2.2.1. Bảo quản giống [3].
Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 4o
hoạt hoá bằng cách nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28oC, kéo dài 5-7
ngày. Để bảo quản chủng lâu dài, giữ giống trong glyxerin ở -20 o
C.
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn theo các phƣơng pháp của chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế (ISP - International Streptomyces Project) và
Bergey’s Manual of Determintative Bacteriology, Vol. 4, 1989.
2.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Chủng xạ khuẩn XK đƣợc nuôi trên MT Gauze 1 có cắm lamen nghiêng trên
mặt MT, ở nhiệt độ 28-30oC. Sau 7-14 ngày, quan sát khuẩn ty và hình dạng cuống
sinh bào tử trên lamen bằng kính hiển vi quang học.
Bề mặt bào tử: Dùng lƣới đồng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, quan sát và chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử (tại Viện 69, Bộ Quốc phòng).
2.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Chủng xạ khuẩn TB5.4 đƣợc nuôi trên các MT Gauze 1, Gauze 2, 48, ISP1,
ISP2, ISP4, ISP6, ISP8, ISP9 ở 28-30oC. Sau 7, 14 và 21 ngày, quan sát khuẩn lạc,
màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra MT theo phƣơng pháp của Tresner và Backus, 1971.
Sự hình thành sắc tố melanin: Xạ khuẩn đƣợc nuôi trên MT ISP-4 ở 28oC, quan sát màu của MT sau 7 và 14 ngày.
2.2.2.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
- Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp: Chủng XK đƣợc nuôi trên MT ISP1 ở
nhiệt độ 18 - 40oC. Khả năng sinh trƣởng đƣợc xác định sau 7 ngày nuôi cấy.
- Xác định pH nuôi cấy thích hợp: Chủng XK đƣợc nuôi trong MT ISP4 đã chỉnh pH từ 3-10, ở nhiệt độ 28-30oC, sau 7 ngày quan sát và xác định sự sinh trƣởng.
- Khả năng sinh enzym ngoại bào: Chủng XK đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28oC trong MT ISP4 có các nguồn cơ chất khác nhau nhƣ sữa đã loại chất béo, gelatin, tinh bột tan, cazein, CMC. Sau 7, 14, 21 ngày, xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phƣơng pháp khuếch tán trên thạch.
- Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi ở nhiệt độ
28oC trên MT ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đƣờng: Glucoza, mannitol, maltoza,
inositol, fructoza, lactoza, sacaroza... Sau 7 và 14 ngày quan sát sự sinh trƣởng, với MT có nguồn cacbon là glucoza (đối chứng dƣơng) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm).
- Xác định khả năng chịu muối (NaCl): Nuôi chủng XK trên MT ISP1 bổ sung NaCl với nồng độ 1-10%, ở nhiệt độ 28oC, sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trƣởng.
2.2.3. Xác định sinh khối
MT nuôi xạ khuẩn sau khi thu hồi đƣợc lọc bằng giấy lọc, rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng. Lƣợng sinh khối có trên giấy lọc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp
sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khi trọng lƣợng không đổi (sấy và cân giấy lọc trƣớc
và sau khi lọc).
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19].
Phương pháp cục thạch
Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi trên MT thạch trong đĩa Petri ở 28oC. Sau 5 ngày
dùng khoan nút chai đục các thỏi thạch chuyển sang đĩa khác có MT MPA thạch
đã cấy vi sinh vật kiểm định. Đặt đĩa Petri ở 4o
C trong thời gian 6 giờ cho chất
kháng sinh khuếch tán vào MT, sau đó đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ để vi
sinh vật kiểm định phát triển. Hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) xung quanh cục thạch, vòng càng lớn thì hoạt tính kháng sinh càng mạnh.
Phƣơng pháp đục lỗ đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh có chứa trong MT lỏng. Dùng thiết bị đục lỗ, đục trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, nhỏ vào lỗ dung dịch cần thử. Các bƣớc tiếp theo làm nhƣ phƣơng pháp cục thạch. Hoạt tính kháng sinh đƣợc xác định bằng đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) xuất hiện xung quanh lỗ đã nhỏ dịch.
Phương pháp khoanh giấy lọc
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi. Các khoanh giấy lọc có đƣờng kính 6 mm đƣợc tẩm một lƣợng dịch kháng
sinh (thƣờng là 1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 40oC. Đặt khoanh giấy
lọc đã tẩm dịch kháng sinh trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, các bƣớc tiếp theo giống phƣơng pháp cục thạch.
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6].
2.2.5.1. Nhân giống
Từ ống nghiệm giữ giống, chủng XK đƣợc cấy chuyển sang ống nghiệm chứa MT thạch nghiêng, nuôi 5 ngày. Tiếp theo cấy giống vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (180 vòng/phút), ở nhiệt độ 28oC trong 48 giờ (giống cấp 1). Sau đó xạ khuẩn đƣợc chuyển sang bình tam giác khác để nhân giống cấp 2 trong 36 giờ, trƣớc khi tiếp vào lên men.
2.2.5.2. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Chủng đƣợc nuôi trên các MT Gauze1, A-4, A-4H là các MT đặc trƣng cho nghiên cứu xạ khuẩn. Sau 120 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC, xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối. Trên MT nào xạ khuẩn sinh trƣởng tốt, tích lũy nhiều sinh khối sẽ chọn làm MT nhân giống. MT nào xạ khuẩn tích lũy chất kháng sinh cao nhất sẽ đƣợc lựa chọn làm MT lên men.
2.2.5.3. Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh
Quá trình lên men chủng xạ khuẩn đƣợc tiến hành trong bình tam giác dung tích 500 ml trên máy lắc tốc độ 180 vòng/phút, với MT lên men đã lựa chọn ở trên.
Các thông số nghiên cứu bao gồm nhiệt độ, pH, độ thông khí, tuổi giống và tỷ lệ giống. Sau thời gian lên men 120 giờ, xác định HTKS theo phƣơng pháp đục lỗ.
- Độ thông khí: Xạ khuẩn đƣợc nuôi trong các bình tam giác 500 ml chứa MT lên men với thể tích 25, 50, 75, 100 và 125 ml.
- Tuổi giống và tỷ lệ tiếp giống: Giống đƣợc tiếp vào MT lên men theo các tỷ lệ 1-12%. Để xác định thời gian nhân giống thích hợp, nuôi cấy chủng xạ khuẩn trong thời gian 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ trƣớc khi chuyển vào MT lên men.
2.2.6. Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh
Để định tính chất kháng sinh trong dịch nhả hấp phụ đã cô đặc ta thực hiện phƣơng pháp sắc ký giấy. Sau quá trình chạy, sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng vi sinh vật kiểm định. Tiến hành: Chấm dịch kháng sinh thô lên giấy sắc ký Whatman N 1 loại chạy chậm với kích thƣớc 1x25cm. Có thể sử dụng hệ dung môi sau để chạy sắc ký: (n-butanol : axit acetic : nƣớc = 4 : 1 : 5)
Sau khi chạy sắc ký, băng giấy đƣợc làm khô tự nhiên và hiện bằng phƣơng
pháp vi sinh vật so với kháng sinh chuẩn, vi sinh vật kiểm định là Pseudomonas
aruginosa. Rf là tỷ lệ khoảng cách từ điểm xuất phát đến chất kháng sinh chạy
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Tiến hành thu thập các mẫu khác nhau trong đó chủ yếu là các mẫu nƣớc và bụi bẩn thu thập từ các khu vực thuộc 08 khoa lâm sàng của bệnh viện huyết học truyền máu Trung Ƣơng và hành lang phía trƣớc các phòng trên. Mẫu sau khi thu thập đƣợc pha loãng và trải đều trên môi trƣờng môi trƣờng đặc hiệu cho vi khuẩn
Gram âm là KIA (Kligler Iron Agar), sau đó nuôi ở 370C trong vòng 02 ngày. Lựa
chọn các khuẩn lạc đặc trƣng cho vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa làm tiêu bản nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi. Một số chủng vi khuẩn có khả năng là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa đƣợc chọn lựa và tiến hành thử nghiệm một số phản ứng sinh lý, sinh hóa.Từ các mẫu thu thập đƣợc đã xác định đƣợc 02 chủng có khả năng cao là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, các chủng này phân lập từ mẫu HL IH4 và HL H6. Kết quả đƣợc thể hiện trong Hình 3.1và Bảng 3.1.
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào ở độ phóng đại 11000 lần trên kính hiển vi điện tử quết của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại tại bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày nuôi cấy ở 370C.
Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học truyền máu TW.
Ký hiệu mẫu
Khu vực PL Kết quả Ký hiệu
mẫu Khu vực PL Kết quả 1 Khoa Hemophilia - 13 HLKH - 2 Khoa Thalassemia - 14 HLKT - 3 Khoa Bệnh máu tổng hợp I H4 - 15 HL IH4 + 4 Khoa Bệnh máu tổng hợp II H5 - 16 HL IIH5 - 5 Khoa Bệnh máu trẻ em H6 - 17 HL H6 + 6 Khoa Điều trị hóa chất H7 - 18 HLH 6 - 7 Khoa Ghép tế bào gốc - 19 HLTBG - 8 Khoa Cấp cứu - 20 HLCC -
Từ 20 mẫu thu thập đƣợc tại 20 vị trí khác nhau ở bệnh viện huyết học truyền máu
Trung Ƣơng chúng tôi đã xác định đƣợc 02 mẫu có mặt vi khuẩn P. aeruginosa.
Nhƣ vậy tần suất xuất hiện vi khuẩn này tại bệnh viện là khá thấp nếu so sánh với một số kết quả trƣớc đây tại một số bệnh viện khác. Điều này cho thấy vấn đề kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện huyết học truyền máu Trung Ƣơng trong thời gian qua là rất tốt, hiện tại chƣa thấy xuất hiện sự có mặt của vi khuẩn mủ xanh trong các khoa lâm sàng này tạo nên sự an toàn của bệnh nhân khi đƣợc điều trị tại
đây. Các khu vực có sự hiện diện của vi khuẩn P. aeruginosa là hành lang thuộc khu vực khoa bệnh máu tổng hợp I H4 và hành lang khoa bệnh máu trẻ em H6. Mặc dù tất cả các khu vực trên đều đƣợc thực hiện công tác kiểm soát nhiễm khuẩn định kỳ nhƣng vẫn có sự xuất hiện của vi khuẩn này, lý do đây là khu vực bệnh nhân từ môi trƣờng bên ngoài bệnh viện đến và qua lại mang theo vi khuẩn.
Để khẳng định chắc chắn chủng vi khuẩn phân lập đƣợc là P. aeruginosa
chúng tôi đã phân tích trình tự 16S rADN của 02 chủng này, kết quả là cả 02 chủng
đều có trình tự tƣơng đồng 100% với trình tự gen của vi khuẩn P. aeruginosa đã
công bố trên ngân hàng gen quốc tế (Kết quả không đƣa ra trong nội dung luận văn này). Các chủng phân lập đƣợc sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Xây dựng kháng sinh đồ đối với các chủng P. aeruginosa phân lập
Vi khuẩn P. aeruginosa là một trong những loại có khả năng kháng thuốc kháng sinh khá mạnh. Để tìm hiều khả năng kháng thuốc kháng sinh cho các chủng vi khuẩn phân lập, chúng tôi đã dựng kháng sinh đồ. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện trên máy Vitek2 compact với chủng vi khuẩn đã phân lập và so sánh với chủng P. aeruginosa đối chứng kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện Huyết học truyền máu TW
Grouped by antibiotic family
P. aeruginosa PL1 P. aeruginosa Cat. Amikacin ≤2 ≤2 S Gentamicin 2 2 S Tobramycin - 16 R Cefepime 2 2 S Ceftazidime 4 4 S Imipenem ≥16 ≥16 R Meropenem 4 4 S Piperracillin ≤4 ≤4 S Piperracillin/Tazobactam 8 16 R
Ticarcillin/Clavulanic Acid 16 16 R Colistin 2 2 S Ciprofloxacin ≤0.25 ≤2 S Pefloxacin 1 1 S Minocycline ≥16 ≥16 R Trimethoprim/Sulfamethoxazole 160 160 R
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng P. aeruginosa phân lập tại Bênh viện Huyết học truyền máu TW cũng nhƣ chủng P. aeruginosa đối chứng có chung phổ mẫn cảm với nhiều loại thuốc kháng sinh. Cả 02 chủng đều có thể bị diệt mạnh
nhất với kháng sinh Trimrthoprim/sulfamethoxazole. Tuy nhiên, chủng P.
aeruginosa phân lập đƣợc ghi nhận không mẫn cảm với kháng sinh Tobramycin, trong khi đó chủng đối chứng lại khá mẫn cảm với kháng sinh này. Kết quả này cho thấy chủng P. aeruginosa phân lập tại bệnh viện Huyết học truyền máu TW đã có hiện tƣợng kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy, cần tiến hành sàng lọc các chủng xạ khuẩn có khả năng diệt chủng P. aeruginosa đã kháng thuốc trên.
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn
P. aeruginosa
3.3.1. Phân lập xạ khuẩn
Từ 35 mẫu đất đƣợc thu thập ở các vùng khác nhau đã phân lập và thuần khiết đƣợc 141 chủng xạ khuẩn. Các chủng chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc quan sát chia thành các nhóm màu sắc khác nhau theo bảng màu của Tresner và Backus, 1976. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu
Trắng Đen Cam Nâu Hồng Vàng Xám TS
91 (64,54%) 4 (2,84%) 6 (4,26%) 10 (7,09%) 19 (13,48%) 9 (6,38%) 2 (1,41%) 141 (100%)
Thông qua bảng 3.3 ta thấy các chủng phân lập rất đa dạng về màu sắc. Trong số các chủng đƣợc phân lập thì số lƣợng các chủng có màu trắng có tần suất
bắt gặp lớn hơn với các màu khác. Màu trắng có 91 chủng chiếm tỷ lệ 64,54% trên tổng số 141 chủng đƣợc phân lập. Theo bảng trên cũng cho ta thấy các chủng có màu xám rất hiếm gặp, nó chỉ chiếm tỷ lệ 1,41% so với tổng số chủng đƣợc phân lập. Nhƣ vậy có thể thấy rằng, nhóm xạ khuẩn màu trắng là rất phổ biến và các chủng thuộc các màu khác nhau nhƣ đen, cam, nâu, hồng, vàng, xám…thì có tần suất bắt gặp thấp hoặc trung bình.
3.3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P. aeruginosa aeruginosa
Để tuyển chọn chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phƣơng pháp khối thạch với vi sinh vật kiểm định là các chủng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa đã phân lập. Kết quả thu đƣợc sau khi thử hoạt tính
kháng sinh các chủng phân lập đƣợc cho thấy có 6 chủng xạ khuẩn trong tổng số 141 chủng, chiếm tỷ lệ 5% có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa.
Hình 3.2. Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
của các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch
Các chủng này tiếp tục đƣợc nuôi trong bình tam giác 500 ml chứa 100 ml
môi trƣờng Gauze-1 dịch thể, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày ở nhiệt độ 28-30o
và sử dụng phƣơng pháp khuếch tán trong thạch (sử dụng phƣơng pháp đục lỗ) để tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của dịch lên men với vi sinh vật kiểm định.
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh cho thấy 06 chủng thử nghiệm đều có hoạt tính với Pseudomonas aeruginosa, điều này cho thấy rằng các chủng xạ khuẩn
phân lập đƣợc đều sinh hợp chất kháng khuẩn ngoại bào. Trong số này chủng 8.9 thể hiện hoạt tính lớn nhất với đƣờng kính vòng vô khuẩn đo đƣợc lần lƣợt là 20. Kết quả thử nghiệm đƣợc thể hiện qua hình 3.3 và bảng 3.4.
Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính các chủng xạ khuẩn phân lập bằng
phƣơng pháp giếng thạch với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Chú thích: HTKS: hoạt tính kháng sinh D : đƣờng kính vòng vô khuẩn
d : đƣờng kính giếng thạch
Từ kết quả trên, chúng tôi chọn chủng 8.9 để tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Chủng 31.1 8.12 25.2 8.9 27.5 26.2
3.4. Nghiên cứu các đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 8.9
3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái
Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy trên các môi trƣờng Gauze-1, ISP-1, ISP-2,
ISP-3, ISP-4 đƣợc nuôi ở nhiệt độ 28-30oC trong 5 ngày sau đó quan sát khả năng
sinh trƣởng, màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố tan. Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử dƣới kính hiển vi quang học, hình dạng và bề mặt dƣới kính hiển vi điện tử. Kết quả đƣợc trình bày trong hình 3.4 và bảng 3.5.
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 khi nuôi cấy trên môi trƣờng ISP-1 (A) và ISP-2 (B)
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9