Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn clotridium cố định nitơ trong đất trồng ngô ở xã hưng lợi hưng nguyên

Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Bộ giáo dục và đào tạo Trờng đại học vinh Khoa Sinh học --------------- Lê thị thu lan Đề tài: Bớc đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn Clostridium cố định nitơ trong đất trồng ngô ở xã hng lợi - hng nguyên - nghệ an Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh Giáo viên hớng dẫn - GVC: Nguyễn Dơng Tuệ 1 Khãa luËn tèt nghiÖp cö nh©n khoa häc sinh häc - Sinh viªn Lª ThÞ Thu Lan Vinh - 2007 2 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan lời cảm ơn Luận văn đợc thực hiện và đạt kết quả là nhờ vào phần nỗ lực, cố gắng, mệt mài, nghiêm túc trong công tác nghiên cứu khoa học của bản thân. Cũng trong suốt quá trình thực hiện, tôi còn nhận đợc sự giúp đỡ của thầy cô giáo, của ngời thân và bạn bè. Trớc hết tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ đã tận tình, chu đáo giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, phòng thí nghiệm Di truyền Vi sinh Phơng pháp, phòng thí nghiệm Hoá sinh trờng Đại Học Vinh cùng tất cả bạn bè, ngời thân luôn giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện. Đặc biệt, qua đây tôi xin chân thành cảm ơn nhân dân, cán bộ xóm 6- xã Hng Lợi đã tận tình giúp đỡ tôi để luận văn này đợc hoàn thành. Tuy có nhiều cố gắng, song bản thân đề tài này không thể tránh khỏi những thiéu sót. Tôi rất mong nhận đợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên: Lê Thị Thu Lan Lớp:43E 1 Sinh. 3 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan mục lục Mở Đầu 1 Đặt vấn đề 1 Mục tiêu đề tài . 3 Phần I: Tổng quan tài liệu . 4 I. Định nghĩa phân bón . . 4 II. Phân bón vi sinh vật . 5 III. Tình hình nghiên cứu trong nớc 5 3.1. Tình hình nghiên cứu phân vi sinh 6 3.2. ứng dụng thực tiễn của phân bón vi sinh học ở Việt Nam 6 3.3. Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum 7 IV. Đặc điểm chung của vi khuẩn Clostridium pasteurianum . 8 V. Đặc điểm bào tử 9 VI. Vòng tuân hoàn nitơ trong t nhiên . 9 VII. Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử .11 Phần II: Đối tợng, nội dung, phơng pháp, địa điểm và thời gian nghiên cứu 15 I. Đối tợng nghiên cứu 15 II. Thời gian nghiên cứu . 15 III. Địa điểm và phơng pháp thu mẫu 15 IV. Phơng pháp nghiên cứu 16 4.1. Phơng pháp phân tích một số chỉ tiêu nông hoá- thổ nhỡng 16 4.2. Phơng pháp nuôi cấy vi sinh vật 17 4.3. Phơng pháp xác định vi sinh vật 18 4.4. Phơng pháp phân lập . 18 4 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan 4.5. Phơng pháp theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển . 19 4.6. Phơng pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Clostridium 20 4.7. Một số phơng pháp khác 20 4.8. Một số phơng pháp kiểm tra enzim .21 4.9. phơng pháp xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng 22 4.10. phơng pháp xử lý số liệu 22 V. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến khả năng đồng hoá nitơ . 23 5.1. ảnh hởng của pH . 23 5.2. ảnh hởng của nhiệt độ 23 5.3. ảnh hởng của độ ẩm .23 5.4. ảnh hởng của thời gian . 23 Phần III: Kết quả nghiên cứu 25 I. Một số đặc điểm của khu vực nghiên cứu 25 II. Kết qủa phân tích một số chỉ tiêu nông hoá . 25 II.1. Kết quả xác định pH 25 II.2. Kết quả phân tích NH 4 + trong đất . 27 III. Kết quả định lợng vi khuẩn Clostridium trong mẫu đất IV. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Clostridium 29 V. Đặc điểm khuẩn lạc 31 VI. Kết quả khẳng định vi khuẩn Clostridium .32 6.1. Kết quả khi nuôi ống thạch sâu .32 6.2. Thử nghiệm trong môi trờng lỏng . 33 5 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan 6.3. Thử hoạt tính của catalaza .33 VII. Sinh trởng của các chủng đã chọn .33 VIII. Khả năng cố định nitơ phân tử của các chủng 35 IX. Xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng .36 X. Các yếu tố ảnh hởng đến sự cố định nitơ phân tử . .37 X.1. ảnh hởng của pH . 38 X.2. ảnh hởng của nhiệt độ .39 X.3. ảnh hởng của độ ẩm . .41 X.4. ảnh hởng của thời gian . 42 XI. Số lợng vi khuẩn cần sử dụng . . 44 - 45 kết luận và kiến nghị I. Kết luận . 46 II. Kiến nghị 48 Tài liệu tham khảo .49 - 50 6 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Mở đầu 1. Đặt vấn đề: Vi sinh vật có vai trò quan trọng đối với quá trình hình thành và phát triển của đất cũng nh quá trình sinh trởng và phát triển của cây trồng: vi sinh vật tham gia vào quá trình hình thành mùn làm cho đất tơi xốp, tăng khả năng giữ độ ẩm cho đất, tác dụng trực tiếp đến sự phân giải khoáng hoá các hợp chất hữu cơ, đó là nhóm vi sinh vật có khả năng cố định nitơ trong khí quyển. Nhờ đặc tính đó của vi sinh vật kết hợp với nền chất mang để sản xuất phân bón sinh học làm tăng độ màu mỡ của đất nâng cao chất lợng cây trồng. Vi sinh vật cố định nitơ là những vi sinh vật có khả năng sử dụng nitơ phân tử và khử thành NH 3 . Có 2 nhóm có khả năng cố định nitơ phân tử đó là: nhóm sống cộng sinh và nhóm sống tự do. Trong nhóm sống tự do cố loài hiếu khí, kỵ khí và vi khuẩn lam. Và một trong những loài vi sinh vật có ý nghĩa không nhỏ trong quá trình cố định nitơ phân tử cho hệ sinh thái đất đó là vi khẩn kỵ khí Clostridium pasteurianum. [7]. Clostridium pasteurianum là loài vi khuẩn kỵ khí, sinh bào tử ,có khả năng cố định nitơ cao. Khi đồng hoá hết 1g thức ăn cácbon, chúng tích luỹ đ- ợc khoảng 5 10(mg) nitơ.[7]. Do vậy sự hiểu biết về loài vi kkhuẩn này trong một hệ sinh thái đất là hết sức cần thiết. Vi sinh vật có tác dụng tốt đói với tính chất lý hoá và sinh họccủa đất, tham gia các quá trình chuyển hoá các hợp chất hữu cơ, các chất khoáng góp phần nâng cao dinh dỡng của đất và đồng thời vi sinh vật còn có tác dụng bảo vệ môi trờng sinh thái. Bên cạnh giá trị thiết thực cho nền nông nghiệp, hiện nay phân bón vi sinh còn kiến tạo một nền nông nghiệp ổn định, bền vững 1 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan gắn liền với nông nghiêp hữu cơ. Việc sản xuất phân bón sinh học góp phần giảm bớt nguy cơ ô nhiễm môi trờng, đồng thời trả lại cho đất những gì mà cây đã lấy đi. Cây ngô (zemay SL) là cây lơng thực có giá trị kinh tế không nhỏ đối với nền nông nghiệp nớc ta nói riêng và một số nớc trên thế giới, là nguồn nuôi sống 1/3 số dân trên toàn thế giới. Cây ngô có nguồn gốc từ một loại cây hoang dại ở miền trung nớc Mêhicô. ở nớc ta ngô là cây lơng thực đứng thứ hai sau lúa với diện tích đang tăng dần qua các năm và đến năm 2010 đạt 750.000 ha. Từ trớc tới nay, ngô luôn là loài cây lơng thực đặc trng của nớc ta và đối với một số vùng dân c ven sông Lam nh huyện Hng Nguyên nói riêng. [3]. Sông Lam là một con sông lớn ở Nghệ An và hàng năm nó bồi đắp một lợng phù sa rất lớn cho vùng đất nơi đây nh khu vực Hng Nguyên, Nam Đàn. Đây là điều kiện rất tốt, thuận lợi để phát triển nghề trồng cây ngô và một số loài cây khác nh: lạc, đỗ, vừng, . nhng vai trò cố định nitơ ở vùng đất này cha đợc nghiên cứu. Để tìm hiểu về các chất dinh dỡng của đất cũng nh tìm hiểu khả năng cố định nitơ phân tử, tạo màu mỡ cho đất nơi đây thì việc tìm kiếm, phân lập, tuyển chọn các chủng về loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium sẽ giúp chúng tacó thể xác định về khả năng cung cấp phân đạmcho cây, biết đợc lợng nitơ cần thiết trên một diệnn tích cụ thể,có thể xác định nhu cầu cung cấp thêm phân vi sinh cố định nitp - đạm sinh học, xác định lợng bón phân cân đối và hợp lý để nâng cao năng suất cây ngô. Đồng thời góp phần vào việc điều tra khai thác tài nguyên sinh vật có ích phục vụ sản xuất. 2 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan II. Mục tiêu của đề tài: Chúng tôi tiến hành nghiên cứu vấn đề này nhằm: 1. Điều tra tình hình sản xuất ngô ở địa phơng Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An về kỷ thuật canh tác, tình hình sử dụng các loại phân bón, năng suất, 2. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Clostridium có khả năng cố định nitơ phân tử tồn tại trong đất ngô tại xã Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An 3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học cũng nh khả năng cố định nitơ tự do. Và lựa chọn chủng Clostridium pasteurianum có khả năng cố định nitơ lớn nhất. 4. Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố điều kiện sống cũng nh, độ ẩm, pH đến đời sống của chủng đã chọn. Từ đó đa ra các trị số tối u để ứng dụng vào sản suất phân đạm vi sinh. 5. Rèn luyện cho bản thân một số kỷ năng thực hành, thí nghiệm, làm quen với phiơng pháp nghiên cứu khoa học. 3 Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Phần I: Tổng quan tài liệu I. Định nghĩa phân bón: Các chất đa vào đất có tác dụng trực tiếp cải thiện dinh dỡng của thực vật và cải thiện tính chất của đất- gọi là phân bón. Phân bón đợc chia làm hai nhóm: - Nhóm phân khoáng không chứa chất hữu cơ, bao gồm: phân nitơ, phôtphat, Kali, Magiê, phân hỗn hợp, phân Bo, phân Molipđen. - Phân hữu cơ gồm: phân chuồng, phân than bùn, phân xanh, phân rác. Ngoài ra còn có phân vi sinh đã bớc đầu đợc sử dụng để tăng cờng các quá trình sinh học trong đất và góp phần bảo vệ môi trờng. Ngoài tác dụng trực tiếp là tăng năng suất, phân bón có tác dụng rất lớn đến việc tạo ra nền đất thâm canh mà lâu nay ngời sử dụng ít chú ý tới. Những khiếm khuyết về chế độ dinh dỡng đất không thể bổ cứu đợc nếu chỉ biết đầu t lao động mà còn phải đầu t vật chất thông qua bón phân để nâng cao dự trữ dinh dỡng và mức dễ tiêu của các nguyên tố Nhiều nghiên cứu đã khẳng định: Năng suất cây trồng càng cao, lợng dinh dỡng cây lấy đi càng nhiều và nhu cầu phân bón càng lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón hoá học gây nguy cơ ô nhiễm môi tr- ờng, làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hởng không tốt đến chất lợng nông sản và cũng là nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hoá đất canh tác. Tồn d của các sản phẩm hoá học nàyđã và đang tích luỹ trong hệ sinh thái và trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với sức khoẻ con ngời và môi sinh. Chẳng hạn nh: phân chuồng và phân bắc không hợp vệ sinh gây ra nhiều bệnh về đờng hô hấp, tiêu hoá, ảnh h ởng đến sức khoẻ cộng đồng. 4 . cố định nitơ phân tử tồn tại trong đất ngô tại xã Hng Lợi Hng Nguyên Nghệ An 3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học cũng nh khả năng cố định nitơ tự. của vi khuẩn Clostridium cố định nitơ trong đất trồng ngô ở xã hng lợi - hng nguyên - nghệ an Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh Giáo vi n