Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn cố định nitơ tự do clotridium trong đất trồng lạc xã Nghi Liên huyện Nghi Lộc tỉnh Nghệ An

Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí, phân tử nitơ tồntại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dây nối rất bền vữngN=N.[3] Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụ

Phần I: Đặt vấn đề

Nitơ hay còn gọi là đạm là một trong những nguyên tố đợc ngời ta quan tâmnhiều nhất từ trớc tới nay Nitơ chiếm khoảng 16%trong prôtêin Nitơ còn là một thànhphần quan trọng của axit Nuclêic Không có nitơ thì không có sự sống Nitơ có mặttrong chất diệp lục, trong nhiều loại vitamin, nhiều loại kích tố và rất nhiều hoạt chấtquan trọng khác

Ngời ta nhận thấy rằng muốn có thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta,cây trồngcần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ Số lợng nitơ này nằm trong hạt và trong rơm rạhoặc trong thân lá Hiệu suất sử dụng phân hóa học là vào khoảng 75% Nh vậy cónghĩa là nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ của phân hoá học thì muốn có 5 tấn hạt chúng taphải bón vào mỗi hecta khoảng 116,6kg nitơ (tơng đơng với 833kg amôn sunphát) Số l-ợng nitơ này thật khó có thể thỏa mãn ngay cả ở nớc có công nghiệp phân nitơ hóa họcphát triển

Dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, trong không khí có đến 78,16% là nitơ Ngời tatính rằng bầu không khí xung quanh trái đất chứa 4x1015tấn nitơ, khoảng không khí bêntrên mỗi km2 đất đai có khoảng 80.000 tấn nitơ Số lợng nitơ này để thoả mãn nhu cầu

về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó(với thu hoạch 20 tạ/ha)trong khoảng 80triệu năm

Trong thực tế cây trồng( cũng nh ngời và động vật) không có khả năng đồng hoátrực tiếp nguồn nitơ lớn lao này Sở dĩ nh vậy bởi vì trong không khí, phân tử nitơ tồntại ở trạng thái liên kết 2 nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ 3 dây nối rất bền vững(N=N).[3]

Trên toàn trái đất hằng năm cây trồng sử dụng khoảng 100-110 triệu tấn nitơ,trong khi đó phân đạm hoá học của tất cả các nớc trên thế giới chỉ bổ sung đợc khoảng30% số lợng nitơ bị lấy đi

Trong khi con ngời muốn phá vỡ 3 liên kết trong phân tử nitơ (N=N)để dễ tạo racác loại phân hoá học, cần phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất phức tạp: nhiệt

độ cao(6000 C ), áp suất cao(1000atm), chất xúc tác đắt tiền(Os,Ru) thì có một số visinh vật có khả năng đồng hoá dễ dàng và thờng xuyên nitơ của không khí ở điêù kiệnbình thờng , ngời ta gọi chúng là các vi sinh vật cố định nitơ.[2]

Vi sinh vật cố định nitơ gồm có nhiều loài vi sinh vật sống tự do trong đất và

trong nớc Các loài thuộc các giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas ,Bacillus, Azotobacter,vi khuẩn dinh dỡng quang năng, vi khuẩn sinh mêtan Trong số những vi

sinh vật sống t do ở đất thì Azotobacter ,Clostridium là những vi khuẩn có khả năng cố

định nitơ cao nhất.Khả năng cố đinh nitơ tự do còn có ở vi khuẩn nốt sần(Rhizobium)

sống cộng sinh trong rễ các cây họ đậu Tuy nhiên ở loài sống cộng sinh thì chúng cótính chọn lọc mỗi loại vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm lên một loài cây nhất định vàchúng chỉ cố định đợc nitơ khi ở trong nốt sần đối với vi sinh vật sống tự do ngoài khảnăng cố định nitơ tự do trong không khí cho đất cho cây còn có ứng dụng lớn laotrong sản xuất phân bón vi sinh

Ngời ta đã dành những cố gắng rất lớn một mặt đi sâu nghiên cứu về đặc điểmsinh học của các nhóm vi sinh vật cố định nitơ và tìm cách phát huy cao nhất tác dụnglớn lao này của chúng, mặt khác tìm cách khám phá ra các bí mật của cơ chế cố địnhnitơ sinh học với hy vọng sẽ từng bớc dẫn đến những cải tiến quan trọng trong ngànhcông nghiệp sản xuất các loại phân nitơ hoá học.[3]

Trong điều kiện nớc ta hiện nay, việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vikhuẩn cố định nitơ tự do có ý nghĩa rất lớn nhằm để phát huy hết khả năng cố định nitơcủa chúng, từ đó ứng dụng trong công nghiệp sản xuất trong phân bón vi sinh

Trong chiến lợc phát triển kinh tế những năm gần đây, nhà nớc đã chú trọng pháttriển những cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao trong đó có cây lạc.ở

Nghệ An, cây lạc là một trong những cây có giá trị kinh tế đã đợc tỉnh quan tâm đầu t

và phát triển

Từ những lý do trên và với khuôn khổ của một đề tài tốt nghiệp cử nhân sinh học

mà chúng tôi đi vào tìm hiểu khả năng cố định nitơ tự do của vi khuẩn kị khí

Clostridium trong đất trồng lạc xã Nghi Liên- Nghi Lộc-Nghệ An.

Mục tiêu đề tài

1.Tìm ra các chủng Clostridium có khả năng cố định nitơ tự do

2.Chọn một chủng có khả năng cố định nitơ tự do lớn nhất để nghiên cứu đặc

điểm hình thái và các yếu tố ảnh hởng đến sinh trởng:nhiệt độ, độ ẩm, pH, tìm ra các trị

số tối u để chủng đó sinh trởng và phát triển tốt

3.Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thực hành, thí nghiệm, phơng phápnghiên cứu khoa học

Phần II: Tổng luận

I Sự phân bố của vi sinh vật trong đất:

Khu hệ vi sinh vật đất rất phức tạp, có những đặc điểm sinh lý và sinh thái rấtkhác nhau Riêng vi khuẩn đã rất phong phú Chúng bao gồm vi khuẩn háo khí, vikhuẩn kị khí, vi khuẩn tự dỡng, vi khuẩn dinh dỡng cacbon, vi khuẩn cố định đạm Visinh vật sống thành quần thể, giữa loài này và loài khác có tác động qua lại lẫn nhau,chúng là tác nhân chủ yếu của quá trình chuyển hoá vật chất trong đất

Vi sinh vật có mặt trong tất cả các loài vật nhng ở chân đất có đầy đủ chất dinhdỡng, kết cấu và thành phần cơ giới tốt, có độ ẩm và phản ứng môi trờng thích hợp thì ở

đấy vi sinh vật phát triển nhiều và phong phú về thành phần Trên những chân đất khôhạn, lầy thụt thì sự phát triển vi sinh vật bị hạn chế rõ rệt và tạo thành một khu hệ vi

sinh vật đặc biệt: khu hệ vi sinh vật chịu chua, khu hệ vi sinh vật kị khí và vi hiếu khí,khu hệ vi sinh vật phát triển trong môi trờng nhiều H2, CH4

Đất trồng lúa nớc vi sinh vật kị khí chiếm u thế Các loài vi khuẩn sống tự do, có

khả năng cố định đạm nh : Azotobacter , Clostridium pasteurianum có nhiều trong đất lúa Hai loại này có đặc điểm khác nhau :Azotobacter đòi hỏi có ô xi phân tử, có phản

ứng với môi trờng trung tính, có đầy đủ lân, Ca, Mg và chất hữu cơ Vì vậy trong đất

lúa có nhiều vùng không tìm thấy Azotobacter còn vi khuẩn kị khí Clostridium pasteurianum phân bố nhiều trong đất lúa, số lợng của chúng có nhiều trong mỗi gam

đất, Chúng đã góp phần tích cực làm giàu đạm cho đất lúa

ở đất chuyên trồng màu hoặc luân canh 1 vụ lúa, 1 vụ màu có điều kiện thôngkhí tốt, vi sinh vật háo khí phát triển mạnh

Quần thể vi sinh vật đất thờng tập trung nhiều ở đất canh tác, nơi tập trung nhiều

rễ cây đợc bố sung nhờ chất dinh dỡng và có chế độ nhiệt , chế độ không khí thích hợpcho vi sinh vật phát triển Các loài vi sinh vật háo khí giảm xuống theo chiều sâu tầng

đất, còn vi khuẩn kị khí phát triển mạnh ở tầng đất sâu 40-60cm và trong điều kiện đấtthoát nớc mạnh, giàu chất dinh dỡng

Thời tiết khí hậu cũng chi phối mạnh mẽ đến quần thể vi sinh vật đất Nhữngtháng nóng ẩm có ma rào, ma phùn, cây cối phát triển tốt chính là thời gian vi sinh vậtphát triển mạnh mẽ

Vi sinh vật đất đặc biệt là vi sinh vật vùng rễ có mối quan hệ mật thiết với câytrồng Thời kì cây ra hoa, bộ rễ hoạt động mạnh tiết ra nhiều chất dinh dỡng có tácdụng kích thích vi sinh vật phát triển Vi khuẩn kị khí có khuynh hớng phân bố xa vùngrễ

Điều kiện địa hình , khu vực địa lý cũng ảnh hởng không nhỏ đối với vi sinh vật

đất Khi điều kiện sinh thái thích hợp với cây trồng thì cũng thích hợp với sự phát triển

vi sinh vật đất Sự tác động của con ngời thông qua việc khai phá đất đai, thâm canh

tăng năng suất cây trồng làm chi phối rất mạnh mẽ tới khu hệ vi sinh vật đất Việc càybừa, xới xáo đất, bón phân làm ải, tới tiêu hợp lý đã xúc tiến mạnh mẽ sự phát triển của

vi sinh vật đất, làm tăng độ phì nhiêu của đất và tăng năng suất cây trồng.[2]

II Sơ lợc về vi khuẩn Clostridium

Năm 1893 lần đầu tiên X.N.Vinogradxki phát hiện đợc một loại vi khuẩn kị khí

sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử, đó là Clostridium pasteurianum.

Tế bào của Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng

2,5-7,5x0,7-1,3 có thể đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn Khi còn non

có tế bào chất đồng đều, có khả năng di động Khi già, tế bào chất có cấu tạo hạt, tếbào mất khả năng di động Bào tử thờng có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm ở giữahay gần một đầu của tế bào Bào tử có kích thớc lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dỡng,

do đó khi mang bào tử tế bào thờng có hình con thoi Kích thớc của bào tử khoảng1,3.x1,6.

Hiên nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn nhận thấynhiều loài Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử đó là các loài: C.butyricum, C butylicum, C beijerinckia, C aceticum, C .multifermentans, C Acetobutylicum, C felsineum, C kluyveri, C lactoacetafilum, C.madisonii Sự khác nhau về các đặc điểm

hình thái và sinh lý giữa các loài này có thể đợc thấy rõ trong khoá phân loại của

Bergey(1965).

Vi khuẩn thuộc loài Clostridium pasteurianum thờng có hoạt tính cố định cao hơn các loài Clostridium khác Khi đồng hoá hết 1g thức ăn các bon, chúng thờng tích luỹ đợc khoảng 5-10mg nitơ Khả năng cố định nitơ của các loài trong chi Clostridium còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy Clostridium có khả năng đồng hoá các

monosaccarit, disaccarit và một số polisaccarit(nh tinh bột, dextrin) Chúng có thể đồnghoá cả nhiều rợu bậc cao và một số hợp chất chứa các bon khác nữa Khi lên men

hidratcacbon, Clostridium thờng làm tích luỹ axit hữu cơ butanol, etanol, axeton, CO2,



H2 Thành phần và tỷ lệ của các sản phẩm lên men phụ thuộc vào từng loại vi khuẩncũng nh phụ thuộc vào hai pha khác nhau của quá trình lên men Chẳng hạn

Clostridium axetobutylicum thờng làm tích luỹ trong pha đầu axit axetic, axitbutiric và

trong pha sau butanol, axeton và etanol

Clostridium pasteurianum cũng nh nhiều loài Clostridium có khả năng cố đinh

nitơ khác có thể phát triển đợc trong phạm vi pH khá rộng (pH =4,7-8,5) Tuỳ từng

nghiên cứu mà pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của Clostridium là 5,9-8,3,hay

6,9-7,3 Các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết ngay cả những vùng đất chua, khi không

tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt với số lợng đáng kể.

Nói chung trên mỗi gam đất trồng lúa, trên miền bắc nớc ta, số lợng vi khuẩn nhómnày có từ hàng vạn đến từ hàng triệu tế bào Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng

bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ Clostridium thờng tập trung nhiều trong lớp đất

cày nhng ngay ở độ sâu 75cm vẫn có thể thấy có hàng ngàn tế bào trong mỗi gam đất

(Nguyễn Lân Dũng, 1960, 1969).

Bào tử của Clostridium có sức đề kháng rất cao đối với nhiệt độ cao và sự khô

hạn Một số nghiên cứu cho biết bào tử của loài vi khuẩn này có thể sống đợc đến 5 giờ

ở nhiệt độ 750C và một giờ ở nhiệt độ 800C Bao tử của một số chủng Clostridium chịu

nhiệt ngay ở nhiệt độ 1000 C vẫn có thể sống đợc 30phút

Các loài Clostridium hiện diện trong đất ,một số loài trong nhóm này còn gây

bệnh cho ngời và động vật, một số loại khác gây h hỏng thực phẩm khử sunphur tạonên màu đen và gây mùi khó chịu Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C botulinum và C perfringens.[14]

III Vòng tuần hoàn Nitơ trong tự nhiên

Cây không đồng hoá trực tiếp nitơ hữu cơ Trong thực tế cây trồng có thể nhận đợcmột nguồn nitơ lớn nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật đối với các chất hữu cơ có mặt

trong đất hoặc đa vào đất (phân rác, phân xanh, phân chuồng) Quá trình này gọi là quátrình a môn hoá hoặc quá trình thối rữa.

Nếu đất bị ngập nớc và không đủ ôxi thì muối amôn đợc tạo thành sẽ tích luỹ lạitrong đất, nhng nếu trong đất có đầy đủ ôxi thì NH3 sẽ đợc oxi hoá thành nitrit rồi tiếp

đó sẽ ôxi hoá thành nitrat (Quá trình nitrat hoá) Nitrat là một trong những dạng hợpchất nitơ đợc cây trồng hấp thụ một cách dễ dàng

Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat hoá, tức là quá trình khửnitrat thành nitơ phân tử Bên cạnh quá trình phản nitrat hoá do vi sinh vật còn có mộtquá trình phản nitrat hoá hoàn toàn hoá học (Phản ứng giữa HNO2với axit amin hoặcamit) Sau quá trình phản nitrat hoá, nitrat sẽ chuyển thành nitơ phân tử bay vào khôngkhí

Những tổn thất về nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờmột quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ, tức là quá trình chuyển hoánitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quátrình này đợc gọi là các vi sinh vật ccố định nitơ, chúng có tác dụng làm giàu thêmnguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất

Hình 1: Chu trình nitơ trong tự nhiên

IV Cơ chế của quá trình cố định Nitơ phân tử

Trong công nghiệp sản xuất phân hoá học việc chuyển hoá N2 thành các dạnghợp chất của nitơ (muối amôn, urê, nitrat) cần tiêu tốn nhiều năng lợng Số năng lợng

để tổng hợp một tấn NH3 tơng đơng với số năng lợng sinh ra khi đốt cháy 5 tấn than

đá Trong khi đó các vi sinh vật cố định nitơ bằng một cơ chế nào đó đã thờng xuyênchuyển hoá đợc N2 thành các hợp chất chứa nitơ ngay trong điều kiện bình thờng về

áp suất và nhiệt độ Nếu khám phá ra đợc cơ chế quá trình cố định nitơ ở vi sinh vậtthì rõ ràng sẽ mở ra một triển vọng hết sức to lớn đối với việc cải tiến toàn bộ quátrình sản xuất phân nitơ hoá học

Đa số nghiên cứu đều cho thấy rằng:Quá trình cố định nitơ sinh học là một quátrình khử N2 thành NH3 dới tác dụng của men nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật

Nitrogenaza có thể thu đợc từ dịch chiết vô bào lấy từ tế bào của các vi sinhvật cố định nitơ

Nitrogenaza là một hệ phức enzim Chúng cấu tạo bởi 2 thành phần đó làprôtêin có phân tử nhỏ

Một thành phần gọi là prôtêin sắt còn gọi là nitrogenaza khử hay thành phần

II Một thành phần khác gọi là prôtêin sắt-Molipden hay còn gọi là thành phần I

Thành phần II đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm 2 tiểu phần

đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lơng 29.000, ở giữa có một trung tâm chứa 4nguyên tử Fe và 4 nguyên tử S không ổn định với axit Thành phần I(Mo-Fe prôtêin )

ở Clostridium pasteurianum phức tạp hơn có khối lợng phân tử chung là 220.000

gồm 2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử Fe và nhiều nguyên tử S không ổn địnhvới axit Chúng có cấu tạo bởi 4 tiểu phần gồm 2 loại, mỗi loại có khối l ợng phân tử

là 50 và một loại có khối lợng phân tử là 60.000 Dalton Mỗi loại gồm hai tiểu phần

Nitrogenaza không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thể xúc tácviệc khử CH3 CN, HCN, NH3,N2 O, C2H2 thành các sản phẩm tơng ứng

Phản ứng khử N2 dới sự xúc tác của nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt nh sau:

Nitrogenaza N2 + 6e + 12ATP + 12 H2O 2NH4++ 12ADP + 12Pi + 4H+

Ngời ta cho rằng quá trình khử này bao gồm nhiều phản ứng kế tiếp nhau và sửdụng năng lợng của ATP

2H+ ATP 2H+.ATP +2H ATP

N2 [NH = NH] [NH2 -NH2] 2NH3

Sơ đồ giả thuyết về trung tâm hoạt động của nitrogenaza đợc trình bày nh sau:

Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit)đi vào trung tâm có chứa Fe củathành phần en zim II(prôtêin -Fe)và tiếp tục chuyển cho thành phần en zim I(prôtêin -Fe-Mo).Electron đã hoạt hoásẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo ở bên trong

"hạt” Tại đây Mo sẽ bị khử và nhờ đó có khả năng phẳn ứng nhanh chóng với N2.Phân tử N2 đi qua một khe có kích thớc khoảng 4-5 Ao tức là tơng ứng với chiều dàicủa phân tử N2 vào bên trong men và đợc hoạt hoá ở đấy

Kết quả của quá trình Nitrogen hoạt hoá và hấp phụ hoá học Nitơ sẽ làm dứt 2dây nối trong số dây của phân tử N2 Năng lợng tiêu phí là 7,8x105J/mol Dây nối thứ

3 sẽ cắt đứt khi tiếp xúc với hidro đã đợc hoạt hoá nhờ các men đehirogenaza và hệthống hidrogenaza

Sau đó NH3 hoặc các sản phẩm khử khác đợc sinh ra sẽ liên kết với cácketoaxit để tạo thành axitamin [2]

Hiệu suất của quá trình cố định đạm ở loại kị khí cao hơn so với loại hiếu khí.Khi sử dụng hết 1g thức ăn cacbon Clostridium pasteurianum thờng chuyển hoá đợcmột lợng N2 ít hơn Azotobacter khoảng 4- 7 lần Trong khi đó khi phân giải thức ăncacbon Clostridium pasteurianum nhận đợc số năng lợng ít hơn Azotobacter đến 45lần Nh vậy nếu tính theo một đơn vị năng lợng đã nhân đợc thì loại kị khí cố định

đạm đợc nhiều hơn loại hiếu khí tới 6-10 lần [6]

V Sử dụng các vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ trong nông nghiệp

Vi sinh vật cố định nitơ đóng vai trò rất quan trọng trong việc thực hiện vòngtuần hoàn nitơ trong nông nghiệp

Các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do(háo khí và kị khí) có khả năng làm giàuthêm hàng năm khoảng 15-16kg nitơ cho mỗi ha đất đai(tơng đơng với 75-300kg

đạm sun phát) Các loại tảo lam sống trong ruộng lúa cũng có khả năng đem lại chomỗi ha đất mỗi năm khoảng 15-80 kg nitơ Một hecta trồng cây bộ đạu mỗi năm cóthể cố định từ 50-600kg nitơ Để tăng khả năng cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần ng-

ời ta đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn nốt sần tạo ra chế phẩm Nitragin để bón vào đấthay tẩm hạt giống các cây thuộc bộ đậu tơng ứng trớc khi gieo trồng, Nitragin có khảnăng làm nâng cao năng suất cây bộ đậu khoảng 10-15% [2]

Chế phẩm Azotobacter còn gọi làAzotobacterin Đối với các loại đất có chứanhiều chất hữu cơ, dễ hấp thụ Azotobacterin có thể làm tăng năng suất khoảng 6-10% sản lợng cây trồng.Là loại phân có chứa vi sinh vật trực tiếp hút nitơ của khôngkhí chuyển hóa vào đất thông qua vi sinh vật tự dỡng háo khí ,nghĩa là làm thức ăncho chính vi sinh vật đó sau khi chết để lại chất dinh dỡng hữu cơ ,đạm dễ tiêu cho

đất Vì vậy điều kiện để vi sinh vật này hoat động là khá nghiêm ngặt :đất phải chua,lợng lân dễ tiêu,chất hữu cơ ,một số nguyên tố vi lợng phải khá dồi dào Kĩ thuậtphổ biến vẫn thờng ngâm với hạt giống trớc khi gieo Tại Việt Nam cũng đã áp dụngthử phân Azotobacterin nhng cha có hiệu quả rõ rệt

Đã có rất nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium pasteurianum (dịch

nuôi cấy hoặc dịch nuôi cấy trộn với đất đã khử trùng) để bón cho cây trồng Trongmột số trờng hợp đã thu đợc những hiệu quả dơng tính khá rõ rệt(nhất là khi phối hợp

với Azotobacterin ) Tuy nhiên hiệu quả nay thờng không ổn định và cho đến nay

ng-ời ta vẫn cha giải thích đợc một cách dứt khoát là trong trờng hợp có tác động dơngtính thì chủ yếu là do sự cố định nitơ hoặc là do tích luỹ những chất có hoạt tính sinhhọc cao.[3]

Phần III: Địa điểm, thời gian và phơng pháp nghiên

cứu

I Địa điểm nghiên cứu:

Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trờng Đại học Vinh

II Thời gian nghiên cứu:

Từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 4 năm 2007

III Phơng pháp nghiên cứu

3.1 Phơng pháp điều tra

Dùng phiếu điều tra để tra khảo tình hình sản xuất kết hợp vói phỏng vấn các hộ

đển hình về chế độ đầu t ,phân bón những nhận xét về đất trồng ,kỹ thuật canh tác

3.2 Thu mẫu vi sinh vật

Khi phân lập vi sinh vật từ đất hay tính số lợng vi sinh vật của đất thì việc lấymẫu đợc tiến hành nh sau:

Dùng dao vô trùng lấy 1 kg đất ở độ sâu 0-30cm thuộc 5 chỗ khác nhau theophơng pháp đờng chéo rồi trộn lại với nhau, lấy giấy bóng mờ đã khử trùng để đựng

đất, loại bỏ rễ cây và vật lạ Ghi nhãn, bảo quản và phân tích tại phòng thí nghiệm.[10]

3.3 Phơng pháp phân lập vi sinh vật

Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki gồm:

(NH4)2SO4 2gNaCl 2gK2HPO4 1gFeSO4 0,1gMgSO4 0,5gCaCO3(MgCo3) 1g

ờng

Nớc :1l

Dùng trang thuỷ tinh phân phối đều huyền phù vi sinh vật lên trên bề mặtthạch Sau đó đặt vào tủ ấm nuôi 30oC trong 3- 5 ngày Khuẩn lạc xuất hiện, theo dõithờng xuyên Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác nhau đứng riêng rẽ.Dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở khuẩn lạc vi sinh vật đó cấy lên ống thạchnghiêng, đem nuôi ở nhiệt độ 30-350C

Sau thời gian nuôi cấy cần kiểm tra lại độ thuần chủng của giống vi sinh vật đãmọc trong từng ống nghiệm ,nếu trong từng ống nghiệm mọc chủ yếu là giống visinh vật cần tìm nhng có lẫn chút ít loại vi sinh vật khác thì có thể dùng phơng phápcấy rải nh sau :

Để thu đợc các khuẩn lạc riêng biệt đem que cấy vô trùng chạm nhẹ lên môitrờng thạch nghiêng hoăc môi trờng lỏng ,cấy ríc rắc vuông góc lên mặt thạch

Cân chính xác các thành phần

của môi tr ờng

Hoà tan đun sôi

điều chỉnh pH

Cho vào bình tam giácống nghiệm, petri

Khử trùng ở 1atmthời gian 30 phút

Bảo quản tủ lạnh

của hộp petri.Sau đó chọn khuẩn lạc mọc tốt của vi sinh vật cần tìm đem cấy vào ốngnghiệm chứa môi trờng lỏng [7]

3.4 Phơng pháp theo dõi (theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển)

3.4.1.Thời gian mọc của vi khuẩn

Sau khi cấy dịch huyền phù vào môi trờng thạch, theo dõi thờng xuyên sự xuấthiện của khuẩn lạc cho đến khi không xuất hiện các khuẩn lạc mới Vì mỗi loài có cómột tốc độ sinh trởng và phát triển không giống nhau

3.4.2.Theo dõi sự sinh trởng:

Nuôi trong đĩa petri, đo kích thớc (() của khuẩn lạc bằng thớc đo palmer trongthời gian 24 giờ hoặc 48 giờ hoặc 72 giờ

Từ đó tốc độ sinh trởng theo Blachman(1981)

Wt-Wo

Wo

Trong đó: Wo là số đo lần đầu

Wt là số đo lần sau tại thời điểm t

3.4.3.Tìm hiểu các đặc điểm của các khuẩn lạc

Vi sinh vật phát triển trên môi trờng đặc sẽ hình thành các khẩn lạc đặc trng cho

loài đó Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các công việc rất cần thiết đốivới công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu

Tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc: Màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấu trúc, bờkhuẩn lạc

3.4.4 Thử hoạt tính cố định nitơ của các chủng

+Thử định tính

Từ các chủng đã phân lập đợc, dùng que cấy lấy một ít chủng cho vào ốngnghiệm chứa 2 ml nớc cất Sau đó cho thuốc thử Nessle vào:

Xuất hiện màu vàng cam(dơng tính :+)Không xuất hiện màu vàng cam(âm tính:-)+Thử định lợng(amôn)

Từ các chủng có kết quả (+) ở trên Dùng que cấy lấy một ít chủng đem nuôi trongống nghiệm chứa 5ml môi trờng Vinograxki lỏng Sau khoảng 3-5 ngày đem đo trênmáy quang phổ CELCIN của Mỹ:

Tìm ra đợc chủng có có hàm lợng NH+ 4 lớn nhất

-Pha dung dịch chuẩn NH4Cl 0,001 mg/ml

Cân 0,3820g NH4Cl pha trong 1l ta đợc 0,1mgN/ml

Lấy 50 ml dung dịch này pha trong 500ml ta đợc dung dịch 0,01mgN/ml

3.5 Xác định số lợng vi sinh vật theo phơng pháp CFU(colony-forming unit)

- Từ mẫu ban đầu sau đó pha loãng theo dãy thập phân

- Cấy vào môi trờng thạch đã vô trùng

- Nuôi ở 30Otrong 3- 5 ngày

- Xác định số lợng khuẩn lạc trên đĩa petri

- Tính số lợng tế bào theo công thức

N A(CFU/g hay CFU/ml) =

n1Vf1+ +niVfi

Trong đó: A: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1

ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa đã chọn

(25-250 khuẩn lạc) theo FDA(Food and Drug Asministration )

ni: Số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ iV: Thể tích dịch mẫu (ml)cấy vào trong mỗi đĩafi: Độ pha loãng tơng ứng.[14]

Xác định hàm lợng NH+ 4 ở độ ẩm khác nhau trong các ngày khác nhau.

- Phơng pháp xác định NH+ 4theo Kjendahl Nessler và Sapiro-1972.[12]

Cân 10 g đất tơi +100ml KCl 0,1N cho voà bình tam giác 250ml dịch lọc vàobình định 25 ml, thêm 1ml dung dịch Seignetle (Tactrat kép K-Na)50% +1ml dungdịch Nessle định lợng trên vạch rồi so màu trên máy Xác định nồng độ C bằng cách sosánh với đồ thị nồng độ chuẩn

V2: Thể tích hiện màu(25ml)W: Khối lợng đất cân:10gC:Nồng độ so màu(mg/ml)K: Hệ số khô kiệt

- Thang tiêu chuẩn:

Lấy 10 bình định mức 25 ml lần lợt cho vào các thể tích khác nhau dung dịchNH4Cl 0,01mg/ml tiêu chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16,ml

Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch Seignetle +1ml Nessle định mức đến vạch somàu

Tiến hành so màu nh mẫu nghiên cứu

3.6.2 ảnh hởng pH

Cho mỗi công thức thí nghiệm một ít vi sinh vật nh nhau cùng một môi trờng đãvô trùng, điều chỉnh pH ở các công thức khác nhau (pH=5, pH=6, pH=7, pH=8, pH=9).Sau đó nuôi cùng một nhiệt độ là 300C

Từ đó xác định hàm lợng NH+ 4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu vớithuốc thử Nessle

3.6.3 ảnh hởng nhiệt độ.

Để theo dõi ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng đồng hoá của nitơ ta cho mỗicông thức thí nghiệm một ít vi sinh vật vào cùng một môi trờng Sau đó đem nuôi các

điều kiện nhiệt độ khác nhau 200C, 300C, 400C, 500C

Xác định NH+ 4 ở các công thức bằng phơng pháp so màu với thuốc thử Nessle.

3.6.4 ảnh hởng thời gian đến khả năng đồng hoá Nitơ

Qua theo dõi pH,nhiệt độ ,độ ẩm ở các thời gian khác nhau Từ đó rút ra thờigian tốt nhất cho sự cố định nitơ

3.7 Phơng pháp xử lý số liệu

Số liệu đợc xử theo phơng pháp toán học thống kê