IV. Phơng pháp nghiên cứu
4.8. Một số phơng pháp kiểm tra enzim
Dựa trên nguyên lý 1 gen – 1 men(enzim). ở đây cần phảI kiểm tra các enzim bằng các phơng pháp sau:
4.8.1. Phơng pháp thử hoạt tính phản ứng Catalaza.[11]: - Dựa vào cơ chế:
Catalaza
H2O H2O + 1/2 O2
- Lấy một ít khuẩn lạc của các chủng đã đợc phân lập, làm sạch, cho lên lam kính. Nhỏ một giọt H2O2.
+ Nếu phản ứng dơng tính sủi bọt thì đó là loài hiếu khí. + Nếu phản ứng âm tính không sủi bọt thì đó là loài kỵ khí. 4.8.2. Phơng pháp thử khả năng cố định Nitơ phân tử:
- Dựa trên nguyên lý của phơng pháp Kjeldahl – Nessler và Sapiro(1990).
- Từ các khuẩn lạc đã đợc tách riêng ta nhỏ một giọt thuốc thử Nessler. Sau đó đo đờng kính của khuẩn lạc(D).
Chủng xuất hiện màu vàng cam là chủng có khả năng cố định nitơ. 4.9. Phơng pháp xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng:
Nuôi các chủng trong môi trờng lỏng. Lấy 5ml môi trờng lỏng đã đợc khử trùng vào mỗi ống nghiệm + 4ml H2O cất + 1ml Nessler. Cho vào Cuvet
để đo màu. Theo dõi liên tục từ 3 – 7 ngày, đo phổ ở bớc sóng λ = 415 nm.
Nhờ đó mà ta tìm ra đợc chủng có khả năng cố định lớn nhất.
4.10. Chỉ tiêu thống kê theo Rumxki(1986) xử lý số liệu:
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan ∑ = = n i Xi n X 1 1 Trong đó: : Trị số trung bình cộng Xi: Giá trị thứ i của dãy biến số N: Số lần xuất hiện dãy biến số Độ lệch chuẩn: n X x n i i ∑ = − ± = 1 2 ) ( δ Với: n: Số lần thực hiện δ: Độ lệch chuẩn
V. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến khả năng đồng hoá nitơ:
Sau khi tìm đợc chủng có khả năng cố định cao nhất, ta nghiên cứu các nhân tố ảnh hởng đến quá trình sinh trởng và phát triển của chủng đó. Xác định số lợng vi sinh vật cần/ đơn vị nguyên liệu.
Và ứng dụng để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh.
5.1. ảnh hởng của pH:
Cho mỗi công thức thí nghiệm một chủng vi sinh vật nh nhau, cùng một môi trờng đã vô trùng, điều chỉnh PH ở các công thức khác nhau: pH = 4, pH
= 5, 6,7,8,9. Nuôi ở 300C.
Từ đó xác định khả năng cố định. Nếu pH tăng thì amôn tăng và tăng đến một lúc nào đó sẻ ngừng lại, đó sẽ là pH thích hợp.
5.2. ảnh hởng của nhiệt độ:
Khi biết đợc số lợng vi sinh vật cần có, pH thích hợp. Để theo dõi ảnh h- ởng của nhiệt độ đến khả năng cố định thì các công thức đợc thực hiện ở các
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
điều kiện nhiệt độ khác nhau: ở 200C, 300C, 400C, 500C, 600C. Từ đó đánh giá
kết quả và tìm ra đợc nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển.
5.3. ảnh hởng của độ ẩm (RH):
Để theo dõi ảnh hởng của độ ẩm đến khả năng cố định nitơ thì các công thức đợc thực hiện ở các điều kiện độ ẩm khác nhau: ở RH = 25%, 50%, 75% và 100%. Từ đó đánh giá kết quả và tìm ra đợc độ ẩm thích hợp cho vi khuẩn này phát triển.
5.4. ảnh hởng của thời gian:
Với số lợng vi sinh vật thích hợp, pH thích hợp, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp. Tiếp tục theo dõi ảnh hởng của thời gian đến khả năng cố định nitơ của vi khuẩn này.
Các công thhức để ở thời gian khác nhau: 1 ngày; 3 ngày; 6 ngày; 9 ngày. Từ đó xác định kết quả.
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Phần III : kết quả nghiên cứu
I. một số đặc điểm của khu vực nghiên cứu:
Khu vực lấy mẫu nghiên cứu là: xóm 6 – xã Hng Lợi – Hng Nguyên – Nghệ An, nằm ngay ven bờ sông Lam.
Hàng năm, các loại cây hoa màu nh: lạc, ngô, đậu, vừng đã đợc trồng đại trà theo mùa vụ và cho năng suất cao.
Theo phơng pháp phân tích thành phần cơ giới của đất, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng cách đem trộn mẫu đất nghiên cứu với một ít nớc và vê bằng tay. Kết quả cho thấy rằng: đây là đất phù sa (có độ dính,vê đợc thành thỏi).
Theo điều tra từ ngời dân: cụ thể vùng đất nghiên cứu có diện tích 500
m2/ 1 ruộng của nhà ông Ngô Văn Chín.
Khu vực nghiên cứu là vùng đất đa canh, trồng luân canh cây trồng. Và vùng đất này trớc đây cha dùng thuốc trừ sâu sinh học. Việc đầu t phân bón cho cây ngô nh sau:
+ Bón lót NPK với lợng bón (25- 30 kg/1 sào). + Bón thúc đạm trắng, Urê.
+ Không bón phân hữu cơ.
+ Vôi bột: 15 - 20 kg/2 lần bón để diệt sâu rễ cây, diệt sâu bọ.
+ Năng suất ngô đạt trung bình 2.5 tạ / sào. Chủ yếu trồng ngô đỏ
II. kết quả phân tích một số chỉ tiêu nông hoá:
2.1. với phơng pháp đã nêu ở trên, khi xác định pH ở đất trồng ngô chúng tôi thu đợc kết quả sau ( bảng 1):
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Bảng 1: pH của các mẫu đất nghiên cứu:
Vị trí nghiên cứu pH
Độ sâu 20 cm Độ sâu 30 cm
V1M1 6,73 6,64
V2M2 7,18 7,04
•nhận xét:
Qua bảng 1 cho thấy giá trị pH của các mẫu nghiên cứu chênh lệch không đáng kể. Dao động trong khoảng pH trung tính ( pH= 6,64 – 7,18). điều này cũng phù hợp với thực tế là điều kiện thổ nhỡng và điều kiện canh tác giữa các vị trí thu mẫu là gần tơng tự nhau.
Tuy nhiên, giá trị pH giữa 2 vị trí nghiên cứu lại khác nhau. So sánh pH theo độ sâu cho thấy: pH ở độ sâu 30 cm của 2 vị trí ( V1M1 và V2M2) đều thấp so với độ sâu 20 cm. Cho thấy: giá trị pH còn phụ thuộc vào các điều kiện khác của từng vị trí cụ thể. Và biểu đồ dới đây sẽ thấy rõ hơn về sự thay đổi của pH ( biểu đồ 1):
Hình 1: pH ở vùng đất trồng ngô Hng Lợi H– ng Nguyên Nghệ An.–
•Nhận xét qua đồ thị:
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Qua đó chứng tỏ trong điều kiện càng yếm khí thì vi sinh vật kỵ khí càng u thế.
2.2. Kết quả phân tích NH4+.
Trên cơ sở của phơng pháp đã nêu, tiến hành phân tích sau 5 ngày đo
phổ ở bớc sóng = 415nm, chúng tôI thu đợc kết quả ở bảng 2:
Ngày Hàm lợng NH4 + (mg/100g đất) P% 11/10/2006 13,2 0,0005 7,57 12/10/2006 13,7 0,0048 13/10/2006 13,9 0,0071 14/10/2006 14,2 0,0006 15/10/2006 12,9 0,0082
Qua bảng 2 cho ta thấy :
Hàm lợng amonium (NH4+) ở ngày phân tích đầu tiên (đất mới lấy về) là
13,2(mg NH4+/100g đất). Và sau đó tăng dần ở các ngày phân tích tiếp theo:
ngày thứ 2 là 13,7(mg NH4+/100g đất),ngày thứ 3 là 13,9(mg/100g đất), ngày
thứ 4 là14,2 (mg/100g đất). Và đặc biệt, ngày phân tích thứ 5 hàm lợng NH4+
có xu hớng giảm (12,9mg/100g đất). Qua đó đã cho thấy hàm lợng amonium đợc tích luỹ theo thời gian tuy nhiên, lợng amonium có xu hớng giảm dần trong ngày thứ 5, điều này hoàn toàn đúng với trong thực tế bởi với một lợng nguyên liệu đất trung bình (100g/1 bình) nh vậy thì khi vi khuẩn sử dụng hết nguồn dinh dỡng hữu cơ thì số lợng vi khuẩn giảm dần và tất nhiên hàm lợng
NH4+ cũng giảm theo .
Từ kết quả này càng cho thấy, bón phân hữu cơ không chỉ tăng độ phì nhiêu cho đất mà còn tạo cho đất vi sinh vật phát triển, tăng khả năng đồng hoá nitơ làm giàu dinh dỡng nitơ cho đất.
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Và biểu đồ dới đây (hình 2) sẽ thấy rõ hơn điều này.
Hình 2: Lợng amonium phân tích qua các ngày.
(hàm lợng (NH4+)
Qua hình 2 cho thấy:
- Lợng NH4+ tăng dần từ ngày thứ phân tích thứ 1 đến ngày thứ 4
và giảm dần từ ngày phân tích thứ 5.
- Hàm lợng NH4+ cao nhất ở ngày thứ 4 là: 14,2(mg/100g đất)
III. Kết quả định lợng vi khuẩn Clostridium trong mẫu đất:
Cơ sở của phơng pháp này là: mẫu đợc pha loãng thập phân, nuôi trong môi trờng thạch ở điều kiện thích hợp cho vi khuẩn mọc và hình thành khuẩn lạc. xác định số lợng khuẩn lạc và tính theo quy định FDA (những đĩa có số phân lạc từ 25 – 250).
•Theo phơng pháp đã trình bày ở mục II.4.3 theo kết quả ở bảng 3 ta tính đợc: Độ pha loãng: 10-4 10-5 đĩa 1: 82 160 ( khuẩn lạc) NH4
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Ta có: 82+160+64+66
A(CFU/g hay CFU/ml) =
10-4*2*1+10-5*2*1
= 9,3 *105 (CFU/ml).
IV. Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Clostridium:
Để có vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành phân lập theo quy trình sau:
Cân chính xác thành phần của môi trờng. ↓
Đun sôi, điều chỉnh pH =7. ↓
Cho vào 1/3 bình tam giác. ↓
Khử trùng ở 1 atm, trong thời gian 30' ↓
Cho vào petri ở tử cấy.
↓
Cấy huyền thù vi khuẩn lên đĩa petri. ↓
Trang đều. ↓
Nuôi ở 30º trong tủ ấm 3 -5 ngày. ↓
Quan sát và chụp ảnh.
Trong những điều kiện nuôi cấy nh nhau( môi trờng, pH, nhiệt độ, độ
ẩm, chúng tôi thu đ… ợc kết quả nh sau( bảng 3):
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Số đĩa ( nồng độ) Ngày nuôi Số khuẩn lạc mọc 20/10/0 6 21/10/06 22/10/06 23/10/06 24/10/06 1.10-4 2.10-4 8 10 82 160 47 20 57 64 66 51 3.10-5 4.10-5 5 23 96 145 40 9 17 24 29 32
Từ kết quả bảng trên cho thấy:
- Pha loãng ở nồng độ 10-4 và 10-5 có kết quả giống nhau là:
sau 4 ngày số khuẩn lạc ở nồng độ 10-5 là: 29 – 145 khuẩn lạc. Sau đó
thì số khuẩn lạc mọc thêm thì ít hơn:
+ ở nồng độ 10-4 là 47-51 khuẩn lạc.
+ ở nồng độ 10-5 là 32- 40 khuẩn lạc.
- Để có đợc nhiều khuẩn lạc mà phân tích, đánh giá, cần có đủ thời gian cho vi khuẩn mọc. Nh vậy mới có điều kiện xác định, tìm kiếm những chủng có ích.
Và, kết quả này sẽ thấy rõ ràng hơn (hình 3): Hình 3: Hình thành khuẩn lạc. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Số khuẩn lạc 20 21 22 23 24 Ngày d1 d2 d3 d4
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Và những khuẩn lạc này đợc ký hiệu là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, Cn6, Cn7 ,Cn8, Cn9, Cn8, Cn9, Cn10, Cn11, Cn12.
Nh vậy, qua bảng 3: sau một ngày khuẩn lạc đã xuất hiện số khuẩn lạc tăng nhanh chóng nhiều nhất sau 4 ngày nuôi cấy. Sau đó khuẩn lạc lại giảm dần do một số chủng không phát triển. Nh vậy số khuẩn lạc sinh trởng mạnh nhất vào ngày thứ 4 khi cấy vào môi trờng thạch đĩa.
Sau đó chọn các khuẩn lạc đứng riêng lẻ, cấy ria các chủng vi khuẩn vào đĩa petri chứa môi trờng thạch và các ống nghiệm nuôi ở nhiệt độ phòng. Từ đó tìm ra chủng thuần khiết. [13]
Kết quả đã tách đợc các chủng thuần khiết: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, Cn6, Cn7, Cn8, Cn9, Cn8, Cn9, Cn10, Cn11, Cn12, các chủng đợc lu giữ và có ảnh chụp tiêu bản.
V. Đặc điểm của các khuẩn lạc:
Khi nuôi cấy trong môi trờng có nhiều khuẩn lạc,xuất hiện đặc điểm các khuẩn lạc đó nh sau:
Bảng 9: Đặc điểm của các khuẩn lạc:
Đặc
điểm Cn1 Cn2 Cn3Các khuẩn lạcCn4 Cn6 Cn7
Màu sắc Trắng, đục Vàng Vàng Trắng sữa Trắng sữa Trắng đục
Hình
dáng Tròn, đều Tròn, đều Tròn, lồi Tròn, đều Tròn, lồi Tròn
Bờ khuẩn lạc mép bằng, phẳng mép bằng, phẳng mép không bằng, phẳng mép bằng phẳng mép không bằng phẳng mép bằng phẳng Cấu trúc đồng nhất đồng nhất Không đồng nhất đồng nhất đồng nhất Không đồng nhất
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Chúng tôi đã phân lập đợc 6 chủng Cn1,Cn2,Cn3,Cn4,Cn6,Cn7 có khả năng cố định nitơ phân tử. Chủng Cn4 và chủng Cn7 giảm đi trong quá trình nuôi giữ giống nên còn các chủng Cn1,Cn2,Cn3,Cn6 sẽ tiếp tục đợc nuôi giữ ở nhiệt độ phòng, sau đó giữ giống trong tủ lạnh.
Các ảnh đã phân lập đợc:
ảnh 1: ảnh 3: ảnh 5: ảnh 2: ảnh 4: ảnh 6:
VI. Kết quả khẳng định vi khuẩn Clostridium :
6.1 . Kết quả khi nuôi ống thạch sâu:
Mỗi chủng đợc nuôi trong 3 ống thạch sâu ở điều kiện nhiệt độ nh nhau
(30ºC ). Sau thời gian 5 –7 ngày kết quả cho thấy ở bảng 4:
Bảng 4: Đặc điểm phát triển của các chủng khi nuôi ống thạch sâu:
Chủng vi khuẩn
Sự phát triển của chủng (từ mặt thạch đến đáy ống thạch theo vết đâm sâu)
Cn1 Phát triển tốt Cn2 Phát triển tốt - tách đôi ống thạch Cn3 Phát triển tốt Cn4 Phát triển tốt – tách thạch Cn5 Phát triển đợc 1/2 ống thạch Cn6 Phát triển tốt – tách đôi ống thạch Cn7 Phát triển tốt Cn8 Phát triển yếu
Qua bảng 4 nhận thấy: Những chủng phát triển tốt – tách đôi thạch
sâu chứng tỏ đó loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium (6 chủng: Cn1, Cn2, Cn3,
Cn4, Cn6, Cn7). Còn một số chủng còn lại phát triển yếu hoặc phát triển bề mặt.
Những chủng nào phát triển tốt – làm tách đôi mặt thạch sâu –
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Kết quả phù hợp với phơng pháp nghiên cứu của Nguyễn Thành Đạt (1980).
6.2. Thử nghiệm trong môi trờng lỏng :
8 chủng đã đợc lựa chọn, tiếp tục thử nghiệm. Cấy vào môi trờng lỏng nuôi ở điều kiện nh nhau. Kết quả: Cả 8 chủng đều phát triển tốt ở phía dới đáy ống chứa môi trờng lỏng. Chứng tỏ đó là những loài kỵ khí.
6.3. Thử hoạt tính của Catalaza :
ở những chủng Clostridium pasteurianum kỵ khí không có gen
Catalaza. Thử hoạt tính của Catalaza bằng tác dụng phân giải hyđrô peroxit (H2O2). Dới tác dụng của enzim này, H2O2 phân giải tạo ra O2 bay lên (sủi bọt):
H2O2 Catalaza H2O + ẵ O2 ↑
Kết quả thu đợc ở bảng (bảng 5): “ + ” : Sủi bọt
“ - ” : Không sủi bọt
Bảng 5: Kết quả thử hoạt tính H2O2 :
chủng Hoạt tính H2O2 Chủng Hoạt tính H2O2
Cn1 - Cn5 +
Cn2 - Cn6 -
Cn3 - Cn7 -
Cn4 - Cn8 +
Qua bảng 5 nhìn thấy: có 2 chủng có hoạt tính Catalaza và 6 chủng không có hoạt tính Catalaza. Các chủng không sủi bọt khi cho phản ứng phân giải hyđrô perôxit chứng tỏ đó là những chủng kỵ khí 100% (Cn1;Cn2;Cn3;Cn4; Cn6;Cn7). Còn 2 chủng có phản ứng dơng tính (sủi bọt) - đó là những chủng không chắc chắn là loài kỵ khí hoặc rất có thể đó là những loài hiếu khí (chủng Cn5, Cn8).
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
VII. Sinh trởng của các chủng đã chọn:
Sinh trởng là một chỉ tiêu vô cùng quan trọng của vi sinh vật . Biết đợc quy luật sinh trởng của chúng mới điều chỉnh đợc chúng sinh trởng tiếp ứng đợc mục đích sử dụng. Thông thờng đờng cong sinh trởng vi khuẩn gồm các pha nh sau:
Pha (1): pha tiềm phát. Pha (3): pha cân bằng. Pha (2): pha luỹ thừa (pha log). Pha (4): pha suy vong. Số lợng (3) vi sinh vật (4) (2) (1) Thời gian Đờng cong sinh trởng của vi khuẩn thể hiện qua 4 pha: [8] và