ravishankar. 2014. Simultaneous cellulose hydrolysis and bio-electricity generation in a mediatorless Microbial Fuel Cell using a Bacillus flexus strain isolated from wastewater. Research in Biotechnology, 5(1): 06-12. ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Saraswati Bai, M. Ravi kumar, D.J. Mukesh kumar, P. Balashanmugam, M.D. Bala kumaran and P.T. Kalaichelvan. 2012. Cellulase Production by Bacillus subtilis isolated from Cow Dung. Archives of Applied Science Research, 4(1):269-279 Schallmey M, Singh A and Ward OP. 2004. Developments in the use of Bacillus species for industrial production. Can J Microbiol, 50(1):1-17. Serge, Pérez. and Karim Mazeau. 2005. Conformations, Structures, and Morphologies of Celluloses. Centre de Recherches sur les Macromolé cules Végétales, Grenoble, France. pp. 937-957. Ramesh Chander Kuhad, Rishi Gupta and Ajay Singh. 2011. Microbial Cellulases and Their Industrial Applications. Enzyme research, 10:4061-4096. Rani D.S,Thirumale and S.Nand K. 2004. “Production of cellulase by Clostridium papyrosolvens”. World jounal of Microbiology and Techbiology 20: 56 – 65. Rapp, P. and A. Beerman. 1991. Bacterial cellulases. In C. H. Haigler and P. J. Wermer (ed.), Biosynthesis and biodegradation of cellulose. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 535-590. Schwarz, W.H. 2001. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria, pp.634-649 Teeri, T.T. 1997. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol. 15: 160-167. Vladut-Talor, Monica. 1986. Cellulose degradation by Cellulomonas species. National libriary of Canada. pp. 15. Yamin, M.A. 1978. Axenic cultivation of the cellulolytic flagellate Trichomitopsis termopsidis (Cleveland) from the termite, Zootermopsis. J Protozool, 25: 535538. Yi, J.C, Sandra, A.B., John and T.C. Shu. 1999. Production and distribution of edoglucanase, cellobiohydrolase, and β-glucosidase components of cellulolytic system of volvariella volvacea, the edible straw mushroom, Appl. Environ. Microbiol, 65: 553-559. ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Zhao J1, Lan X, Su J, Sun L and Rahman E. 2008. Isolation and identification of an alkaliphilic Bacillus flexus XJU-3 and analysis of its alkaline amylase. Wei Sheng Wu Xue Bao, 48(6): 750-756. Trang web http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Cytophaga_Flavobacterium#Decomposition _of_Organic_Matter (Cập nhật ngày 14/08/2013) http://sl.life.ku.dk/English/research/recent_findings/Cellulose_isnt_just_cellulose.aspx (Cập nhật ngày 29/07/2012) http://www.duoclieu.org/2012/01/cellulose.html (Cập nhật ngày 14/01/2012) http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose (Cập nhật ngày 26/04/2014) http://www.nature.com/srep/2013/130107/srep01030/full/srep01030.html (Cập nhật ngày 07/01/2013) http://spacemicrobes.org/baseball_cards/bacillus-flexus/ (Cập nhật ngày 30/01/2014) ________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết kiểm tra hoạt tính cellulase 1. Kết kiểm tra hoạt tính cellulase môi trƣờng CMC Đƣờng kính (mm) Dòng Lần STT vi khuẩn Lần Lần Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn Halo lạc Halo lạc Halo lạc C.R.1 18 18 17 C.R.2 C.R.3 17 18 17 C.R.4 18 17 18 C.R.5 15 14 15 C.R.6 C.R.7 19 18 19 C.R.8 C.D.1 16 17 17 10 C.D.2 24 24 25 11 C.D.3 14 13 14 12 C.D.4 10 12 11 13 C.D.5 18 17 17 14 C.D.6 10 15 C.D.7 10 16 C.D.8 17 C.D.9 29 28 28 18 C.D.10 27 29 28 ____________________________________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ 2. Kết kiểm tra hoạt tính cellulase môi trƣờng bột giấy Đƣờng kính (mm) Dòng Lần STT vi khuẩn Lần Lần Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn Vòng Khuẩn Halo lạc Halo lạc Halo lạc C.R.1 13 13 14 C.R.3 13 13 12 C.R.4 12 13 13 C.R.5 16 16 17 C.R.7 26 25 24 C.D.1 23 23 23 C.D.2 26 24 24 C.D.6 26 26 24 C.D.9 30 31 30 10 C.D.10 36 36 35 ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Phụ lục 2. Kết phân tích thống kê 1. Kết phân tích khả thủy phân CMC One-way ANOVA: Đường kính versus Dòng vi khuẩn Source ng i Error Total DF 17 36 53 h ẩn S = 0.6236 SS 2297.481 14.000 2311.481 R-Sq = 99.39% MS 135.146 0.389 F 347.52 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.11% Grouping Information Using Tukey Method Dòng N Mean Grouping C.D.9 22.000 A C.D.10 21.667 A C.D.2 18.333 B C.R.7 13.333 C C.R.1 12.333 C D C.D.5 12.333 C D C.D.1 11.667 C D C.R.3 11.333 D E C.R.4 11.000 D E C.R.5 9.667 E C.D.3 6.667 F C.D.4 6.000 F G C.D.7 4.333 G H C.D.6 4.333 G H C.R.2 3.667 H C.R.8 1.000 I C.R.6 1.000 I C.D.8 0.000 I Means that not share a letter are significantly different. Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Le els of Dòng 2. Kết phân tích khả thủy phân bột giấy One-way ANOVA: Đƣờng kính thủy phân versus Dòng Source DF Dòng Error 20 Total 29 S = 0.7303 SS MS F P 1734.833 192.759 361.42 0.000 10.667 0.533 1745.500 R-Sq = 99.39% R-Sq(adj) = 99.11% Grouping Information Using Tukey Method Dòng N Mean Grouping C.D.10 29.667 A C.D.9 25.333 B C.D.6 20.333 C C.R.7 20.000 C D C.D.2 19.333 C D C.D.1 18.000 D ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ C.R.5 10.000 E C.R.1 8.333 E F C.R.3 7.333 F C.R.4 6.667 F Means that not share a letter are significantly different. Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Le els of Dòng ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Phụ lục 3. Kết trình tự 1. Trình tự vùng 16SrRNA Dòng C.D.9 GGCGGTGCGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTG CTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCT GTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAACATTT TCTCTTGCATAAGAGAAAATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGAT GGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAA CGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACA CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGAC GAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGT AAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACAAGAGTAACTGCTTGTACCTT GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGC GCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAG GGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCC ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCA AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAG TGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC GCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAATCAACGCGAAGAAC CTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCT TCCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCCTGTCATG AAATGTTGGGTTAAGTCCGGCAACCACCCCAACCCTTGATCTTATTTGCAC CATTAAGTTGGGCATCTAAAGGGACTCCCGGTGCAACCCGAAGAAAGAAG GGGAGAGAGGTGGGTGCACCAGGCCCCTATAACCCCGCCTCAACAGGGCG GGCATGATTTGTTGGAAGGATGGCAGACTCCAGGGCAACCAAGCACCGGG AGCCCTCCCCTTCTATTATAACTTCCATTTCCTATTTTGACGGGAACGATGA AAAAAGGAAGGCTCGCGGCCCTCGGCGGCCAAATAATTAAAAGAACGGAC CTCCGTCAACCAGGACACGAAACACCGTTAGTTAAACAGATGCAAGTTGG GAGTGAGAGGAAGCGGGGGGGGGGGCCTCTACAGGCGGAAAGAGAGTGA ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ CAAAGAGAGGGAGCAAAAGGGAAAAAGCAATAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAGAGGGGAAAGGGGAAAGGGGGAGGAAGGAGGGAAAGGAGGGCAAA GGGAGAGAAAAGGGGAAAAAAAGGAGCAAAAAAGGGGGGGGAAGGGGA GGGGGGAAAAAAGGAAAAACGGAAGGGAAGGGGGGAAAAAAAAGGGGG GAACG. 2. Trình tự vùng 16SrRNA Dòng C.D.10 GTGCGTGGCGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCT TGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC TGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT TTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCA ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGA CGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCG TAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTAC CTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGG AGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCACAAGAGGAGAGAGCCACT CCACGTGTGACGCTGAAATGTGTAGAGATGGGGAGGAAGAGGATATGTCA AAGAGGGCGCTCCCGACGCTAGCTCTCCACGATGAGCGTAACAGACGGGA GGAGCCCACAACGACAATAGTCGTTCGGTCACCTCCTGTACGCAATTCATC CGCTGCAAGGTGGAAATGCGGCTCCCCGCCTCCTGGCGGCCAGGTTCCCCA AGTTTTACAAACGACCCCCCCCGGGGTTAAAACCCGGGGGGCTTTTCCCGA ACCCAAAATAAGAAAACCCGGCCGGGGCAACCCCCTTTACCGGCCAAAAT AATTTGCTGGATTAATTTTTAGAGCCCCCCCAGGAAATTAACCCGGGGCGG GGGGGGGGGACCTTCCTTTAGGCCAATGCCTTTTTAAGGGTTAAGGACTCC CCCCCTAAGGGGGGGCCCCCAATTTAACGAAAGGGGGGGGCTTTTGGTTTT CCCTCCCCAAAACCCTAAGGGCTTTTTGGAAAATTGTGAGGGAAATTTCCC TTCCCCCACAAACAAGGGGCGGGGATTCTTTTGGTAATTTTAAAATTTTCC CCCCCTTTTCTGGGTGGGGGGAAACCCTCTCCCCGAGTGGGGCTCCCCGCC CCAGAAAGAAGAACACGGAGGGGGGAGAGATTGGGTGGTGGGGCAAAAA ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ CGTAAAGTGGGAAATTACACCCATATCCCCCCCCTTTTTTTGAAGGGGGGT CTCGGGGGCTTAAAAACCCCCCCTGTTTGGTGGGGGAAAAAAGAGGGGCA AAAAACCAACTAAAAAAAAAACCCGGGGACAAAAAAAAACAAGCGCGGC CCCGGGGGGGTGTGTGAGCTATCCGCCAACCACACTATTATTTAAAAAAA AAATGGGGGGAGTGATTGGACACCCACCCACTTAAAATTATAATCACCGG AAATTATATTGTTTATTAATTAAAGAGGGGGCTGAAAACCCCCAATTAGGA GCGTGGGCAGGGAGGTTAAAAAAGTAGACATACAAATATATCCCCCTCCC TTGCCCCGTGTCGTTTTCGCCTCTATTATATCCCCCCGGACGAGACCGGTTT GTAAACAGAAAGAATCTGGGCGTCCCCTAACTATACTAGGCCGGGTAACC CTCGCGCGCCCCCGGGGGGGGGGGTCTTTTTTGCCTGACGCCGCTTCGGTT TTGTTTCCGGCCCCTCCTCCGGGAGGGGTCGACCATGTTGGGTGGGGAGAA CAAAAACTTGCGCCCCGGGATCCCCCTCCCTGCCTGGGAAATGAGTGATAC TAATTATTTTACCCGGGGCAACGACACACCATCCTAAGCCACGACTTTAAA AAAAATTTGAGGAAAAAAACAAAAGTAAAAAAAGGAGAAGAAAAAGGGG GGGGGGAAAAAGAATCACCCCGTTTTGGGAGAAATGAGAAAAGATAATTG GGGAG. ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Phụ lục 4. Hình ảnh Biểu đồ biểu diễn đƣờng kính thủy phân dòng vi khuẩn môi trƣờng CMC Biểu đồ biểu diễn đƣờng kính thủy phân dòng vi khuẩn môi trƣờng bột giấy ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ 1500bp Kết điện di sản phầm PCR dòng C.D.9 C.D.10 (1) Thang chuẩn (2) Đối chứng dương (3) Dòng C.D.9 (4) Dòng C.D.10 (5) Đối chứng âm Mức độ tƣơng đồng dòng C.D.9 so với dòng vi khuẩn khác ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ ____________________________________________________________________________________________________ Mức độ tƣơng đồng dòng C.D.10 so với dòng vi khuẩn khác ___________________________________________________________________________ Ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... nghiên cứu xử lý cellulose bằng các phương pháp lý-hóa và sinh học cho hiệu quả tương đối tốt Trong đó, vi c ứng dụng vi sinh vật để phân hủy cellulose tỏ ra an toàn và tương đối hiệu quả, đồng thời cũng có thể tận dụng được nguồn cellulose để làm phân bón giúp giảm chi phí phân bón cho nông nghiệp Từ đó, đề tài phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt được thực... 19 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập Qua quá trình phân lập vi khuẩn từ rác và dịch rác đã thu được 18 dòng vi khuẩn trên môi trường CMC (Bảng 1) Số dòng vi khuẩn phân lập được từ rác là 8 dòng và được ký hiệu là C.R.x; số dòng vi khuẩn phân. .. và cuối cùng tạo thành CO2 và H2O 2.2.2 Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose Quá trình phân hủy kỵ khí cellulose được tiến hành qua 2 giai đoạn Giai đoạn biến cellulose thành glucose và sử dụng glucose để lên men theo kiểu lên men butyric 2.3 Giới thiệu một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy cellulose bao gồm vi khuẩn, ... phân lập được từ dịch rác là 10 dòng và được ký hiệu là C.D.y (x và y là số thứ tự của các dòng) Thời gian trung bình để nuôi cấy các dòng vi khuẩn là 48 giờ Bảng 5 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc STT Tên dòng Nguồn gốc 1 C.R.1 Rác 2 C.R.2 Rác 3 C.R.3 Rác 4 C.R.4 Rác 5 C.R.5 Rác 6 C.R.6 Rác 7 C.R.7 Rác 8 C.R.8 Rác 9 C.D.1 Dịch rác 10 C.D.2 Dịch rác 11 C.D.3 Dịch rác 12 C.D.4 Dịch rác 13... acid - Nếu âm tính (màu vàng)  Trong quá trình phát triển không tạo ra acid 3.2.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase và đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn trên môi trƣờng CMC Mục đích: đánh giá sơ bộ về khả năng phân hủy cellulose của các dòng vi khuẩn được phân lập từ đất và dịch rác thải Chọn ra một số dòng có hoạt tính enzyme cellulase cao Nguyên tắc: Khi vi khuẩn phát triển trên... lượng enzyme sinh ra là lớn nhất và có thể thủy phân mạnh mẽ các nguồn cellulose và đường kính enzyme thủy phân CMC 1% là 20mm (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010) Cellulose được phân hủy bởi các enzyme ngoại bào cellulase Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose là: Cytophaga, Cellulomonas, Clostridium, Pseudomonas (Trần Cẩm Vân, 2005) Cellulose là cơ chất khó bị phân hủy vì có cấu... Mục tiêu đề tài Phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ nguồn rác thải sinh hoạt Ngành Công nghệ Sinh học 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về cellulose và enzyme cellulase Cellulose là... gồm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Ở điều kiện hiếu khí, vi khuẩn sử dụng những enzyme ngoại bào để thủy phân cellulose Còn trong điều kiện không khí bị hạn chế, thì các loài vi khuẩn tiến hành phân hủy enzyme nhờ phức hệ trên bề mặt tế bào (Rapp et al., 1991) 2.3.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis được mô tả là vi khuẩn Gram dương, dạng que, có sinh nội bào tử và thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí... Thử hoạt tính enzyme cellulase với thuốc thử Lugol Ngành Công nghệ Sinh học 17 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh Học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2014 Trường Đại Học Cần Thơ 3.2.5 Nhận diện một số dòng vi khuẩn Dựa vào kết quả khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa và khả năng phân hủy cellulose, một vài dòng vi khuẩn. .. (+) 4.4 Hoạt tính catalase của các dòng vi khuẩn đã phân lập Hiện tượng sủi bọt khí xuất hiện khi nhỏ giọt H2O2 lên khuẩn lạc của tất cả các dòng vi khuẩn Có 6 dòng vi khuẩn sủi bọt khí nhiều và mạnh (chiếm tỷ lệ 33,33%), 8 dòng vi khuẩn sủi bọt khí tương đối nhiều (chiếm tỷ lệ 44,44%) và 4 dòng vi khuẩn sủi bọt khí chậm và ít (chiếm tỷ lệ 22,23%) Kết quả thử nghiệm cho thấy 100% các dòng vi khuẩn đều . dòng vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác thải sinh hoạt được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose từ nguồn rác thải sinh hoạt. Luận. HỌC (CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VI N THỰC HIỆN PGS.TS. NGUYỄN HỮU. (CHƢƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÕNG VI KHUẨN PHÂN HỦY CELLULOSE TỪ RÁC THẢI SINH HOẠT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VI N THỰC HIỆN PGS.TS. NGUYỄN HỮU