Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn pseudomonas aeruginosa phân lập ở việt nam

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Việt Nam Học viên: Nguyễn Huy Hùng Lớp: CHST _ K16 Hƣớng dẫn: TS Nguyễn Xuân Cảnh Hà Nội, 2014 http://www.lrc.tnu.edu.vn Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Hà Nội, người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tnh hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln bên tơi, động viên,góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả http://www.lrc.tnu.edu.vn Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng Tác giả http://www.lrc.tnu.edu.vn năm 2014 MỤC LỤC MỤC LỤC i Danh mục hình iv Danh v TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Sự phân bố ý nghĩa xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Vị trí xạ khuẩn sinh giới 1.1.3 Cấu tạo xạ khuẩn .5 1.1.4 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn .8 1.1.5 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 1.1.6 Sinh tổng hợp chất kháng sinh .11 1.2 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 13 1.2.1 Phân lập chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh .13 1.2.2 Phân loại định tên xạ khuẩn 14 2.1 VẬT LIỆU 33 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33 2.1.2 Hóa chất 33 2.1.3 Thiết bị 33 2.1.4 Môi trƣờng .33 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Bảo quản giống [3] .34 2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học 35 2.2.3 Xác định sinh khối 36 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19] 36 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6] 37 http://www.lrc.tnu.edu.vn mục TÀI bảng LIỆU 2.2.6 Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 38 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39 3.2 Xây dựng kháng sinh đồ chủng P aeruginosa phân lập .41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn P aeruginosa 42 3.3.1 Phân lập xạ khuẩn 42 3.3.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P aeruginosa 43 3.4 Nghiên cứu đặc điểm phân loại đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 8.9 .45 3.4.1 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm hình thái 45 3.4.1 Đặc điểm hình thái 46 3.4.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng 8.9 .46 3.4.3 Mô tả đặc điểm phân loại .48 3.4.4 Phân loại phƣơng pháp sinh học phân tử 50 3.5 Nghiên cứu động thái lên men chủng xạ khuẩn 8.9 52 3.6 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thơ 54 3.6.1 Tách chiết chất kháng sinh 54 3.6.2 Độ bền nhiệt dịch kháng thô 54 3.6.3 Ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán dich kháng sinh thơ 55 3.6.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 số hệ dung môi 55 3.7 Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 56 PHẦN KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .60 Tài liệu tiếng Việt 60 Tài liệu tiếng anh 60 http://www.lrc.tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN HSCC Hệ sợi chất HSKS Hệ sợi khí sinh RNA Ribonucleic acide DNA Deoxyribonucleic acide RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử CKS Chất kháng sinh TKMX Trực khuẩn mủ xanh PCR Polymerase chain reaction http://www.lrc.tnu.edu.vn Danh mục hình Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.2 Bào tử xạ khuẩn http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 1.3 Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào độ phóng đại 11000 lần kính hiển vi điện tử quết chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày ni cấy 37 C Hình 3.2 Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa chủng xạ khuẩn phƣơng pháp khối thạch Hình 3.3 Kết thử hoạt tính chủng xạ khuẩn phân lập phƣơng pháp giếng thạch với vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Hình 3.4 Khả sinh trƣởng màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 nuôi cấy môi trƣờng ISP-1 (A) ISP-2 (B) Hình 3.5 Hình thái cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng xạ khuẩn NĐ 8.9 quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần (A) kính hiển vi điện tử quết độ phóng đại 7500 lần Hình 3.6 Sự sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng có nguồn cacbon khác Hình 3.7 Sinh trƣởng phát triển chủng 8.9 mơi trƣờng ISP-6 Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA chủng 8.9 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng 8.9 Hình 3.10 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 môi trƣờng Gauze-1 Hình 3.11 Biểu đồ giá trị Rf chất kháng sinh thô 8.9 http://www.lrc.tnu.edu.vn Danh mục bảng Bảng 3.1.Kết phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Viện huyết học truyền máu TW Bảng 3.2 kết dựng kháng sinh đồ máy VITEK2 compact bệnh viện Huyết học truyền máu TW Bảng 3.3 Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu Bảng 3.4 Hoạt tnh kháng sinh chửng xạ khuẩn tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái ni cấy chủng 8.9 Bảng 3.6 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 8.9 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái chủng 8.9 với chủng S parvulus Bảng 3.8 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng 8.9 S parvulus Bảng 3.9 So sánh trình tự gen 16S RNA ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.10 Hoạt tnh kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 môi trƣờng nghiên cứu Bảng 3.11 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Bảng 3.12 Hoạt tnh dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa nhiệt độ khác Bảng 3.13 Ảnh hƣởng pH tới khuếch tán chất kháng sinh Bảng 3.14 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung mơi Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau gây đột biến vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Pseudomonas aeruginosa (hay gọi Trực khuẩn mủ xanh) vi khuẩn phổ biến gây bệnh động vật ngƣời Nó đƣợc tm thấy đất, nƣớc, hệ vi sinh vật da môi trƣờng nhân tạo khắp giới Vi khuẩn không phát triển mơi trƣờng khơng khí bình thƣờng, mà sống mơi trƣờng có khí ôxy, cƣ trú nhiều môi trƣờng tự nhiên nhân tạo Vi khuẩn dinh dƣỡng nhiều hợp chất hữu cơ; động vật, nhờ khả thích ứng vi khuẩn cho phép lây nhiễm phá hủy mơ ngƣời bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung việc lây nhiễm thông thƣờng gây viêm nhiễm nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào quan thiết yếu thể nhƣ phổi, đƣờng tiết niệu, thận, gây hậu chết ngƣời; vi khuẩn phát triển tốt bề mặt bên thể Vi khuẩn đƣợc phát dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây nhiễm khuẩn bệnh viện phòng mạch Đây nguyên nhân gây viêm chân lông Nƣớc ta nƣớc nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung xạ khuẩn nói riêng phát triển Do đó, tm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả sinh kháng sinh quý, có kháng sinh kháng lại vi khuẩn Pseudomonas aruginosa gây bệnh nhiễm trùng Để giải vấn đề này, thực đề tài: “Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Việt Nam” */ Mục tiêu đề tài: - Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ mẫu thu thập số bệnh viện - Sàng lọc tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ sƣu tập chủng xạ khuẩn phân lập Việt Nam parvulus Waskman Grygory năm 1954 cho thấy chủng xạ khuẩn 8.9 chủng S parvulus có đặc điểm giống nhƣng có số điểm khác biệt khả sinh sắc tố tan khả sử dụng nguồn đƣờng Kết so sánh đặc điểm phân loại chủng 8.9 chủng S parvulus đƣợc trình bày bảng 3.7 3.6 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái chủng 8.9 với chủng S parvulus Môi trƣờng Gauze-1 Đặc điểm Chủng 8.9 _ HSCC S parvulus _ HSKS CSBT BMBT Sắc tố tan HSCC Xám Hơi xoắn Nhẵn _ _ Xám Hơi xoắn Nhẵn _ _ ISP-3 HSKS Sắc tố tan HSCC _ Hơi vàng _ _ Không màu _ ISP-6 HSKS Sắc tố tan Sinh melanin _ Vàng đậm Không _ Vàng Không Glyxerin-nitrat Bảng 3.8 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng 8.9 S parvulus Nguồn cacbon NĐ 8.9 S parvulus Saccaroza + + Xenluloza + + Glucoza + + Lactoza + + Manitol + + Fructoza + + 49 Từ kết nêu trên, bƣớc đầu xác định chủng xạ khuẩn 8.9 phân lập đƣợc loài Streptomyces parvulus 3.4.4 Phân loại phƣơng pháp sinh học phân tử Để phân loaị xác tiến hành phân loại chủng 8.9 phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F 1492R so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế DNA tổng số chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tách chiết theo kit hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến đƣợc trình bày mục 2.2.7.1 DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khuôn để xác định trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 27F 1492 khuếch đại đoạn gene ~ 1500bp Kết thu đƣợc hình 3.8 ~1500 Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA chủng 8.9 Giếng 1: Chủng xạ khuẩn NĐ 8.9; Giếng 2: marker Từ hình 3.8 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu đƣợc băng có kích thƣớc ~1500 bp Gene mã hóa 16S rRNA chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tinh giải trình tự từ sản phẩm PCR với cặp mồi (27F; 1492R) máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng so sánh với chuỗi 16S rRNA đƣợc công bố ngân hàng gene quốc tế chƣơng trình BLAST Kết thu đƣợc nhƣ sau: 50 Bảng 3.9 So sánh trình tự gen 16S RNA ngân hang gen quốc tế E Max Total Query score score cover value Streptomyces parvulus strain HY026 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2215 2215 99% 0.0 98% KJ200636.1 Streptomyces bellus strain BLH-12 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2209 2209 99% 0.0 98% KJ020687.1 Streptomyces viridis strain 1032 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ607415.1 Streptomyces coeruleorubidus strain BTSS301 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ711986.1 2209 2209 99% 0.0 98% EU841625.1 Streptomyces viridis gene for 16S rRNA, partal sequence, strain: NBRC 13373 2209 2209 99% 0.0 98% AB184361.2 Streptomyces spinoverrucosus strain 174464 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU593714.1 Streptomyces spinoverrucosus strain 173372 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU570683.1 Streptomyces lomondensis strain S015 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2206 2206 99% 0.0 98% KF144610.1 Streptomyces parvulus strain MARS-17 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2206 2206 99% 0.0 98% GQ451836.1 Streptomyces parvulus strain S10 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 2202 2202 99% 0.0 98% JX007952.1 2200 2200 99% 0.0 98% AB841019.1 2200 2200 99% 0.0 98% JF682781.1 2200 2200 99% 0.0 98% GU991344.1 Description Streptomyces coeruleorubidus strain HBUM174910 16S ribosomal RNA gene, partal sequence Streptomyces sp R8-11 gene for 16S ribosomal RNA, partal sequence Streptomyces coeruleorubidus strain KSRO2 16S ribosomal RNA gene, partal sequence Streptomyces sp ZG637 16S ribosomal RNA gene, partal sequence 51 Id e n t Accession Sau so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế tiến hành dựng phát sinh chủng loại để xác định lồi cho chủng 8.9 (hình 3.9) Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng 8.9 Từ phát sinh chủng loại chủng nhận thấy chủng 8.9 có họ hàng gần gũi với chủng S parvulus có mã số KF144610.1 ngân hang gen quốc tế Từ đó, khảng định chủng 8.9 chủng thuộc S parvulus đƣợc đặt tên S parvulus 8.9 3.5 Nghiên cứu động thái lên men chủng xạ khuẩn 8.9 Chủng 8.9 đƣợc nuôi lắc môi trƣờng Gauze-1, ISP-4, A-4H Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau khoảng 5-7 ngày nuôi lắc ba môi trƣờng cho thấy đƣợc hoạt tính mạnh mơi trƣờng Gauze-1 Kết đƣợc thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Hoạt tnh kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng nghiên cứu Mơi trƣờng Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm Gauze-1 13 A-4H 11 ISP-4 Các thông số nghiên cứu biến đổi pH, tăng sinh khối q trình lên men, hoạt tính kháng sinh dịch lên men Sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h,144h nuôi cấy dịch đƣợc đem xác định thơng số Kết đƣợc trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Sự biến đổi pH, hoạt tnh kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Thông số Thời gian lên men (giờ) 24 48 72 96 120 pH 6,8 6,5 7,2 5,5 HTKS(mm) 0 11 11 13 SK (g) 0,005 0,07 0,11 0,23 0,23 0.325 Hình 3.10 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng Gauze-1 Kết trình bày bảng 3.7 hình 3.10 cho thấy pH dịch lên dần sau 48 lại tăng lên sau 96 len men Tiếp tục lại giảm kết thúc trình lên men Khối lƣợng sinh khối chủng 8.9 tch lũy cao thời điểm 120h nuôi cấy bắt đầu giảm dần sau Hoạt tính kháng sinh dịch lên men đạt cực đại sau ngày nuôi cấy 3.6 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thơ 3.6.1 Tách chiết chất kháng sinh Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn 8.9 sau khoảng 5-7 ngày đƣợc lọc qua giấy Phần dịch lọc đƣợc điều chỉnh pH=7 đƣợc chiết n-butanol cho bay o butanol nhiệt độ 40 C Phần sinh khối chiết aceton, lọc cho bay chân không Chất kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn 8.9 có màu vàng nghệ 3.6.2 Độ bền nhiệt dịch kháng thô Để xác định độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 sinh ra, xử lý o o o dịch kháng sinh thô nhiệt độ khác nhau: 40 C, 60 C, 80 C, o 100 C khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 60 phút Sau xử lý nhiệt, dịch kháng sinh thơ đƣợc đem thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định Bảng 3.12 Hoạt tính dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa nhiệt độ khác Nhiệt độ o 80 C Thời gian o 40 C o 60 C o 100 C 10 phút 13 13 13 11 20 phút 13 13 13 11 30 phút 13 13 13 11 60 phút 13 13 13 11 Dựa vào bảng 3.12 cho thấy hoạt tnh kháng sinh chủng xạ khuẩn NĐ8.9 nhiệt độ xử lý, hoạt tính kháng sinh không bị ảnh hƣởng thời gian Tuy nhiên, nhiệt độ khác hoạt tnh kháng sinh giảm nhiệt độ tăng lên, đặc biệt o nhiệt độ 100 C nhiệt độ lại hoạt tnh kháng sinh khơng đổi thay đổi khơng đáng kể Qua cho thấy dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 bền với nhiệt độ nhƣng hoạt tính kháng sinh giảm so với dich kháng thô ban đầu 3.6.3 Ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán dich kháng sinh thô Để xác định ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán kháng sinh, chủng 8.9 đƣợc tiến hành thử hoạt tính mơi trƣờng pH Gradient gồm lớp Lớp dƣới chứa pH 5,6 để nghiêng Lớp thứ pH lớp môi trƣờng đặc hiệu vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aeruginosa Sau 24h đo đƣờng kính vòng vơ khuẩn, kết đƣợc thể bảng 3.13 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng pH tới khuếch tán chất kháng sinh pH Hoạt tnh kháng sinh (D-d) mm 5,6 15 13 13 Qua bảng cho thấy chất kháng sinh khuếch tán tốt pH=5,6 pH=7,8 độ khuếch tán 3.6.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn 8.9 số hệ dung môi Giá trị sắc Rf chất kháng sinh thô đƣợc xác định cách chấm dịch lên giấy sắc kí, chạy sắc kí số hệ dung mơi Sau đƣợc hình phƣơng pháp hình sinh học với vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kết thu đƣợc thể bảng 3.14 Bảng 3.14 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung môi Hệ dung môi Rf Butanol bão hòa nƣớc 0,73 Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) 0,625 Butanol bão hòa pyridine 2% 0,76 Nƣớc bão hòa butanol 0,43 Hình 3.11 Biểu đồ giá trị Rf chất kháng sinh thơ 8.9 Chú thích: Butanol bão hòa nƣớc Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) Butanol bão hòa dung dịch pyridine 2% Nƣớc bão hòa butanol Giá trị Rf kháng sinh đƣợc sử dụng để đánh giá độ hòa tan kháng sinh hệ dung môi khác nhau, nhằm mục đích lựa chọn hệ dung mơi tốt cho q trình tách chiết chất kháng sinh phục vụ cho nghiên cứu tếp theo 3.7 Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 Nhằm tạo chủng xạ khuẩn có khả sinh hoạt chất kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cao chủng phân lập để phục vụ sản xuất, nghiên cứu để cải biến chủng Phƣơng pháp sử sụng gây đột biến NTG ta UV Chủng 8.9 đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng lên men lỏng bình tam giác Sau khoảng 48h, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000 vòng/phút) thu tế bào loại dịch nổi, sau bổ sung thêm 0.5 ml NTG, đổ đĩa petri Bật đèn UV với khoảng cách từ nguồn tới đĩa 30cm Sau khoảng thời gian khác từ 30, 60, 90, 120 phút lần lƣợt hút 100 µl Sau ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút để thu tế bào loại hóa chất Rửa tế bào lần nƣớc cất vô trùng, bổ sung thêm 100 µl nƣớc muối sinh lý cấy trang đĩa petri Sau 03ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ đĩa khuẩn lạc riêng rẽ tến hành thử hoạt tính kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Kết thu đƣợc nhƣ sau; Từ kết thấy hầu hết chủng đƣợc lựa chọn sau gây đột biến có hoạt tính vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gần giống với chủng gốc (vòng vơ khuẩn có đƣờng kính 18±2 mm) Tuy nhiên có 02 chủng thể kháng cao hẳn vơi đƣờng kính vòng vơ khuẩn lần lƣợt 24 28 mm, chủng thu đƣợc xử lý đột biến 120 90 phút Do thời gian có hạn nên chúng tơi khơng lựa chọn nhiều chủng đƣợc xủ lý đột biến để thử hoạt tính, khơng thể đánh giá đƣợc hiệu suất gây đột biến Hai chủng có hoạt tính cao đƣợc bảo quản để phục vụ nghiên cứu Bảng 3.15 Hoạt tnh kháng sinh chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau gây đột biến vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Thời gian xử lý đột biến (phút) 30 60 90 Khuẩn lạc số 8.9 5 Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) 18 18 19 17 17 19 19 20 18 17 19 17 20 28 20 19 120 24 18 19 19 18 58 PHẦN KẾT LUẬN Chúng phân lập đƣợc 141 chủng xạ khuẩn thƣợc nhóm màu khác Trong đó, nhóm xạ khuẩn màu trắng (Albus) chiếm tỷ lệ (64,54%), nhóm màu khác có tần xuất Với phƣơng pháp khuếch tán thạch xác định đƣợc 06 chủng phân lập có hoạt tính chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Chủng xạ khuẩn 8.9 có hoạt tính mạnh đƣợc nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại môi trƣờng phân loại theo khóa phân loại ISP năm 1966 Kết thu đƣợc chủng đƣợc xác định giống với loài S.parvulus Đoạn gene 16S rDNA chủng 8.9 đƣợc khuếch đại cặp mồi 27F 1492R đƣợc giải trình tự, so sánh ngân hàng gen quốc tế dựng phân loại có họ hàng gần gũi với chủng S.parvulus Đƣợc đặt tên S.parvulus 8.9 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng Gauze-1 sinh khối thích lũy cực đại o 120h, hàm lƣợng tối đa thời điểm 120h nhiệt đô khoảng 28-30 C, pH=5 Tiến hành tách chiết dịch kháng sinh thô sinh chủng xạ khuẩn 8.9 xác định giá trị Rf độ hòa tan chất kháng sinh hệ dung môi Xử lý đột biến chủng 8.9 NTG ta UV thu đƣợc 02 chủng có hoạt tnh kháng Pseudomonas aeruginosacao chủng gốc 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 60 Ngơ Đình Bính, Vũ Thị Nhung: đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn 5820 THTN23, tạp chí sinh học, tập 14, số 3(9/1992) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Khuyến, Phạm Văn Ty: vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục (1998) Đƣờng Hồng Dật: nghiên cứu bảo vệ thực vật, nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội (1970) Nguyễn Đức Lƣợng: công nghệ vi sinh vật (cơ sở vi sinh vật học công nghiệp) Trƣờng Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh (1996) Nguyễn Lân Dũng- Nguyễn Kim Nữ Thảo- Vietsciences Các nhóm vi khuẩn chủ yếu WWW.htp//: vietsciences.com/ 15/2/2006 Tài liệu tiếng anh A Ismail (2006), “Numerical Assessment of Mycelium Color in Classificaton of Some Streptomyces Isolates”, Int J Agricult Biology, 872-875 Allister JL, JR Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determinaton of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes J Bacteriol American Society Microbiology 89(1), 159-169 Austn B (1989),A review: Novel pharmaceutical compounds from marine bacteria J Apply Bacteria 67, 461-470 Becker B, MP Lechevalier, HA Lechevalier (1965), Chemical compositon of cell wall preparatons from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyces”, J Appl Microbiol 13, 236-243 10 Bergey’s Mannual of determinatve bacteriology (1986), 2, 605-703 11 CR Kokare, KR Mahadik, SS Kadam, BA Chopade (2004), Isolaton, characterizaton and antimicrbial actvity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the West coast of India Current Science 86(4), 593-597 61 12 Demain AL (1974), How antibiotc- producing microorganisms avoid suicide? Annuals NewYork Academy Sciences 235, 601-612 13 Demain A.L (1981), Industrial Microbiology Sciences 214, 987- 995 14 Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classificaton and identificaton of named taxe included in the International Strepmyces project”, Inter J Syst Bac 3, 139-148 15 Egorov NX (Nguyễn Lân Dũng) (1976), Thực tập vi sinh vật học NXB THCN, Hà Nội 16 Fenical W (1997), New pharmaceuticals from marine organisms Trends Biotechnol 15, 339-341 17 Gang Liua,c, Keith F Chaterb, Govind Chandrab, Guoqing Niua and Huarong Tana (2013), Molecular Regulaton of Antibiotc Biosynthesis in Streptomyces vol 77 no 112-143 18 Hideo N (1974), Key for Classificaton and identificaton of 458 spieces of the Streptomyces included in ISP J Ferment Technol 52(2), 78-92 19 Ian Chopra1 and Marilyn Roberts2,* (2001), Tetracycline Antbiotcs: Mode of Acton, Applicatons, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance Microbiol Mol Biol Rev vol 65 no 232-260 20 Kamerura M, Moris K (1999), Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae Bioscience Biotechnol Biochem 63(6), 969-972 21 Kampfer P, RM Kroppenstedt (1991), Probasilitc identificaton of Streptomyces using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137, 1893-1902 22 Kampfer P, RM Kroppenstedt W Dott (1991), A numerical classificaton of the genera Streptomyces and Streptovertcillium using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137,1831-1891 23 Kenneth L Conn, Edlira L, Giora K, George L (1998), A Quanttatve Method for Determining Soil Populations of Streptomyces and Diferentatng Potential Potato Scab–Inducing Strains Plant Disease 82(6), 631-638 62 24 Kothe HW, G Vohis, RM Kroppenstedt, A Henssen (1989), A taxonomic study of Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces System Appl Microbiol 12, 61-69 25 Marderosian AD (1969), Marine pharmaceutcal J Pharm Scien 58,1-30 26 Michael J, J Pelczar, ECS Chan, R Noel (1993), Antbiotcs and other chemotherapeutc agents in microbiology concepts and applicaton McGraw Hill Inc 27 Molinski TF (1993), Developments in marine natural products, Receptor specific bioactive compounds J Nat Prod 56,1-8 28 Nuretn S, Aysel U (2003), Investigaton of the Antmicrobial Actvity of Some Streptomyces Isolates Turk J Biol 27, 79-84 29 Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an Internatonal Workshop on Determinaton of Color of Streptomycetes Appl Microbiol 13(1), 43-61 30 Vanek Z, J Cudlin, M.Blumauerova, Z Hosálek (1971), How many genes are required for the synthesis of Chlortetracyline Folia Microbiol 16, 225-240.59 31 Waksman SA (1961), The Actnomycetes, Classification, idetficaton and descripton of the genera and species Williams & Wilkins Co Baltmore 32 Witt D, E Stackebbandt (1990), Unificaton of the genera Streptomyces and Streptovertcillium and amendaton of Streptomyces System Appl Microbiol 13, 361371 33 Yassin (A.F.), Rainey (F.A.), Burghardt (J.), Gierth (D.), Ungerechts (J.), Lux (I.), Seifert (P.), Bal (C.) and synnemataformans sp Schaal nov., elevation prasina to Nocardiopsis prasina comb Antarctca (K.P.): nov., and Nocardiopsis alborubida as Description of Nocardiopsis of Nocardiopsis alba subsp and designation of Nocardiopsis later subjectve synonyms of Nocardiopsis dassonvillei Int J Syst Bacteriol., 1997, 47, 983-988 34 Zhang (Z.), Wang (Y.) and Ruan (J.): A proposal to revive the genus Kitastospora (Ōmura, Takahashi, Iwai, and Tanaka 1982) Int J Syst Bacteriol., 1997, 47, 1048-1054 62 ... tài: Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Vi t Nam */ Mục tiêu đề tài: - Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. .. bệnh vi n - Sàng lọc tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ sƣu tập chủng xạ khuẩn phân lập Vi t Nam - Phân loại nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn. .. 42 3.3.1 Phân lập xạ khuẩn 42 3.3.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P aeruginosa 43 3.4 Nghiên cứu đặc điểm phân loại đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 8.9