Để phân loaị chính xác hơn chúng tôi tiến hành phân loại chủng 8.9 bằng phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492R và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế.
DNA tổng số của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tách chiết theo kit của hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến đƣợc trình bày ở mục 2.2.7.1. DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn để xác định trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 27F và 1492 khuếch đại đoạn gene ~ 1500bp. Kết quả thu đƣợc ở hình 3.8.
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9
Giếng 1: Chủng xạ khuẩn NĐ 8.9; Giếng 2: marker
Từ hình 3.8 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu đƣợc một băng có kích thƣớc ~1500 bp.
Gene mã hóa 16S rRNA của chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tinh sạch và giải trình tự từ sản phẩm PCR với cặp mồi (27F; 1492R) trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng so sánh với các chuỗi 16S rRNA đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene quốc tế bằng chƣơng trình BLAST. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
~1500 bp
Bảng 3.9. So sánh trình tự gen 16S RNA trên ngân hang gen quốc tế Description Max score Total score Query cover E
value Ident Accession
Streptomyces parvulus strain HY026 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2215 2215 99% 0.0 98% KJ200636.1
Streptomyces bellus strain BLH-12 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% KJ020687.1
Streptomyces viridis strain 1032 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ607415.1
Streptomyces coeruleorubidus strain BTSS- 301 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2209 2209 99% 0.0 98% HQ711986.1
Streptomyces coeruleorubidus strain HBUM174910 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2209 2209 99% 0.0 98% EU841625.1
Streptomyces viridis gene for 16S rRNA,
partial sequence, strain: NBRC 13373 2209 2209 99% 0.0 98% AB184361.2
Streptomyces spinoverrucosus strain 174464
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU593714.1 Streptomyces spinoverrucosus strain 173372
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU570683.1 Streptomyces lomondensis strain S015 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% KF144610.1
Streptomyces parvulus strain MARS-17 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% GQ451836.1
Streptomyces parvulus strain S10 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence 2202 2202 99% 0.0 98% JX007952.1
Streptomyces sp. R8-11 gene for 16S
ribosomal RNA, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% AB841019.1
Streptomyces coeruleorubidus strain KSRO2
16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% JF682781.1 Streptomyces sp. ZG637 16S ribosomal RNA
Sau khi đã so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen quốc tế chúng tôi tiến hành dựng cây phát sinh chủng loại để xác định loài cho chủng 8.9 (hình 3.9).
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9
Từ cây phát sinh chủng loại chủng tôi nhận thấy chủng 8.9 có họ hàng gần gũi nhất với chủng S. parvulus có mã số KF144610.1 trên ngân hang gen quốc tế.
Từ đó, có thể khảng định chủng 8.9 là một chủng thuộc S. parvulus và đƣợc đặt
tên là S. parvulus 8.9.