Tuyển chọn cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn pseudomonas aeruginosa phân lập ở việt nam

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Việt Nam Học viên: Nguyễn Huy Hùng Lớp: CHST _ K16 Hƣớng dẫn: TS Nguyễn Xuân Cảnh Hà Nội, 2014 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Hà Nội, người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln bên tơi, động viên,góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC MỤC LỤC i Danh mục hình iv Danh mục bảng v TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Sự phân bố ý nghĩa xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Vị trí xạ khuẩn sinh giới 1.1.3 Cấu tạo xạ khuẩn .5 1.1.4 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn .8 1.1.5 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 1.1.6 Sinh tổng hợp chất kháng sinh .11 1.2 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 13 1.2.1 Phân lập chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh .13 1.2.2 Phân loại định tên xạ khuẩn 14 2.1 VẬT LIỆU 33 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 33 2.1.2 Hóa chất 33 2.1.3 Thiết bị 33 2.1.4 Môi trƣờng .33 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Bảo quản giống [3] .34 2.2.2 Xác định đặc điểm sinh học 35 2.2.3 Xác định sinh khối 36 2.2.4 Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19] 36 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6] 37 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i 2.2.6 Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 38 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39 3.2 Xây dựng kháng sinh đồ chủng P aeruginosa phân lập .41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn P aeruginosa 42 3.3.1 Phân lập xạ khuẩn 42 3.3.2 Sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P aeruginosa 43 3.4 Nghiên cứu đặc điểm phân loại đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 8.9 .45 3.4.1 Đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái 45 3.4.1 Đặc điểm hình thái 46 3.4.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng 8.9 .46 3.4.3 Mô tả đặc điểm phân loại .48 3.4.4 Phân loại phƣơng pháp sinh học phân tử 50 3.5 Nghiên cứu động thái lên men chủng xạ khuẩn 8.9 52 3.6 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thô 54 3.6.1 Tách chiết chất kháng sinh .54 3.6.2 Độ bền nhiệt dịch kháng thô 54 3.6.3 Ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán dich kháng sinh thô 55 3.6.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn 8.9 số hệ dung môi 55 3.7 Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 56 PHẦN KẾT LUẬN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .60 Tài liệu tiếng Việt 60 Tài liệu tiếng anh 60 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN HSCC Hệ sợi chất HSKS Hệ sợi khí sinh RNA Ribonucleic acide DNA Deoxyribonucleic acide RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song CSBT Cuống sinh bào tử BMBT Bề mặt bào tử CKS Chất kháng sinh TKMX Trực khuẩn mủ xanh PCR Polymerase chain reaction Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii Danh mục hình Hình 1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.2 Bào tử xạ khuẩn Hình 1.3 Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc (A) tế bào độ phóng đại 11000 lần kính hiển vi điện tử quết chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày ni cấy 370C Hình 3.2 Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa chủng xạ khuẩn phƣơng pháp khối thạch Hình 3.3 Kết thử hoạt tính chủng xạ khuẩn phân lập phƣơng pháp giếng thạch với vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Hình 3.4 Khả sinh trƣởng màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 nuôi cấy môi trƣờng ISP-1 (A) ISP-2 (B) Hình 3.5 Hình thái cuống sinh bào tử bề mặt bào tử chủng xạ khuẩn NĐ 8.9 quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần (A) kính hiển vi điện tử quết độ phóng đại 7500 lần Hình 3.6 Sự sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng có nguồn cacbon khác Hình 3.7 Sinh trƣởng phát triển chủng 8.9 mơi trƣờng ISP-6 Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA chủng 8.9 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng 8.9 Hình 3.10 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 môi trƣờng Gauze-1 Hình 3.11 Biểu đồ giá trị Rf chất kháng sinh thơ 8.9 Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv Danh mục bảng Bảng 3.1.Kết phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Viện huyết học truyền máu TW Bảng 3.2 kết dựng kháng sinh đồ máy VITEK2 compact bệnh viện Huyết học truyền máu TW Bảng 3.3 Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu Bảng 3.4 Hoạt tính kháng sinh chửng xạ khuẩn tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái ni cấy chủng 8.9 Bảng 3.6 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 8.9 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái chủng 8.9 với chủng S parvulus Bảng 3.8 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng 8.9 S parvulus Bảng 3.9 So sánh trình tự gen 16S RNA ngân hàng gen quốc tế Bảng 3.10 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 môi trƣờng nghiên cứu Bảng 3.11 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Bảng 3.12 Hoạt tính dịch kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn 8.9 vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa nhiệt độ khác Bảng 3.13 Ảnh hƣởng pH tới khuếch tán chất kháng sinh Bảng 3.14 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung môi Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau gây đột biến vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v MỞ ĐẦU Pseudomonas aeruginosa (hay gọi Trực khuẩn mủ xanh) vi khuẩn phổ biến gây bệnh động vật ngƣời Nó đƣợc tìm thấy đất, nƣớc, hệ vi sinh vật da môi trƣờng nhân tạo khắp giới Vi khuẩn không phát triển mơi trƣờng khơng khí bình thƣờng, mà cịn sống mơi trƣờng có khí ơxy, cƣ trú nhiều mơi trƣờng tự nhiên nhân tạo Vi khuẩn dinh dƣỡng nhiều hợp chất hữu cơ; động vật, nhờ khả thích ứng vi khuẩn cho phép lây nhiễm phá hủy mơ ngƣời bị suy giảm hệ miễn dịch Triệu chứng chung việc lây nhiễm thông thƣờng gây viêm nhiễm nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào quan thiết yếu thể nhƣ phổi, đƣờng tiết niệu, thận, gây hậu chết ngƣời; vi khuẩn phát triển tốt bề mặt bên thể Vi khuẩn đƣợc phát dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây nhiễm khuẩn bệnh viện phòng mạch Đây nguyên nhân gây viêm chân lông Nƣớc ta nƣớc nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung xạ khuẩn nói riêng phát triển Do đó, tìm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả sinh kháng sinh quý, có kháng sinh kháng lại vi khuẩn Pseudomonas aruginosa gây bệnh nhiễm trùng Để giải vấn đề này, thực đề tài: “Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Việt Nam” */ Mục tiêu đề tài: - Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ mẫu thu thập số bệnh viện - Sàng lọc tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ sƣu tập chủng xạ khuẩn phân lập Việt Nam - Phân loại nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn tuyển chọn - Cải biến đƣợc chủng xạ khuẩn tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn - Bƣớc đầu xác định đƣợc nhóm hoạt chất từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn tác động lên vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa */ Nội dung - Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ mẫu bệnh phẩm, nƣớc thải, đất thu thập số bệnh viện - Kiểm tra tính mẫn cảm chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc với số loại chất kháng sinh - Kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa để tuyển chọn chủng có hoạt tính cao - Phân loại nghiên cứu đặc điểm hình thái, ni cấy, sinh lý – sinh hóa chủng xạ khuẩn tuyển chọn cacbon saccaroza, CMC, glucoza, lactoza, manitol, fructoza Trên mơi trƣờng có nguồn cacbon glucoza chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển chậm Khả sinh melanin Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy môi trƣờng ISP-6 nhiệt độ 28-30oC quan sát màu môi trƣờng sau 24h đến 14 ngày Trên môi trƣờng ISP-6, chủng xạ khuẩn 8.9 khơng có khả sinh sắc tố để làm màu môi trƣờng nuôi cấy chuyển dần sang màu đen Điều cho thấy chủng xạ khuẩn 8.9 khơng có khả sinh tổng hợp melanin Hình 3.7 Sinh trƣởng phát triển chủng 8.9 môi trƣờng ISP-6 Khả chịu muối Chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng ISP-4 đƣợc bổ sung NaCl nồng độ muối khác 1%, 3%, 5%, 7%, 9% Kết thí nghiệm cho ta thấy đƣợc chủng xạ khuẩn 8.9 phát triển tốt mơi trƣờng có nồng độ khác 3.4.3 Mơ tả đặc điểm phân loại Theo khóa phân loại ISP (1966), bề mặt môi trƣờng Gauze-1, ISP-1, SP-2, ISP-3, HSKS chủng xạ khuẩn 8.9 có đặc điểm tƣờng đồng với chủng S parvulus đƣợc mô tả Waskman Grygory năm 1954 đƣợc xếp vào nhóm A-11 So sánh đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 8.9 chủng S 48 parvulus Waskman Grygory năm 1954 cho thấy chủng xạ khuẩn 8.9 chủng S parvulus có đặc điểm giống nhƣng có số điểm khác biệt khả sinh sắc tố tan khả sử dụng nguồn đƣờng Kết so sánh đặc điểm phân loại chủng 8.9 chủng S parvulus đƣợc trình bày bảng 3.7 3.6 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái chủng 8.9 với chủng S parvulus Môi trƣờng Đặc điểm Chủng Gauze-1 HSCC 8.9 _ Glyxerin-nitrat HSKS CSBT BMBT Sắc tố tan HSCC Xám Hơi xoắn Nhẵn _ _ Xám Hơi xoắn Nhẵn _ _ ISP-3 HSKS Sắc tố tan HSCC _ Hơi vàng _ _ Không màu _ ISP-6 HSKS Sắc tố tan Sinh melanin _ Vàng đậm Không _ Vàng Không S parvulus _ Bảng 3.8 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng 8.9 S parvulus Nguồn cacbon NĐ 8.9 S parvulus Saccaroza + + Xenluloza + + Glucoza + + Lactoza + + Manitol + + Fructoza + + 49 Từ kết nêu trên, bƣớc đầu xác định chủng xạ khuẩn 8.9 phân lập đƣợc loài Streptomyces parvulus 3.4.4 Phân loại phƣơng pháp sinh học phân tử Để phân loaị xác tiến hành phân loại chủng 8.9 phƣơng pháp sinh học phân tử dựa trình tự 16S rRNA với cặp mồi 27F 1492R so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế DNA tổng số chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tách chiết theo kit hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến đƣợc trình bày mục 2.2.7.1 DNA tổng số đƣợc sử dụng làm khn để xác định trình tự gene 16S rRNA với cặp mồi 27F 1492 khuếch đại đoạn gene ~ 1500bp Kết thu đƣợc hình 3.8 ~1500 bp Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA chủng 8.9 Giếng 1: Chủng xạ khuẩn NĐ 8.9; Giếng 2: marker Từ hình 3.8 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu đƣợc băng có kích thƣớc ~1500 bp Gene mã hóa 16S rRNA chủng xạ khuẩn 8.9 đƣợc tinh giải trình tự từ sản phẩm PCR với cặp mồi (27F; 1492R) máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng so sánh với chuỗi 16S rRNA đƣợc công bố ngân hàng gene quốc tế chƣơng trình BLAST Kết thu đƣợc nhƣ sau: 50 Bảng 3.9 So sánh trình tự gen 16S RNA ngân hang gen quốc tế Max Total Query score score cover value Streptomyces parvulus strain HY026 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2215 2215 99% 0.0 98% KJ200636.1 Streptomyces bellus strain BLH-12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% KJ020687.1 Streptomyces viridis strain 1032 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ607415.1 Streptomyces coeruleorubidus strain BTSS301 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% HQ711986.1 Streptomyces coeruleorubidus strain HBUM174910 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU841625.1 Streptomyces viridis gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NBRC 13373 2209 2209 99% 0.0 98% AB184361.2 Streptomyces spinoverrucosus strain 174464 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU593714.1 Streptomyces spinoverrucosus strain 173372 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2209 2209 99% 0.0 98% EU570683.1 Streptomyces lomondensis strain S015 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% KF144610.1 Streptomyces parvulus strain MARS-17 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2206 2206 99% 0.0 98% GQ451836.1 Streptomyces parvulus strain S10 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2202 2202 99% 0.0 98% JX007952.1 Streptomyces sp R8-11 gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% AB841019.1 Streptomyces coeruleorubidus strain KSRO2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% JF682781.1 Streptomyces sp ZG637 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2200 2200 99% 0.0 98% GU991344.1 Description 51 E Ident Accession Sau so sánh với trình tự ngân hàng gen quốc tế tiến hành dựng phát sinh chủng loại để xác định loài cho chủng 8.9 (hình 3.9) Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại chủng 8.9 Từ phát sinh chủng loại chủng tơi nhận thấy chủng 8.9 có họ hàng gần gũi với chủng S parvulus có mã số KF144610.1 ngân hang gen quốc tế Từ đó, khảng định chủng 8.9 chủng thuộc S parvulus đƣợc đặt tên S parvulus 8.9 3.5 Nghiên cứu động thái lên men chủng xạ khuẩn 8.9 Chủng 8.9 đƣợc nuôi lắc môi trƣờng Gauze-1, ISP-4, A-4H Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau khoảng 5-7 ngày nuôi lắc ba mơi trƣờng cho thấy đƣợc hoạt tính mạnh môi trƣờng Gauze-1 Kết đƣợc thể bảng 3.10 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 môi trƣờng nghiên cứu Mơi trƣờng Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm Gauze-1 13 A-4H 11 ISP-4 52 Các thông số nghiên cứu biến đổi pH, tăng sinh khối q trình lên men, hoạt tính kháng sinh dịch lên men Sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h,144h nuôi cấy dịch đƣợc đem xác định thơng số Kết đƣợc trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9 Thông số pH Thời gian lên men (giờ) 24 48 72 96 120 6,8 6,5 7,2 5,5 0 11 11 13 0,07 0,11 0,23 0,23 0.325 HTKS(mm) SK (g) 0,005 Hình 3.10 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng Gauze-1 Kết trình bày bảng 3.7 hình 3.10 cho thấy pH dịch lên dần sau 48 lại tăng lên sau 96 len men Tiếp tục lại giảm kết thúc trình lên men Khối lƣợng sinh khối chủng 8.9 tích lũy cao thời điểm 120h ni cấy bắt đầu giảm dần sau Hoạt tính kháng sinh dịch lên men đạt cực đại sau ngày nuôi cấy 53 3.6 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thơ 3.6.1 Tách chiết chất kháng sinh Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn 8.9 sau khoảng 5-7 ngày đƣợc lọc qua giấy Phần dịch lọc đƣợc điều chỉnh pH=7 đƣợc chiết n-butanol cho bay butanol nhiệt độ 40oC Phần sinh khối chiết aceton, lọc cho bay chân không Chất kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 có màu vàng nghệ 3.6.2 Độ bền nhiệt dịch kháng thô Để xác định độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 sinh ra, xử lý dịch kháng sinh thô nhiệt độ khác nhau: 40 oC, 60oC, 80oC, 100oC khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút, 60 phút Sau xử lý nhiệt, dịch kháng sinh thơ đƣợc đem thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định Bảng 3.12 Hoạt tính dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa nhiệt độ khác Nhiệt độ Thời gian 40oC 60oC 80oC 100oC 10 phút 13 13 13 11 20 phút 13 13 13 11 30 phút 13 13 13 11 60 phút 13 13 13 11 Dựa vào bảng 3.12 cho thấy hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn NĐ8.9 nhiệt độ xử lý, hoạt tính kháng sinh không bị ảnh hƣởng thời gian Tuy nhiên, nhiệt độ khác hoạt tính kháng sinh giảm nhiệt độ tăng lên, đặc biệt nhiệt độ 100oC nhiệt độ lại hoạt tính kháng sinh khơng đổi thay đổi khơng đáng kể Qua cho thấy dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn 8.9 bền với nhiệt độ nhƣng hoạt tính kháng sinh giảm so với dich kháng thô ban đầu 54 3.6.3 Ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán dich kháng sinh thô Để xác định ảnh hƣởng pH đến độ khuếch tán kháng sinh, chủng 8.9 đƣợc tiến hành thử hoạt tính mơi trƣờng pH Gradient gồm lớp Lớp dƣới chứa pH 5,6 để nghiêng Lớp thứ pH lớp môi trƣờng đặc hiệu vi sinh vật kiểm định Pseudomonas aeruginosa Sau 24h đo đƣờng kính vịng vơ khuẩn, kết đƣợc thể bảng 3.13 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng pH tới khuếch tán chất kháng sinh pH Hoạt tính kháng sinh (D-d) mm 5,6 15 13 13 Qua bảng cho thấy chất kháng sinh khuếch tán tốt pH=5,6 pH=7,8 độ khuếch tán 3.6.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn 8.9 số hệ dung môi Giá trị sắc Rf chất kháng sinh thô đƣợc xác định cách chấm dịch lên giấy sắc kí, chạy sắc kí số hệ dung mơi Sau đƣợc hình phƣơng pháp hình sinh học với vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kết thu đƣợc thể bảng 3.14 Bảng 3.14 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung môi Hệ dung môi Rf Butanol bão hòa nƣớc 0,73 Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) 0,625 Butanol bão hòa pyridine 2% 0,76 Nƣớc bão hòa butanol 0,43 55 Hình 3.11 Biểu đồ giá trị Rf chất kháng sinh thơ 8.9 Chú thích: Butanol bão hòa nƣớc Butanol: axit axetic: nƣớc (2:1:1) Butanol bão hòa dung dịch pyridine 2% Nƣớc bão hòa butanol Giá trị Rf kháng sinh đƣợc sử dụng để đánh giá độ hòa tan kháng sinh hệ dung môi khác nhau, nhằm mục đích lựa chọn hệ dung mơi tốt cho q trình tách chiết chất kháng sinh phục vụ cho nghiên cứu 3.7 Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 Nhằm tạo chủng xạ khuẩn có khả sinh hoạt chất kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa cao chủng phân lập để phục vụ sản xuất, nghiên cứu để cải biến chủng Phƣơng pháp sử sụng gây đột biến NTG tia UV Chủng 8.9 đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng lên men lỏng bình tam giác Sau khoảng 48h, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000 vòng/phút) thu tế bào loại dịch nổi, sau bổ sung thêm 0.5 ml NTG, đổ đĩa petri Bật đèn UV với khoảng cách từ nguồn tới đĩa 30cm Sau khoảng thời gian khác từ 30, 60, 90, 120 phút lần lƣợt hút 100 µl Sau ly tâm 10000 vịng/phút 10 phút để thu tế bào loại hóa chất Rửa tế bào lần nƣớc cất vô trùng, bổ sung thêm 100 µl nƣớc muối sinh lý cấy trang 56 đĩa petri Sau 03ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ đĩa khuẩn lạc riêng rẽ tiến hành thử hoạt tính kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Kết thu đƣợc nhƣ sau; Từ kết thấy hầu hết chủng đƣợc lựa chọn sau gây đột biến có hoạt tính vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gần giống với chủng gốc (vịng vơ khuẩn có đƣờng kính 18±2 mm) Tuy nhiên có 02 chủng thể kháng cao hẳn vơi đƣờng kính vịng vơ khuẩn lần lƣợt 24 28 mm, chủng thu đƣợc xử lý đột biến 120 90 phút Do thời gian có hạn nên chúng tơi khơng lựa chọn nhiều chủng đƣợc xủ lý đột biến để thử hoạt tính, khơng thể đánh giá đƣợc hiệu suất gây đột biến Hai chủng có hoạt tính cao đƣợc bảo quản để phục vụ nghiên cứu Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau gây đột biến vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Thời gian xử lý đột biến (phút) 30 60 90 Khuẩn lạc số 8.9 5 57 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) 18 18 19 17 17 19 19 20 18 17 19 17 20 28 20 19 120 24 18 19 19 18 58 PHẦN KẾT LUẬN Chúng phân lập đƣợc 141 chủng xạ khuẩn thƣợc nhóm màu khác Trong đó, nhóm xạ khuẩn màu trắng (Albus) chiếm tỷ lệ (64,54%), cịn nhóm màu khác có tần xuất Với phƣơng pháp khuếch tán thạch xác định đƣợc 06 chủng phân lập có hoạt tính chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Chủng xạ khuẩn 8.9 có hoạt tính mạnh đƣợc nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại môi trƣờng phân loại theo khóa phân loại ISP năm 1966 Kết thu đƣợc chủng đƣợc xác định giống với loài S.parvulus Đoạn gene 16S rDNA chủng 8.9 đƣợc khuếch đại cặp mồi 27F 1492R đƣợc giải trình tự, so sánh ngân hàng gen quốc tế dựng phân loại có họ hàng gần gũi với chủng S.parvulus Đƣợc đặt tên S.parvulus 8.9 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn 8.9 mơi trƣờng Gauze-1 sinh khối thích lũy cực đại 120h, hàm lƣợng tối đa thời điểm 120h nhiệt đô khoảng 28-30oC, pH=5 Tiến hành tách chiết dịch kháng sinh thô sinh chủng xạ khuẩn 8.9 xác định giá trị Rf độ hòa tan chất kháng sinh hệ dung môi Xử lý đột biến chủng 8.9 NTG tia UV thu đƣợc 02 chủng có hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosacao chủng gốc 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Đình Bính, Vũ Thị Nhung: đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn 5820 THTN23, tạp chí sinh học, tập 14, số 3(9/1992) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Khuyến, Phạm Văn Ty: vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục (1998) Đƣờng Hồng Dật: nghiên cứu bảo vệ thực vật, nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội (1970) Nguyễn Đức Lƣợng: công nghệ vi sinh vật (cơ sở vi sinh vật học công nghiệp) Trƣờng Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh (1996) Nguyễn Lân Dũng- Nguyễn Kim Nữ Thảo- Vietsciences Các nhóm vi khuẩn chủ yếu WWW.http//: vietsciences.com/ 15/2/2006 Tài liệu tiếng anh A Ismail (2006), “Numerical Assessment of Mycelium Color in Classification of Some Streptomyces Isolates”, Int J Agricult Biology, 872-875 Allister JL, JR Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes J Bacteriol American Society Microbiology 89(1), 159-169 Austin B (1989),A review: Novel pharmaceutical compounds from marine bacteria J Apply Bacteria 67, 461-470 Becker B, MP Lechevalier, HA Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyces”, J Appl Microbiol 13, 236-243 10 Bergey’s Mannual of determinative bacteriology (1986), 2, 605-703 11 CR Kokare, KR Mahadik, SS Kadam, BA Chopade (2004), Isolation, characterization and antimicrbial activity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the West coast of India Current Science 86(4), 593-597 60 12 Demain AL (1974), How antibiotic- producing microorganisms avoid suicide? Annuals NewYork Academy Sciences 235, 601-612 13 Demain A.L (1981), Industrial Microbiology Sciences 214, 987- 995 14 Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Strepmyces project”, Inter J Syst Bac 3, 139-148 15 Egorov NX (Nguyễn Lân Dũng) (1976), Thực tập vi sinh vật học NXB THCN, Hà Nội 16 Fenical W (1997), New pharmaceuticals from marine organisms Trends Biotechnol 15, 339-341 17 Gang Liua,c, Keith F Chaterb, Govind Chandrab, Guoqing Niua and Huarong Tana (2013), Molecular Regulation of Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces vol 77 no 112-143 18 Hideo N (1974), Key for Classification and identification of 458 spieces of the Streptomyces included in ISP J Ferment Technol 52(2), 78-92 19 Ian Chopra1 and Marilyn Roberts2,* (2001), Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance Microbiol Mol Biol Rev vol 65 no 232-260 20 Kamerura M, Moris K (1999), Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae Bioscience Biotechnol Biochem 63(6), 969-972 21 Kampfer P, RM Kroppenstedt (1991), Probasilitic identification of Streptomyces using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137, 1893-1902 22 Kampfer P, RM Kroppenstedt W Dott (1991), A numerical classification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium using miniaturized physiological test J Gen Microbiol 137,1831-1891 23 Kenneth L Conn, Edlira L, Giora K, George L (1998), A Quantitative Method for Determining Soil Populations of Streptomyces and Differentiating Potential Potato Scab–Inducing Strains Plant Disease 82(6), 631-638 61 24 Kothe HW, G Vohis, RM Kroppenstedt, A Henssen (1989), A taxonomic study of Mycolateless, wall chemotype IV Actinomyces System Appl Microbiol 12, 61-69 25 Marderosian AD (1969), Marine pharmaceutical J Pharm Scien 58,1-30 26 Michael J, J Pelczar, ECS Chan, R Noel (1993), Antibiotics and other chemotherapeutic agents in microbiology concepts and application McGraw Hill Inc 27 Molinski TF (1993), Developments in marine natural products, Receptor specific bioactive compounds J Nat Prod 56,1-8 28 Nurettin S, Aysel U (2003), Investigation of the Antimicrobial Activity of Some Streptomyces Isolates Turk J Biol 27, 79-84 29 Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes Appl Microbiol 13(1), 43-61 30 Vanek Z, J Cudlin, M.Blumauerova, Z Hosálek (1971), How many genes are required for the synthesis of Chlortetracyline Folia Microbiol 16, 225-240.59 31 Waksman SA (1961), The Actinomycetes, Classification, idetification and description of the genera and species Williams & Wilkins Co Baltimore 32 Witt D, E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces System Appl Microbiol 13, 361371 33 Yassin (A.F.), Rainey (F.A.), Burghardt (J.), Gierth (D.), Ungerechts (J.), Lux (I.), Seifert (P.), Bal (C.) and of Nocardiopsis synnemataformans sp Schaal nov., (K.P.): elevation Nocardiopsis alba subsp prasina to Nocardiopsis prasina comb designation of Nocardiopsis Antarctica Description nov., and Nocardiopsis alborubida as of and later subjective synonyms of Nocardiopsis dassonvillei Int J Syst Bacteriol., 1997, 47, 983-988 34 Zhang (Z.), Wang (Y.) and Ruan (J.): A proposal to revive the genus Kitastospora (Ōmura, Takahashi, Iwai, and Tanaka 1982) Int J Syst Bacteriol., 1997, 47, 1048-1054 62 ... tài: ? ?Tuyển chọn, cải biến nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập Vi? ??t Nam? ?? */ Mục tiêu đề tài: - Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa. .. bệnh vi? ??n - Sàng lọc tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ sƣu tập chủng xạ khuẩn phân lập Vi? ??t Nam - Phân loại nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn. .. 39 3.1 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39 3.2 Xây dựng kháng sinh đồ chủng P aeruginosa phân lập .41 3.3 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn P aeruginosa