Để định tính chất kháng sinh trong dịch nhả hấp phụ đã cô đặc ta thực hiện phƣơng pháp sắc ký giấy. Sau quá trình chạy, sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng vi sinh vật kiểm định. Tiến hành: Chấm dịch kháng sinh thô lên giấy sắc ký Whatman N 1 loại chạy chậm với kích thƣớc 1x25cm. Có thể sử dụng hệ dung môi sau để chạy sắc ký: (n-butanol : axit acetic : nƣớc = 4 : 1 : 5)
Sau khi chạy sắc ký, băng giấy đƣợc làm khô tự nhiên và hiện bằng phƣơng
pháp vi sinh vật so với kháng sinh chuẩn, vi sinh vật kiểm định là Pseudomonas
aruginosa. Rf là tỷ lệ khoảng cách từ điểm xuất phát đến chất kháng sinh chạy
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Tiến hành thu thập các mẫu khác nhau trong đó chủ yếu là các mẫu nƣớc và bụi bẩn thu thập từ các khu vực thuộc 08 khoa lâm sàng của bệnh viện huyết học truyền máu Trung Ƣơng và hành lang phía trƣớc các phòng trên. Mẫu sau khi thu thập đƣợc pha loãng và trải đều trên môi trƣờng môi trƣờng đặc hiệu cho vi khuẩn
Gram âm là KIA (Kligler Iron Agar), sau đó nuôi ở 370C trong vòng 02 ngày. Lựa
chọn các khuẩn lạc đặc trƣng cho vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa làm tiêu bản nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi. Một số chủng vi khuẩn có khả năng là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa đƣợc chọn lựa và tiến hành thử nghiệm một số phản ứng sinh lý, sinh hóa.Từ các mẫu thu thập đƣợc đã xác định đƣợc 02 chủng có khả năng cao là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, các chủng này phân lập từ mẫu HL IH4 và HL H6. Kết quả đƣợc thể hiện trong Hình 3.1và Bảng 3.1.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào ở độ phóng đại 11000 lần trên kính hiển vi điện tử quết của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại tại bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày nuôi cấy ở 370C.
Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học truyền máu TW.
Ký hiệu mẫu
Khu vực PL Kết quả Ký hiệu
mẫu Khu vực PL Kết quả 1 Khoa Hemophilia - 13 HLKH - 2 Khoa Thalassemia - 14 HLKT - 3 Khoa Bệnh máu tổng hợp I H4 - 15 HL IH4 + 4 Khoa Bệnh máu tổng hợp II H5 - 16 HL IIH5 - 5 Khoa Bệnh máu trẻ em H6 - 17 HL H6 + 6 Khoa Điều trị hóa chất H7 - 18 HLH 6 - 7 Khoa Ghép tế bào gốc - 19 HLTBG - 8 Khoa Cấp cứu - 20 HLCC -
Từ 20 mẫu thu thập đƣợc tại 20 vị trí khác nhau ở bệnh viện huyết học truyền máu
Trung Ƣơng chúng tôi đã xác định đƣợc 02 mẫu có mặt vi khuẩn P. aeruginosa.
Nhƣ vậy tần suất xuất hiện vi khuẩn này tại bệnh viện là khá thấp nếu so sánh với một số kết quả trƣớc đây tại một số bệnh viện khác. Điều này cho thấy vấn đề kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện huyết học truyền máu Trung Ƣơng trong thời gian qua là rất tốt, hiện tại chƣa thấy xuất hiện sự có mặt của vi khuẩn mủ xanh trong các khoa lâm sàng này tạo nên sự an toàn của bệnh nhân khi đƣợc điều trị tại
đây. Các khu vực có sự hiện diện của vi khuẩn P. aeruginosa là hành lang thuộc khu vực khoa bệnh máu tổng hợp I H4 và hành lang khoa bệnh máu trẻ em H6. Mặc dù tất cả các khu vực trên đều đƣợc thực hiện công tác kiểm soát nhiễm khuẩn định kỳ nhƣng vẫn có sự xuất hiện của vi khuẩn này, lý do đây là khu vực bệnh nhân từ môi trƣờng bên ngoài bệnh viện đến và qua lại mang theo vi khuẩn.
Để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn phân lập đƣợc là P. aeruginosa
chúng tôi đã phân tích trình tự 16S rADN của 02 chủng này, kết quả là cả 02 chủng
đều có trình tự tƣơng đồng 100% với trình tự gen của vi khuẩn P. aeruginosa đã
công bố trên ngân hàng gen quốc tế (Kết quả không đƣa ra trong nội dung luận văn này). Các chủng phân lập đƣợc sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Xây dựng kháng sinh đồ đối với các chủng P. aeruginosa phân lập
Vi khuẩn P. aeruginosa là một trong những loại có khả năng kháng thuốc kháng sinh khá mạnh. Để tìm hiều khả năng kháng thuốc kháng sinh cho các chủng vi khuẩn phân lập, chúng tôi đã dựng kháng sinh đồ. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện trên máy Vitek2 compact với chủng vi khuẩn đã phân lập và so sánh với chủng P. aeruginosa đối chứng kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện Huyết học truyền máu TW
Grouped by antibiotic family
P. aeruginosa PL1 P. aeruginosa Cat. Amikacin ≤2 ≤2 S Gentamicin 2 2 S Tobramycin - 16 R Cefepime 2 2 S Ceftazidime 4 4 S Imipenem ≥16 ≥16 R Meropenem 4 4 S Piperracillin ≤4 ≤4 S Piperracillin/Tazobactam 8 16 R
Ticarcillin/Clavulanic Acid 16 16 R Colistin 2 2 S Ciprofloxacin ≤0.25 ≤2 S Pefloxacin 1 1 S Minocycline ≥16 ≥16 R Trimethoprim/Sulfamethoxazole 160 160 R
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng P. aeruginosa phân lập tại Bênh viện Huyết học truyền máu TW cũng nhƣ chủng P. aeruginosa đối chứng có chung phổ mẫn cảm với nhiều loại thuốc kháng sinh. Cả 02 chủng đều có thể bị diệt mạnh
nhất với kháng sinh Trimrthoprim/sulfamethoxazole. Tuy nhiên, chủng P.
aeruginosa phân lập đƣợc ghi nhận không mẫn cảm với kháng sinh Tobramycin, trong khi đó chủng đối chứng lại khá mẫn cảm với kháng sinh này. Kết quả này cho thấy chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Huyết học truyền máu TW đã có hiện tƣợng kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy, cần tiến hành sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng diệt chủng P. aeruginosa đã kháng thuốc trên.
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
P. aeruginosa
3.3.1. Phân lập xạ khuẩn
Từ 35 mẫu đất đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau đã phân lập và thuần khiết đƣợc 141 chủng xạ khuẩn. Các chủng chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc quan sát chia thành các nhóm màu sắc khác nhau theo bảng màu của Tresner và Backus, 1976. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu
Trắng Đen Cam Nâu Hồng Vàng Xám TS
91 (64,54%) 4 (2,84%) 6 (4,26%) 10 (7,09%) 19 (13,48%) 9 (6,38%) 2 (1,41%) 141 (100%)
Thông qua bảng 3.3 ta thấy các chủng phân lập rất đa dạng về màu sắc. Trong số các chủng đƣợc phân lập thì số lƣợng các chủng có màu trắng có tần suất
bắt gặp lớn hơn với các màu khác. Màu trắng có 91 chủng chiếm tỷ lệ 64,54% trên tổng số 141 chủng đƣợc phân lập. Theo bảng trên cũng cho ta thấy các chủng có màu xám rất hiếm gặp, nó chỉ chiếm tỷ lệ 1,41% so với tổng số chủng đƣợc phân lập. Nhƣ vậy có thể thấy rằng, nhóm xạ khuẩn màu trắng là rất phổ biến và các chủng thuộc các màu khác nhau nhƣ đen, cam, nâu, hồng, vàng, xám…thì có tần suất bắt gặp thấp hoặc trung bình.
3.3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P. aeruginosa aeruginosa
Để tuyển chọn chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khối thạch với vi sinh vật kiểm định là các chủng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa đã phân lập. Kết quả thu đƣợc sau khi thử hoạt tính
kháng sinh các chủng phân lập đƣợc cho thấy có 6 chủng xạ khuẩn trong tổng số 141 chủng, chiếm tỷ lệ 5% có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa.
Hình 3.2. Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
của các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch
Các chủng này tiếp tục đƣợc nuôi trong bình tam giác 500 ml chứa 100 ml
môi trƣờng Gauze-1 dịch thể, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày ở nhiệt độ 28-30o
và sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trong thạch (sử dụng phƣơng pháp đục lỗ) để tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của dịch lên men với vi sinh vật kiểm định.
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh cho thấy 06 chủng thử nghiệm đều có hoạt tính với Pseudomonas aeruginosa, điều này cho thấy rằng các chủng xạ khuẩn
phân lập đƣợc đều sinh hợp chất kháng khuẩn ngoại bào. Trong số này chủng 8.9 thể hiện hoạt tính lớn nhất với đƣờng kính vòng vô khuẩn đo đƣợc lần lƣợt là 20. Kết quả thử nghiệm đƣợc thể hiện qua hình 3.3 và bảng 3.4.
Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính các chủng xạ khuẩn phân lập bằng
phƣơng pháp giếng thạch với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Chú thích: HTKS: hoạt tính kháng sinh D : đƣờng kính vòng vô khuẩn
d : đƣờng kính giếng thạch
Từ kết quả trên, chúng tôi chọn chủng 8.9 để tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chủng 31.1 8.12 25.2 8.9 27.5 26.2
3.4. Nghiên cứu các đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 8.9
3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái
Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên các môi trƣờng Gauze-1, ISP-1, ISP-2, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ISP-3, ISP-4 đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trong 5 ngày sau đó quan sát khả năng
sinh trƣởng, màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố tan. Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử dƣới kính hiển vi quang học, hình dạng và bề mặt dƣới kính hiển vi điện tử. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.4 và bảng 3.5.
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 khi nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-1 (A) và ISP-2 (B)
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9 Môi trƣờng Khả năng sinh trƣởng Màu sắc KTCC Màu sắc KTKS Sắc tố Gauze-1 +++ Trắng Xám Vàng ISP-1 ++ Trắng Xám - ISP-2 +++ Trắng Trắng Vàng đậm ISP-3 + Trắng Trắng - ÍP-4 + Trắng Trắng Hơi vàng
3.4.1. Đặc điểm hình thái
Một trong những đặc điểm rât quan trong trong việc định danh xạ khuẩn là dựa vào đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử. Chính vì lý do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm này cho chủng 8.9. Chủng xạ khuẩn
đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause I có đặt lamen nghiêng 450
trên bề mặt thạch, nuôi ở 28 – 300C. Sau mỗi 12 tiếng nuôi cấy, lấy lamen ra soi trên kính hiển vi quang học để quan sát, khi nào thấy bào tử đƣợc sinh ra thì dừng lại. Hình thái cuống sinh bào tử đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học, bề mặt bào tử đƣợc quan sát nhờ kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Hình 3.5. Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ 8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A)
và kính hiển vi điện tử quết ở độ phóng đại 7500 lần 3.4.2. Một số đặc điểm sinh hóa của chủng 8.9
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các bon của chủng xạ khuẩn 8.9, chúng tôi đã nuôi cấy chủng này trên môi trƣờng có bổ sung các nguồn đƣờng khác nhau và kiểm tra khả năng sinh trƣởng sau 05 ngày nuôi cây. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9
Chú thích: +: sinh trƣởng yếu
++: sinh trƣởng trung bình +++: sinh trƣởng tốt
Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng có các nguồn cacbon khác nhau
Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 8.9 sinh trƣởng và phát triển trên các môi trƣờng với các nguồn
STT Nguồn cacbon Sinh trƣởng
1 Saccaroza +++ 2 Xenluloza + 3 Glucoza ++ 4 Lactoza +++ 5 Manitol + 6 Fructoza +++ 7 Đối chứng -
cacbon là saccaroza, CMC, glucoza, lactoza, manitol, fructoza. Trên môi trƣờng có nguồn cacbon là glucoza thì chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển chậm.
Khả năng sinh melanin
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-6 ở nhiệt độ 28-30o
C và quan sát màu của môi trƣờng sau 24h đến 14 ngày. Trên môi trƣờng ISP-6, chủng xạ khuẩn 8.9 không có khả năng sinh sắc tố để làm màu của môi trƣờng nuôi cấy chuyển dần sang màu đen. Điều đó cho thấy rằng chủng xạ khuẩn 8.9 không có khả năng sinh tổng hợp melanin
Hình 3.7. Sinh trƣởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trƣờng ISP-6
Khả năng chịu muối
Chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-4 đƣợc bổ sung NaCl ở các nồng độ muối khác nhau 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Kết quả thí nghiệm cho ta thấy đƣợc chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển rất tốt trên môi trƣờng có các nồng độ khác nhau.
3.4.3. Mô tả đặc điểm phân loại (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo khóa phân loại của ISP (1966), trên bề mặt môi trƣờng Gauze-1, ISP-1, SP-2, ISP-3, HSKS của chủng xạ khuẩn 8.9 có đặc điểm tƣờng đồng với chủng S.
parvulus đƣợc mô tả bởi Waskman và Grygory năm 1954 và đƣợc xếp vào nhóm
parvulus bởi Waskman và Grygory năm 1954 cho thấy chủng xạ khuẩn 8.9 và
chủng S. parvulus có đặc điểm rất giống nhau nhƣng cũng có một số điểm khác
biệt về khả năng sinh sắc tố tan và khả năng sử dụng nguồn đƣờng. Kết quả so sánh đặc điểm phân loại chủng 8.9 và chủng S. parvulus đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và 3.6.
Bảng 3.7. So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S. parvulus
Môi trƣờng Đặc điểm Chủng
8.9 S. parvulus
Gauze-1 HSCC _ _
HSKS Xám Xám
CSBT Hơi xoắn Hơi xoắn
BMBT Nhẵn Nhẵn
Sắc tố tan _ _
Glyxerin-nitrat HSCC _ _
HSKS _ _
Sắc tố tan Hơi vàng Không màu
ISP-3 HSCC _ _
HSKS _ _
Sắc tố tan Vàng đậm Vàng
ISP-6 Sinh melanin Không Không
Bảng 3.8. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S. parvulus
Nguồn cacbon NĐ 8.9 S. parvulus
Saccaroza + + Xenluloza + + Glucoza + + Lactoza + + Manitol + + Fructoza + +
Từ các kết quả nêu trên, bƣớc đầu chúng tôi xác định chủng xạ khuẩn 8.9 phân lập đƣợc là loài Streptomyces parvulus.
3.4.4. Phân loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
Để phân loaị chính xác hơn chúng tôi tiến hành phân loại chủng 8.9 bằng phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế.
DNA tổng số của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tách chiết theo kit của hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến đƣợc trình bày ở mục 2.2.7.1. DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn để xác định trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492 khuếch đại đoạn gene ~ 1500bp. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.8.
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9
Giếng 1: Chủng xạ khuẩn NĐ 8.9; Giếng 2: marker (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ hình 3.8 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu đƣợc một băng có kích thƣớc ~1500 bp.
Gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tinh sạch và giải trình tự từ sản phẩm PCR với cặp mồi (27F; 1492R) trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng so sánh với các chuỗi 16S rRNA đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene quốc tế bằng chƣơng trình BLAST. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
~1500 bp
Bảng 3.9. So sánh trình tự gen 16S RNA trên ngân hang gen quốc tế Description Max score Total score Query cover E
value Ident Accession
Streptomyces parvulus strain HY026 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2215 2215 99% 0.0 98% KJ200636.1
Streptomyces bellus strain BLH-12 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% KJ020687.1
Streptomyces viridis strain 1032 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ607415.1