Một trong những đặc điểm rât quan trong trong việc định danh xạ khuẩn là dựa vào đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử. Chính vì lý do đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm này cho chủng 8.9. Chủng xạ khuẩn
đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gause I có đặt lamen nghiêng 450
trên bề mặt thạch, nuôi ở 28 – 300C. Sau mỗi 12 tiếng nuôi cấy, lấy lamen ra soi trên kính hiển vi quang học để quan sát, khi nào thấy bào tử đƣợc sinh ra thì dừng lại. Hình thái cuống sinh bào tử đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học, bề mặt bào tử đƣợc quan sát nhờ kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Hình 3.5. Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ 8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A)
và kính hiển vi điện tử quết ở độ phóng đại 7500 lần 3.4.2. Một số đặc điểm sinh hóa của chủng 8.9
Khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các bon của chủng xạ khuẩn 8.9, chúng tôi đã nuôi cấy chủng này trên môi trƣờng có bổ sung các nguồn đƣờng khác nhau và kiểm tra khả năng sinh trƣởng sau 05 ngày nuôi cây. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9
Chú thích: +: sinh trƣởng yếu
++: sinh trƣởng trung bình +++: sinh trƣởng tốt
Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng có các nguồn cacbon khác nhau
Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 8.9 sinh trƣởng và phát triển trên các môi trƣờng với các nguồn
STT Nguồn cacbon Sinh trƣởng
1 Saccaroza +++ 2 Xenluloza + 3 Glucoza ++ 4 Lactoza +++ 5 Manitol + 6 Fructoza +++ 7 Đối chứng -
cacbon là saccaroza, CMC, glucoza, lactoza, manitol, fructoza. Trên môi trƣờng có nguồn cacbon là glucoza thì chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển chậm.
Khả năng sinh melanin
Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-6 ở nhiệt độ 28-30o
C và quan sát màu của môi trƣờng sau 24h đến 14 ngày. Trên môi trƣờng ISP-6, chủng xạ khuẩn 8.9 không có khả năng sinh sắc tố để làm màu của môi trƣờng nuôi cấy chuyển dần sang màu đen. Điều đó cho thấy rằng chủng xạ khuẩn 8.9 không có khả năng sinh tổng hợp melanin
Hình 3.7. Sinh trƣởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trƣờng ISP-6
Khả năng chịu muối
Chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-4 đƣợc bổ sung NaCl ở các nồng độ muối khác nhau 1%, 3%, 5%, 7%, 9%. Kết quả thí nghiệm cho ta thấy đƣợc chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển rất tốt trên môi trƣờng có các nồng độ khác nhau.
3.4.3. Mô tả đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của ISP (1966), trên bề mặt môi trƣờng Gauze-1, ISP-1, SP-2, ISP-3, HSKS của chủng xạ khuẩn 8.9 có đặc điểm tƣờng đồng với chủng S.
parvulus đƣợc mô tả bởi Waskman và Grygory năm 1954 và đƣợc xếp vào nhóm
parvulus bởi Waskman và Grygory năm 1954 cho thấy chủng xạ khuẩn 8.9 và
chủng S. parvulus có đặc điểm rất giống nhau nhƣng cũng có một số điểm khác
biệt về khả năng sinh sắc tố tan và khả năng sử dụng nguồn đƣờng. Kết quả so sánh đặc điểm phân loại chủng 8.9 và chủng S. parvulus đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và 3.6.
Bảng 3.7. So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S. parvulus
Môi trƣờng Đặc điểm Chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
8.9 S. parvulus
Gauze-1 HSCC _ _
HSKS Xám Xám
CSBT Hơi xoắn Hơi xoắn
BMBT Nhẵn Nhẵn
Sắc tố tan _ _
Glyxerin-nitrat HSCC _ _
HSKS _ _
Sắc tố tan Hơi vàng Không màu
ISP-3 HSCC _ _
HSKS _ _
Sắc tố tan Vàng đậm Vàng
ISP-6 Sinh melanin Không Không
Bảng 3.8. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S. parvulus
Nguồn cacbon NĐ 8.9 S. parvulus
Saccaroza + + Xenluloza + + Glucoza + + Lactoza + + Manitol + + Fructoza + +
Từ các kết quả nêu trên, bƣớc đầu chúng tôi xác định chủng xạ khuẩn 8.9 phân lập đƣợc là loài Streptomyces parvulus.
3.4.4. Phân loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
Để phân loaị chính xác hơn chúng tôi tiến hành phân loại chủng 8.9 bằng phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế.
DNA tổng số của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tách chiết theo kit của hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến đƣợc trình bày ở mục 2.2.7.1. DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn để xác định trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492 khuếch đại đoạn gene ~ 1500bp. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.8.
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9
Giếng 1: Chủng xạ khuẩn NĐ 8.9; Giếng 2: marker
Từ hình 3.8 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu đƣợc một băng có kích thƣớc ~1500 bp.
Gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tinh sạch và giải trình tự từ sản phẩm PCR với cặp mồi (27F; 1492R) trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng so sánh với các chuỗi 16S rRNA đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene quốc tế bằng chƣơng trình BLAST. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
~1500 bp
Bảng 3.9. So sánh trình tự gen 16S RNA trên ngân hang gen quốc tế Description Max score Total score Query cover E
value Ident Accession
Streptomyces parvulus strain HY026 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2215 2215 99% 0.0 98% KJ200636.1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Streptomyces bellus strain BLH-12 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% KJ020687.1
Streptomyces viridis strain 1032 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ607415.1
Streptomyces coeruleorubidus strain BTSS- 301 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2209 2209 99% 0.0 98% HQ711986.1
Streptomyces coeruleorubidus strain HBUM174910 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2209 2209 99% 0.0 98% EU841625.1
Streptomyces viridis gene for 16S rRNA,
partial sequence, strain: NBRC 13373 2209 2209 99% 0.0 98% AB184361.2
Streptomyces spinoverrucosus strain 174464
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU593714.1 Streptomyces spinoverrucosus strain 173372
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU570683.1 Streptomyces lomondensis strain S015 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% KF144610.1
Streptomyces parvulus strain MARS-17 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% GQ451836.1
Streptomyces parvulus strain S10 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2202 2202 99% 0.0 98% JX007952.1
Streptomyces sp. R8-11 gene for 16S
ribosomal RNA, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% AB841019.1
Streptomyces coeruleorubidus strain KSRO2
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% JF682781.1 Streptomyces sp. ZG637 16S ribosomal RNA
Sau khi đã so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế chúng tôi tiến hành dựng cây phát sinh chủng loại để xác định loài cho chủng 8.9 (hình 3.9).
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9
Từ cây phát sinh chủng loại chủng tôi nhận thấy chủng 8.9 có họ hàng gần gũi nhất với chủng S. parvulus có mã số KF144610.1 trên ngân hang gen quốc tế.
Từ đó, có thể khảng định chủng 8.9 là một chủng thuộc S. parvulus và đƣợc đặt
tên là S. parvulus 8.9.
3.5. Nghiên cứu động thái lên men của chủng xạ khuẩn 8.9
Chủng 8.9 đƣợc nuôi lắc trên các môi trƣờng Gauze-1, ISP-4, A-4H. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh các dịch lên men sau khoảng 5-7 ngày nuôi lắc đối với ba môi trƣờng cho thấy đƣợc hoạt tính mạnh nhất là ở môi trƣờng Gauze-1. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.10
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên các môi trƣờng nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Môi trƣờng Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm
Gauze-1 13
A-4H 11
Các thông số nghiên cứu là sự biến đổi pH, sự tăng sinh khối trong quá trình lên men, hoạt tính kháng sinh của dịch lên men. Sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h,144h nuôi cấy dịch sẽ đƣợc đem đi xác định các thông số. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.11
Bảng 3.11. Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Thông số Thời gian lên men (giờ)
0 24 48 72 96 120
pH 0 6,8 6,5 7 7,2 5,5
HTKS(mm) 0 0 0 11 11 13
SK (g) 0,005 0,07 0,11 0,23 0,23 0.325
Hình 3.10. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1
Kết quả trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.10 cho thấy pH dịch lên dần sau 48 giờ rồi lại tăng lên sau 96 giờ len men. Tiếp tục rồi lại giảm cho đến khi kết thúc quá trình lên men.
Khối lƣợng sinh khối của chủng 8.9 tích lũy cao nhất tại thời điểm 120h nuôi cấy và bắt đầu giảm dần sau đó.
3.6. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 3.6.1. Tách chiết chất kháng sinh 3.6.1. Tách chiết chất kháng sinh
Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn 8.9 sau khoảng 5-7 ngày đƣợc lọc qua giấy Phần dịch lọc đƣợc điều chỉnh về pH=7 và đƣợc chiết bằng n-butanol cho
bay hơi butanol ở nhiệt độ 40oC. Phần sinh khối chiết bằng aceton, lọc và cho bay
hơi trong chân không.
Chất kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 có màu vàng nghệ.
3.6.2. Độ bền nhiệt của dịch kháng thô
Để xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 sinh ra, xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau: 40o
C, 60oC, 80oC,
100oC trong khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 60 phút. Sau khi đã xử lý
nhiệt, dịch kháng sinh thô đƣợc đem đi thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định
Bảng 3.12. Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 đối với vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ Thời gian 40oC 60oC 80oC 100oC 10 phút 13 13 13 11 20 phút 13 13 13 11 30 phút 13 13 13 11 60 phút 13 13 13 11
Dựa vào bảng 3.12 cho thấy hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn NĐ8.9 ở cùng một nhiệt độ xử lý, hoạt tính kháng sinh không bị ảnh hƣởng bởi thời gian. Tuy nhiên, ở các nhiệt độ khác nhau thì hoạt tính kháng sinh giảm khi nhiệt độ tăng lên, đặc biệt là ở nhiệt độ 100o
C. cònở các nhiệt độ còn lại thì hoạt tính kháng sinh không đổi hoặc thay đổi không đáng kể.
Qua đó cho thấy dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 bền với nhiệt độ nhƣng hoạt tính kháng sinh giảm so với dich kháng thô ban đầu.
3.6.3. Ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của dich kháng sinh thô
Để xác định ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của kháng sinh, chủng 8.9 đƣợc tiến hành thử hoạt tính trên môi trƣờng pH Gradient gồm 3 lớp. Lớp dƣới cùng chứa pH 5,6 và để nghiêng. Lớp thứ 2 là pH 8 và lớp trên cùng là môi trƣờng
đặc hiệu của vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aeruginosa . Sau 24h đo đƣờng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
kính vòng vô khuẩn, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của pH tới sự khuếch tán của chất kháng sinh pH Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm
5,6 15
7 13
8 13
Qua bảng trên cho thấy chất kháng sinh khuếch tán tốt nhất ở pH=5,6 và pH=7,8 thì độ khuếch tán kém hơn.
3.6.4. Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 trong một số hệ dung môi một số hệ dung môi
Giá trị sắc Rf của chất kháng sinh thô đƣợc xác định bằng cách chấm dịch lên giấy sắc kí, chạy sắc kí trên một số hệ dung môi. Sau đó đƣợc hiện hình bằng phƣơng pháp hiện hình sinh học với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa và kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi
Hệ dung môi Rf
Butanol bão hòa nƣớc 0,73
Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) 0,625
Butanol bão hòa pyridine 2% 0,76
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9
Chú thích: 1. Butanol bão hòa nƣớc
2. Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1)
3. Butanol bão hòa dung dịch pyridine 2% 4. Nƣớc bão hòa butanol
Giá trị Rf của kháng sinh này đƣợc sử dụng để đánh giá độ hòa tan của kháng sinh trong các hệ dung môi khác nhau, nhằm mục đích lựa chọn hệ dung môi tốt nhất cho quá trình tách chiết chất kháng sinh phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.7. Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9
Nhằm tạo ra chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hoạt chất kháng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa cao hơn chủng đã phân lập để phục vụ sản xuất, chúng
tôi đã nghiên cứu để cải biến chủng này. Phƣơng pháp sử sụng ở đây là gây đột biến bằng NTG và tia UV. Chủng 8.9 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lên men lỏng trong bình tam giác. Sau khoảng 48h, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000 vòng/phút) thu tế bào và loại dịch nổi, sau đó bổ sung thêm 0.5 ml NTG, đổ ra đĩa petri. Bật đèn UV với khoảng cách từ nguồn tới đĩa là 30cm. Sau khoảng thời gian khác nhau từ 30, 60, 90, 120 phút lần lƣợt hút ra 100 µl. Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào và loại hóa chất. Rửa tế bào 2 lần bằng nƣớc cất vô trùng, bổ sung thêm 100 µl nƣớc muối sinh lý và cấy trang trên
đĩa petri. Sau 03ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành thử hoạt tính kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. Kết quả thu
đƣợc nhƣ sau;
Từ kết quả trên chúng ta thấy hầu hết các chủng đƣợc lựa chọn sau khi gây đột biến có hoạt tính đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gần giống với
chủng gốc (vòng vô khuẩn có đƣờng kính là 18±2 mm). Tuy nhiên có 02 chủng thể hiện sự kháng cao hơn hẳn vơi đƣờng kính vòng vô khuẩn lần lƣợt là 24 và 28 mm, các chủng này thu đƣợc khi xử lý đột biến ở 120 và 90 phút. Do thời gian có hạn nên chúng tôi không lựa chọn nhiều chủng đƣợc xủ lý đột biến hơn để thử hoạt tính, do vậy không thể đánh giá đƣợc hiệu suất gây đột biến. Hai chủng có hoạt tính cao này đƣợc bảo quản để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau khi gây đột biến đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Thời gian xử lý đột biến (phút) Khuẩn lạc số Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) 0 8.9 18 30 1 18 2 19 3 17 4 17 5 19 60 1 19 2 20 3 18 4 17 5 19 90 1 17 2 20 3 28 4 20 5 19
120 1 24 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 18
3 19
4 19
PHẦN 4. KẾT LUẬN
1. Chúng tôi đã phân lập đƣợc 141 chủng xạ khuẩn thƣợc các nhóm màu khác nhau. Trong đó, nhóm xạ khuẩn màu trắng (Albus) chiếm tỷ lệ (64,54%), còn các nhóm màu khác có tần xuất ít hơn.
2. Với phƣơng pháp khuếch tán trên thạch chúng tôi đã xác định đƣợc 06 chủng phân lập có hoạt tính đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
3. Chủng xạ khuẩn 8.9 có hoạt tính mạnh nhất và đƣợc nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại trên các môi trƣờng phân loại theo khóa phân loại ISP năm 1966. Kết quả thu đƣợc là chủng đƣợc xác định là giống với loài S.parvulus.
4. Đoạn gene 16S rDNA của chủng 8.9 đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1492R. đƣợc giải trình tự, so sánh trên ngân hàng gen quốc tế và dựng cây phân loại có họ hàng gần gũi nhất với chủng S.parvulus. Đƣợc đặt tên là S.parvulus 8.9. 5. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1 sinh khối thích lũy cực đại ở