3.6.1. Tách chiết chất kháng sinh
Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn 8.9 sau khoảng 5-7 ngày đƣợc lọc qua giấy Phần dịch lọc đƣợc điều chỉnh về pH=7 và đƣợc chiết bằng n-butanol cho
bay hơi butanol ở nhiệt độ 40oC. Phần sinh khối chiết bằng aceton, lọc và cho bay
hơi trong chân không.
Chất kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 có màu vàng nghệ.
3.6.2. Độ bền nhiệt của dịch kháng thô
Để xác định độ bền nhiệt của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 sinh ra, xử lý dịch kháng sinh thô ở các nhiệt độ khác nhau: 40o
C, 60oC, 80oC,
100oC trong khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 60 phút. Sau khi đã xử lý
nhiệt, dịch kháng sinh thô đƣợc đem đi thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định
Bảng 3.12. Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 đối với vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ Thời gian 40oC 60oC 80oC 100oC 10 phút 13 13 13 11 20 phút 13 13 13 11 30 phút 13 13 13 11 60 phút 13 13 13 11
Dựa vào bảng 3.12 cho thấy hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn NĐ8.9 ở cùng một nhiệt độ xử lý, hoạt tính kháng sinh không bị ảnh hƣởng bởi thời gian. Tuy nhiên, ở các nhiệt độ khác nhau thì hoạt tính kháng sinh giảm khi nhiệt độ tăng lên, đặc biệt là ở nhiệt độ 100o
C. cònở các nhiệt độ còn lại thì hoạt tính kháng sinh không đổi hoặc thay đổi không đáng kể.
Qua đó cho thấy dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 bền với nhiệt độ nhƣng hoạt tính kháng sinh giảm so với dich kháng thô ban đầu.
3.6.3. Ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của dich kháng sinh thô
Để xác định ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của kháng sinh, chủng 8.9 đƣợc tiến hành thử hoạt tính trên môi trƣờng pH Gradient gồm 3 lớp. Lớp dƣới cùng chứa pH 5,6 và để nghiêng. Lớp thứ 2 là pH 8 và lớp trên cùng là môi trƣờng
đặc hiệu của vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aeruginosa . Sau 24h đo đƣờng
kính vòng vô khuẩn, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của pH tới sự khuếch tán của chất kháng sinh pH Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm
5,6 15
7 13
8 13
Qua bảng trên cho thấy chất kháng sinh khuếch tán tốt nhất ở pH=5,6 và pH=7,8 thì độ khuếch tán kém hơn.
3.6.4. Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 trong một số hệ dung môi một số hệ dung môi
Giá trị sắc Rf của chất kháng sinh thô đƣợc xác định bằng cách chấm dịch lên giấy sắc kí, chạy sắc kí trên một số hệ dung môi. Sau đó đƣợc hiện hình bằng phƣơng pháp hiện hình sinh học với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa và kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi
Hệ dung môi Rf
Butanol bão hòa nƣớc 0,73
Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) 0,625 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Butanol bão hòa pyridine 2% 0,76
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9
Chú thích: 1. Butanol bão hòa nƣớc
2. Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1)
3. Butanol bão hòa dung dịch pyridine 2% 4. Nƣớc bão hòa butanol
Giá trị Rf của kháng sinh này đƣợc sử dụng để đánh giá độ hòa tan của kháng sinh trong các hệ dung môi khác nhau, nhằm mục đích lựa chọn hệ dung môi tốt nhất cho quá trình tách chiết chất kháng sinh phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.7. Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9
Nhằm tạo ra chủng xạ khuẩn có khả năng sinh hoạt chất kháng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa cao hơn chủng đã phân lập để phục vụ sản xuất, chúng
tôi đã nghiên cứu để cải biến chủng này. Phƣơng pháp sử sụng ở đây là gây đột biến bằng NTG và tia UV. Chủng 8.9 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lên men lỏng trong bình tam giác. Sau khoảng 48h, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000 vòng/phút) thu tế bào và loại dịch nổi, sau đó bổ sung thêm 0.5 ml NTG, đổ ra đĩa petri. Bật đèn UV với khoảng cách từ nguồn tới đĩa là 30cm. Sau khoảng thời gian khác nhau từ 30, 60, 90, 120 phút lần lƣợt hút ra 100 µl. Sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu tế bào và loại hóa chất. Rửa tế bào 2 lần bằng nƣớc cất vô trùng, bổ sung thêm 100 µl nƣớc muối sinh lý và cấy trang trên
đĩa petri. Sau 03ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành thử hoạt tính kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. Kết quả thu
đƣợc nhƣ sau;
Từ kết quả trên chúng ta thấy hầu hết các chủng đƣợc lựa chọn sau khi gây đột biến có hoạt tính đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gần giống với
chủng gốc (vòng vô khuẩn có đƣờng kính là 18±2 mm). Tuy nhiên có 02 chủng thể hiện sự kháng cao hơn hẳn vơi đƣờng kính vòng vô khuẩn lần lƣợt là 24 và 28 mm, các chủng này thu đƣợc khi xử lý đột biến ở 120 và 90 phút. Do thời gian có hạn nên chúng tôi không lựa chọn nhiều chủng đƣợc xủ lý đột biến hơn để thử hoạt tính, do vậy không thể đánh giá đƣợc hiệu suất gây đột biến. Hai chủng có hoạt tính cao này đƣợc bảo quản để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau khi gây đột biến đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Thời gian xử lý đột biến (phút) Khuẩn lạc số Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) 0 8.9 18 30 1 18 2 19 3 17 4 17 5 19 60 1 19 2 20 3 18 4 17 5 19 90 1 17 2 20 3 28 4 20 5 19
120 1 24
2 18
3 19
4 19
PHẦN 4. KẾT LUẬN
1. Chúng tôi đã phân lập đƣợc 141 chủng xạ khuẩn thƣợc các nhóm màu khác nhau. Trong đó, nhóm xạ khuẩn màu trắng (Albus) chiếm tỷ lệ (64,54%), còn các nhóm màu khác có tần xuất ít hơn.
2. Với phƣơng pháp khuếch tán trên thạch chúng tôi đã xác định đƣợc 06 chủng phân lập có hoạt tính đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
3. Chủng xạ khuẩn 8.9 có hoạt tính mạnh nhất và đƣợc nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại trên các môi trƣờng phân loại theo khóa phân loại ISP năm 1966. Kết quả thu đƣợc là chủng đƣợc xác định là giống với loài S.parvulus.
4. Đoạn gene 16S rDNA của chủng 8.9 đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi 27F và 1492R. đƣợc giải trình tự, so sánh trên ngân hàng gen quốc tế và dựng cây phân loại có họ hàng gần gũi nhất với chủng S.parvulus. Đƣợc đặt tên là S.parvulus 8.9. 5. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển và sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1 sinh khối thích lũy cực đại ở
120h, hàm lƣợng tối đa tại thời điểm 120h và ở nhiệt đô khoảng 28-30o
C, pH=5. 6. Tiến hành tách chiết dịch kháng sinh thô sinh ra bởi chủng xạ khuẩn 8.9 và xác định giá trị Rf và độ hòa tan của chất kháng sinh này trong các hệ dung môi.
7. Xử lý đột biến chủng 8.9 bằng NTG và tia UV thu đƣợc 02 chủng có hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosacao hơn chủng gốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Ngô Đình Bính, Vũ Thị Nhung: đặc điểm phân loại của 2 chủng xạ khuẩn 5820 và THTN23, tạp chí sinh học, tập 14, số 3(9/1992). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Khuyến, Phạm Văn Ty: vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục (1998).
3. Đƣờng Hồng Dật: những nghiên cứu về bảo vệ thực vật, nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội (1970).
4. Nguyễn Đức Lƣợng: công nghệ vi sinh vật (cơ sở vi sinh vật học công nghiệp). Trƣờng Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh (1996).
5. Nguyễn Lân Dũng- Nguyễn Kim Nữ Thảo- Vietsciences. Các nhóm vi khuẩn chủ yếu.
WWW.http//: vietsciences.com/ 15/2/2006.
Tài liệu tiếng anh
6. A Ismail (2006), “Numerical Assessment of Mycelium Color in Classification of Some Streptomyces Isolates”, Int J Agricult Biology, 872-875.
7. Allister JL, JR Thomas G. Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes. J Bacteriol American Society Microbiology
89(1), 159-169.
8. Austin B (1989),A review: Novel pharmaceutical compounds from marine bacteria. J Apply Bacteria 67, 461-470.
9. Becker B, MP Lechevalier, HA Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyces”, .J Appl Microbiol 13, 236-243.
10. Bergey’s Mannual of determinative bacteriology (1986), 2, 605-703.
11. CR Kokare, KR Mahadik, SS Kadam, BA Chopade (2004), Isolation, characterization and antimicrbial activity of marine halophilic Actinopolyspora
12. Demain AL (1974), How do antibiotic- producing microorganisms avoid suicide?.
Annuals NewYork Academy Sciences 235, 601-612.
13. Demain A.L. (1981), Industrial Microbiology. Sciences 214, 987- 995.
14. Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Strepmyces project”, Inter J Syst Bac 3, 139-148.
15. Egorov NX (Nguyễn Lân Dũng) (1976), Thực tập vi sinh vật học. NXB THCN, Hà Nội.
16. Fenical W (1997), New pharmaceuticals from marine organisms. Trends Biotechnol 15, 339-341.
17. Gang Liua,c, Keith F. Chaterb, Govind Chandrab, Guoqing Niua and Huarong Tana (2013), Molecular Regulation of Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces. vol. 77 no. 1 112-143.
18. Hideo N (1974), Key for Classification and identification of 458 spieces of the Streptomyces included in ISP. J Ferment Technol 52(2), 78-92.
19. Ian Chopra1 and Marilyn Roberts2,* (2001), Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol. 65 no. 2 232-260.
20. Kamerura M, Moris K (1999), Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae. Bioscience Biotechnol Biochem 63(6), 969-972.
21. Kampfer P, RM Kroppenstedt (1991), Probasilitic identification of Streptomyces
using miniaturized physiological test. J Gen Microbiol 137, 1893-1902.
22. Kampfer P, RM Kroppenstedt W Dott (1991), A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological test. J Gen Microbiol 137,1831-1891.
23. Kenneth L. Conn, Edlira L, Giora K, George L (1998), A Quantitative Method for Determining Soil Populations of Streptomyces and Differentiating Potential Potato Scab–Inducing Strains. Plant Disease 82(6), 631-638.
24. Kothe HW, G Vohis, RM Kroppenstedt, A Henssen (1989), A taxonomic study of
Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces. System Appl Microbiol 12, 61-69. 25. Marderosian AD (1969), Marine pharmaceutical. J Pharm Scien 58,1-30. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
26. Michael J, J Pelczar, ECS. Chan, R. Noel (1993), Antibiotics and other chemotherapeutic agents in microbiology concepts and application. McGraw Hill Inc.
27. Molinski TF (1993), Developments in marine natural products, Receptor specific bioactive compounds. J Nat Prod 56,1-8.
28. Nurettin S, Aysel U (2003), Investigation of the Antimicrobial Activity of Some Streptomyces Isolates. Turk J Biol 27, 79-84.
29. Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes. Appl Microbiol 13(1), 43-61. 30. Vanek Z, J Cudlin, M.Blumauerova, Z Hosálek (1971), How many genes are
required for the synthesis of Chlortetracyline. Folia Microbiol 16, 225-240.59
31. Waksman SA (1961), The Actinomycetes, Classification, idetification and description of the genera and species. Williams & Wilkins Co Baltimore 2.
32. Witt D, E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and
Streptoverticillium and amendation of Streptomyces. System Appl Microbiol 13, 361- 371.
33. Yassin (A.F.), Rainey (F.A.), Burghardt (J.), Gierth (D.), Ungerechts (J.), Lux (I.),
Seifert (P.), Bal (C.) and Schaal (K.P.): Description
of Nocardiopsissynnemataformans sp. nov., elevation of
Nocardiopsisalba subsp. prasina to Nocardiopsisprasina comb. nov., and designation of Nocardiopsis Antarctica and Nocardiopsisalborubida as later subjective synonyms of Nocardiopsis dassonvillei. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47, 983-988.
34. Zhang (Z.), Wang (Y.) and Ruan (J.): A proposal to revive the
genus Kitastospora (Ōmura, Takahashi, Iwai, and Tanaka 1982). Int. J. Syst.