Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam Học viên: Nguyễn Huy Hùng Lớp: CHST _ K16 Hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh Hà Nội, 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Hà Nội, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i MỤC LỤC MỤC LỤC i Danh mục hình iv Danh mục bảng v TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3 1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên 3 1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4 1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn 5 1.1.4. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 8 1.1.5. Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 9 1.1.6. Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11 1.2. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 13 1.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13 1.2.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn 14 2.1. VẬT LIỆU 33 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật 33 2.1.2. Hóa chất 33 2.1.3. Thiết bị 33 2.1.4. Môi trƣờng 33 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1. Bảo quản giống [3]. 34 2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học 35 2.2.3. Xác định sinh khối 36 2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19]. 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii 2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6] 37 2.2.6. Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 38 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39 3.2. Xây dựng kháng sinh đồ đối với các chủng P. aeruginosa phân lập 41 3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn P. aeruginosa 42 3.3.1. Phân lập xạ khuẩn 42 3.3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P. aeruginosa 43 3.4. Nghiên cứu các đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 8.9 45 3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái 45 3.4.1. Đặc điểm hình thái 46 3.4.2. Một số đặc điểm sinh hóa của chủng 8.9 46 3.4.3. Mô tả đặc điểm phân loại 48 3.4.4. Phân loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 50 3.5. Nghiên cứu động thái lên men của chủng xạ khuẩn 8.9 52 3.6. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 54 3.6.1. Tách chiết chất kháng sinh 54 3.6.2. Độ bền nhiệt của dịch kháng thô 54 3.6.3. Ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của dich kháng sinh thô 55 3.6.4. Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 trong một số hệ dung môi 55 3.7. Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 56 PHẦN 4. KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii Tài liệu tiếng Việt 60 Tài liệu tiếng anh 60 CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN HSCC Hệ sợi cơ chất HSKS Hệ sợi khí sinh RNA Ribonucleic acide DNA Deoxyribonucleic acide RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử CKS Chất kháng sinh TKMX Trực khuẩn mủ xanh PCR Polymerase chain reaction Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv Danh mục hình Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.2. Bào tử xạ khuẩn Hình 1.3. Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào ở độ phóng đại 11000 lần trên kính hiển vi điện tử quết của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại tại bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày nuôi cấy ở 37 0 C. Hình 3.2. Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính các chủng xạ khuẩn phân lập bằng phƣơng pháp giếng thạch với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 khi nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-1 (A) và ISP-2 (B) Hình 3.5. Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ 8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và kính hiển vi điện tử quết ở độ phóng đại 7500 lần Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng có các nguồn cacbon khác nhau Hình 3.7. Sinh trƣởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trƣờng ISP-6 Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9 Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9 Hình 3.10. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1 Hình 3.11. Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v Danh mục bảng Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học truyền máu TW. Bảng 3.2. kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện Huyết học truyền máu TW Bảng 3.3. Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu Bảng 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chửng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9 Bảng 3.6. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9 Bảng 3.7. So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S. parvulus Bảng 3.8. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S. parvulus Bảng 3.9. So sánh trình tự gen 16S RNA trên ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.10. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên các môi trƣờng nghiên cứu Bảng 3.11. Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Bảng 3.12. Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 đối với vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa ở các nhiệt độ khác nhau Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của pH tới sự khuếch tán của chất kháng sinh Bảng 3.14. Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau khi gây đột biến đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 1 MỞ ĐẦU Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con ngƣời. Nó đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc, hệ vi sinh vật trên da và các môi trƣờng nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trƣờng không khí bình thƣờng, mà còn có thể sống trong môi trƣờng có ít khí ôxy, và do đó có thể cƣ trú trong nhiều môi trƣờng tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dƣỡng bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; ở động vật, nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho phép nó lây nhiễm và phá hủy các mô của ngƣời bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thƣờng là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể nhƣ phổi, đƣờng tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết ngƣời; vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể. Vi khuẩn cũng đƣợc phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông. Nƣớc ta là một nƣớc nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng phát triển. Do đó, có thể tìm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh quý, trong đó có kháng sinh kháng lại vi khuẩn Pseudomonas aruginosa gây ra các bệnh về nhiễm trùng. Để giải quyết những vấn đề này, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam ”. */ Mục tiêu của đề tài: - Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu thu thập tại một số bệnh viện. - Sàng lọc và tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ bộ sƣu tập các chủng xạ khuẩn phân lập ở Việt Nam 2 - Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn. - Cải biến đƣợc chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn - Bƣớc đầu xác định đƣợc nhóm hoạt chất chính từ chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn tác động lên vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. */ Nội dung - Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm, nƣớc thải, đất thu thập tại một số bệnh viện. - Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc với một số loại chất kháng sinh - Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính cao. - Phân loại và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn. [...]... thì khă năng sinh tổng hợp kháng sinh lại tăng Đây cũng là đặc điểm cần lƣu ý khi nghiên cứu chọn lọc các chủng có hoạt tính cao Nhƣ vậy, sự hình thành bào tử và khả năng sinh kháng sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24] Hình 1.2 Bào tử xạ khuẩn 1.1.6 Sinh tổng hợp chất kháng sinh Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này... các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn nhƣng lại thƣờng kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm nhƣ các polyen 4 - Xạ khuẩn chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống nhƣ phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa xenluloza - Tƣơng tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của môi trƣờng, đặc điểm này không có ở nấm - Các đặc điểm. .. chất kháng trao đổi có giá trị trong y học vì chúng chỉ có tác dụng ức chế lên tế bào vi sinh vật mà không có tác dụng lên tế bào ngƣời 1.3.4 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60-70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này Trong số 9000 chất kháng sinh đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces... hoá của xạ khuẩn [17] 11 Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thƣờng đƣợc hình thành ở cuối pha sinh trƣởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lƣu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn [12] Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai pha: pha sinh trƣởng... sản xuất ở quy mô thƣơng mại, có ý nghĩa lớn trong y học và mang lại nhiều lợi nhuận 1.3.5 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh. Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới, có hơn 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ 24 khuẩn đều có phổ kháng rộng... trong nhóm xạ khuẩn, với trên 500 loài đã đƣợc miêu tả Chi này có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh, một số kháng sinh rất quan trọng là streptomycin do S griseus sinh ra Khả năng sinh kháng sinh là kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hoá của xạ khuẩn Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thƣờng đƣợc hình thành ở cuối pha sinh trƣởng, trong pha... cùng lúc có thể tổng hợp đƣợc oxytetracylin và rimicidin Ngày nay số lƣợng chất kháng sinh đƣợc sản xuất từ xạ khuẩn tăng lên đáng kể, rất nhiều trong số đó đã đƣợc sản xuất ở quy mô thƣơng mại, có ý nghĩa lớn trong y học và mang lại nhiều lợi nhuận 1.2 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 1.2.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Nhu cầu về các chất kháng sinh sử dụng... [3] Do có các loại enzim này nên chúng cũng có khả năng phân giải các hợp chất bền vững nhƣ kitin, xenluloza, lignin… Một đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh 60-70% xạ khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn [17] Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng... chất kháng sinh đã đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra Chi Streptomyces là chi quan trọng nhất trong nhóm xạ khuẩn, với trên 500 loài đã đƣợc miêu tả Chi này có nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh, một trong số các kháng sinh rất quan trọng là Streptomycin do S griseus sinh ra Khả năng sinh chất kháng sinh là kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc... pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đó là điểm cần lƣu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai pha: pha sinh trƣởng (trophophase) khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh chất đồng nhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp . “ Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Vi t Nam ”. */ Mục tiêu của đề tài: - Phân lập đƣợc vi. 60420103 Đề tài: Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Vi t Nam Học vi n: Nguyễn Huy Hùng. sƣu tập các chủng xạ khuẩn phân lập ở Vi t Nam 2 - Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn. - Cải biến đƣợc chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng