Để có vi khuẩn sử dụng cho nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành phân lập theo quy trình sau:
Cân chính xác thành phần của môi trờng. ↓
Đun sôi, điều chỉnh pH =7. ↓
Cho vào 1/3 bình tam giác. ↓
Khử trùng ở 1 atm, trong thời gian 30' ↓
Cho vào petri ở tử cấy.
↓
Cấy huyền thù vi khuẩn lên đĩa petri. ↓
Trang đều. ↓
Nuôi ở 30º trong tủ ấm 3 -5 ngày. ↓
Quan sát và chụp ảnh.
Trong những điều kiện nuôi cấy nh nhau( môi trờng, pH, nhiệt độ, độ
ẩm, chúng tôi thu đ… ợc kết quả nh sau( bảng 3):
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Số đĩa ( nồng độ) Ngày nuôi Số khuẩn lạc mọc 20/10/0 6 21/10/06 22/10/06 23/10/06 24/10/06 1.10-4 2.10-4 8 10 82 160 47 20 57 64 66 51 3.10-5 4.10-5 5 23 96 145 40 9 17 24 29 32
Từ kết quả bảng trên cho thấy:
- Pha loãng ở nồng độ 10-4 và 10-5 có kết quả giống nhau là:
sau 4 ngày số khuẩn lạc ở nồng độ 10-5 là: 29 – 145 khuẩn lạc. Sau đó
thì số khuẩn lạc mọc thêm thì ít hơn:
+ ở nồng độ 10-4 là 47-51 khuẩn lạc.
+ ở nồng độ 10-5 là 32- 40 khuẩn lạc.
- Để có đợc nhiều khuẩn lạc mà phân tích, đánh giá, cần có đủ thời gian cho vi khuẩn mọc. Nh vậy mới có điều kiện xác định, tìm kiếm những chủng có ích.
Và, kết quả này sẽ thấy rõ ràng hơn (hình 3): Hình 3: Hình thành khuẩn lạc. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Số khuẩn lạc 20 21 22 23 24 Ngày d1 d2 d3 d4
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Và những khuẩn lạc này đợc ký hiệu là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, Cn6, Cn7 ,Cn8, Cn9, Cn8, Cn9, Cn10, Cn11, Cn12.
Nh vậy, qua bảng 3: sau một ngày khuẩn lạc đã xuất hiện số khuẩn lạc tăng nhanh chóng nhiều nhất sau 4 ngày nuôi cấy. Sau đó khuẩn lạc lại giảm dần do một số chủng không phát triển. Nh vậy số khuẩn lạc sinh trởng mạnh nhất vào ngày thứ 4 khi cấy vào môi trờng thạch đĩa.
Sau đó chọn các khuẩn lạc đứng riêng lẻ, cấy ria các chủng vi khuẩn vào đĩa petri chứa môi trờng thạch và các ống nghiệm nuôi ở nhiệt độ phòng. Từ đó tìm ra chủng thuần khiết. [13]
Kết quả đã tách đợc các chủng thuần khiết: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, Cn6, Cn7, Cn8, Cn9, Cn8, Cn9, Cn10, Cn11, Cn12, các chủng đợc lu giữ và có ảnh chụp tiêu bản.
V. Đặc điểm của các khuẩn lạc:
Khi nuôi cấy trong môi trờng có nhiều khuẩn lạc,xuất hiện đặc điểm các khuẩn lạc đó nh sau:
Bảng 9: Đặc điểm của các khuẩn lạc:
Đặc
điểm Cn1 Cn2 Cn3Các khuẩn lạcCn4 Cn6 Cn7
Màu sắc Trắng, đục Vàng Vàng Trắng sữa Trắng sữa Trắng đục
Hình
dáng Tròn, đều Tròn, đều Tròn, lồi Tròn, đều Tròn, lồi Tròn
Bờ khuẩn lạc mép bằng, phẳng mép bằng, phẳng mép không bằng, phẳng mép bằng phẳng mép không bằng phẳng mép bằng phẳng Cấu trúc đồng nhất đồng nhất Không đồng nhất đồng nhất đồng nhất Không đồng nhất
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Chúng tôi đã phân lập đợc 6 chủng Cn1,Cn2,Cn3,Cn4,Cn6,Cn7 có khả năng cố định nitơ phân tử. Chủng Cn4 và chủng Cn7 giảm đi trong quá trình nuôi giữ giống nên còn các chủng Cn1,Cn2,Cn3,Cn6 sẽ tiếp tục đợc nuôi giữ ở nhiệt độ phòng, sau đó giữ giống trong tủ lạnh.
Các ảnh đã phân lập đợc:
ảnh 1: ảnh 3: ảnh 5: ảnh 2: ảnh 4: ảnh 6:
VI. Kết quả khẳng định vi khuẩn Clostridium :
6.1 . Kết quả khi nuôi ống thạch sâu:
Mỗi chủng đợc nuôi trong 3 ống thạch sâu ở điều kiện nhiệt độ nh nhau
(30ºC ). Sau thời gian 5 –7 ngày kết quả cho thấy ở bảng 4:
Bảng 4: Đặc điểm phát triển của các chủng khi nuôi ống thạch sâu:
Chủng vi khuẩn
Sự phát triển của chủng (từ mặt thạch đến đáy ống thạch theo vết đâm sâu)
Cn1 Phát triển tốt Cn2 Phát triển tốt - tách đôi ống thạch Cn3 Phát triển tốt Cn4 Phát triển tốt – tách thạch Cn5 Phát triển đợc 1/2 ống thạch Cn6 Phát triển tốt – tách đôi ống thạch Cn7 Phát triển tốt Cn8 Phát triển yếu
Qua bảng 4 nhận thấy: Những chủng phát triển tốt – tách đôi thạch
sâu chứng tỏ đó loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium (6 chủng: Cn1, Cn2, Cn3,
Cn4, Cn6, Cn7). Còn một số chủng còn lại phát triển yếu hoặc phát triển bề mặt.
Những chủng nào phát triển tốt – làm tách đôi mặt thạch sâu –
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Kết quả phù hợp với phơng pháp nghiên cứu của Nguyễn Thành Đạt (1980).
6.2. Thử nghiệm trong môi trờng lỏng :
8 chủng đã đợc lựa chọn, tiếp tục thử nghiệm. Cấy vào môi trờng lỏng nuôi ở điều kiện nh nhau. Kết quả: Cả 8 chủng đều phát triển tốt ở phía dới đáy ống chứa môi trờng lỏng. Chứng tỏ đó là những loài kỵ khí.
6.3. Thử hoạt tính của Catalaza :
ở những chủng Clostridium pasteurianum kỵ khí không có gen
Catalaza. Thử hoạt tính của Catalaza bằng tác dụng phân giải hyđrô peroxit (H2O2). Dới tác dụng của enzim này, H2O2 phân giải tạo ra O2 bay lên (sủi bọt):
H2O2 Catalaza H2O + ẵ O2 ↑
Kết quả thu đợc ở bảng (bảng 5): “ + ” : Sủi bọt
“ - ” : Không sủi bọt
Bảng 5: Kết quả thử hoạt tính H2O2 :
chủng Hoạt tính H2O2 Chủng Hoạt tính H2O2
Cn1 - Cn5 +
Cn2 - Cn6 -
Cn3 - Cn7 -
Cn4 - Cn8 +
Qua bảng 5 nhìn thấy: có 2 chủng có hoạt tính Catalaza và 6 chủng không có hoạt tính Catalaza. Các chủng không sủi bọt khi cho phản ứng phân giải hyđrô perôxit chứng tỏ đó là những chủng kỵ khí 100% (Cn1;Cn2;Cn3;Cn4; Cn6;Cn7). Còn 2 chủng có phản ứng dơng tính (sủi bọt) - đó là những chủng không chắc chắn là loài kỵ khí hoặc rất có thể đó là những loài hiếu khí (chủng Cn5, Cn8).
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
VII. Sinh trởng của các chủng đã chọn:
Sinh trởng là một chỉ tiêu vô cùng quan trọng của vi sinh vật . Biết đợc quy luật sinh trởng của chúng mới điều chỉnh đợc chúng sinh trởng tiếp ứng đợc mục đích sử dụng. Thông thờng đờng cong sinh trởng vi khuẩn gồm các pha nh sau:
Pha (1): pha tiềm phát. Pha (3): pha cân bằng. Pha (2): pha luỹ thừa (pha log). Pha (4): pha suy vong. Số lợng (3) vi sinh vật (4) (2) (1) Thời gian Đờng cong sinh trởng của vi khuẩn thể hiện qua 4 pha: [8] và [12].
Đôi khi sau khi cấy vào môi trờng mới, các vi khuẩn không sinh sản ngay trong một thời gian nào đó. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân, chẳng hạn khi lấy bào tử dạng tiền sinh thì phải cần một thời gian nhất định để cho chúng nảy mầm.
Trong vài giờ đầu, các tế bào cấy vào còn cha thích nghi với các điều kiện môi trờng hoặc đang biến đổi các điều kiện ấy theo những hớng cần thiết. Thời kỳ kìm hãm sinh trởng ban đầu này - đợc gọi là tiền phát.
Cuối pha này tế bào bắt đầu sinh trởng với tốc độ tăng dần (quá trình sinh trởng quả tế bào bắt đầu sớm hơn quá trình sinh sản). Sau pha này là thời
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
kỳ vi khuẩn sinh trởng với tốc độ riêng không đổi sau một khoảng thời gian xác định số lợng tế bào tăng lên gấp đôi. [9].
Việc xác định quá trình sinh trởng của các tế bào riêng biệt nuooi cấy trên môi trờng đặc. Vi khuẩn khi sinh trờng đặc sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trng cho loài đó. Vì vậy ta có thể đo kích thớc của từng khuẩn lạc riêng biệt để xem tốc độ sinh trởng của các khuẩn lạc đó nhanh hay chậm.
Và khi nghiên cứu vi khuẩn ngời ta thờng nghiên cứu sinh trởng của quần thể. Quá trình sinh trởng khi đạt đến một mức độ nhất định sẽ hình thành sự sinh sản khi đó số lợng có thể tăng lên.
Vì vậy việc miêu tả các khuẩn lạc và xác dịnh tốc độ sinh trởng của vi khuẩn là moọt trong các việc rất cần thiết đối với công tác định tên loài vi sinh vật nghiên cứu và có thể tính đợc số thé hệ và dự đoán đợc số lợng tế bào sau một thời gian nuôi cấy nhất định.từ đó đa ra ứng dụng trong sản xuất.
Theo dõi sinh trởng của vi khuẩn bằng cách xác định kích thớc (φ)
khuẩn lạc (sau 3 ngày 1 lần). Kết quả thu đợc ở bảng 8:
Bảng 8: Sinh trởng cuẩ các chủng:
Ngày
Đờng kính các khuẩn lạc φ(nm)
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7
01/12/06 0,7 1,0 1,2 0,9 1,5 1,5
04/12/06 1,4 2,2 2,6 1,9 2,9 3,5
P(%) 100 120 116 111 93 133
Nh vậy qua bảng 8 ta nhận thấy: chủng có độ sinh trởng mạnh nhất là Cn7 , sau đó đến chủng Cn2, Cn3, Cn4, Cn1 và cuối cùng là chủng Cn6 có tốc độ sinh trởng yếu hơn. Sự sinh trởng sau 3 ngày ở chủng Cn1 là 100%, Cn2 là 120%, Cn3 là 160%, Cn4 là 111%, Cn6 là 93% và Cn7 là 133%. Nên ta có thể phân lập và sử dụng chủng sinh trởng mạnh Cn7 vào thực tiễn để làm các thí nghiệm.
VIII. Khả năng cố định nitơ phân tử của các chủng :
Các chủng đợc nuôi trên môi trờng đĩa thạch yếm khí ở cùng một điều kiện (nhiệt độ, độ ẩm, pH, thử hoạt tính cố định nitơ sau ( sau 24h). Đo đờng kính vùng có phản ứng với:
D: Đờng kính vòng vàng cam (phản ứng của NH3) (nm).
d: Đờng kính của vòng vàng nhạt (phản ứng của prôtêin) (nm). Bằng Digital micrometer. Tính các sai dị, kết quả thu đợc ở bảng 6 :
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan Thời gian (24 h) Các chủng D (nm) d (nm) D - d (nm) D (%) Ngày 18/11/2006 Cn1 2,5 1,3 1,2 48,00 Cn2 3,6 1,2 2,4 66,67 Cn3 2,7 1,1 1,6 59,25 Cn4 2,1 1,2 0,9 42,85 Cn6 3,2 1,4 1,8 56,25 Cn7 3,3 2,2 1,1 33,33
Qua bảng 6 cho ta thấy: hiệu số D –d của chủng Cn2 là lớn nhất (2,4nm) chứng tỏ chủng này có khả năng cố định nitơ phân tử lớn nhất. Các chủng có khả năng cố định nitơ thấp hơn (1,6 và 1,8 nm) là: Cn3;Cn4; Cn7. Còn lại chủng Cn1, Cn7 có khả năng cố định nitơ yếu nhất (1,1 và 1,2 nm).
IX. Xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng :
Quá trình đồng hoá nitơ phân tử là quá trình biến đổi từ N2 → NH3 nhờ
enzim vi sinh vật. Để đánh giá khả năng đồng hoá của các chủng, tôi đã xác định lợng amon thu đợc trong dịch nuôi bằng phơng pháp đã trình bày ở trên. Qua theo dõi và đo liên tiếp ngày 1 lần.
Sau 5 ngày kết quả thu đợc nh bảng sau (bảng 7) :
Bảng 7 : Hàm lợng NH4+ đồng hoá đợc của các chủng : Ngày đo Chủng Lợng NH4+ (mg/100ml dung dịch) Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 20/11/2006 0,81 0,88 0,82 0,35 0,84 0,86
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan 21/11/2006 0,90 0,97 0,95 0,49 0,74 0,89 22/11/2006 0,98 1,05 0,99 0,53 0,87 0,84 23/11/2006 1,87 1,97 1,69 1,45 1,23 1,69 24/11/2006 1,24 1,55 1,60 1,31 1,09 1,49 Trung bình 1,16 1,28 1,21 0,82 0,95 1,15
Qua bảng 7 nhận thấy: lợng NH4+ thu đợc sau 5 ngày đo liên tục cho ta
thấy: lợng NH4+ cao nhất chủng Cn2 va Cn3 (1,28 và 1,21). Sau đó là chủng
Cn1 và Cn7 (1,16 và 1,15) ở mức trung bình.Còn 2 chủng có lợng NH4+ thấp
nhất là: Cn4 và Cn6 (0,82 và 0,95 mg NH4+/50ml dịch). Nhìn chung, các
chủng đều có khả năng cố định cao nhất ở ngày thứ 3 và thứ 4 nuôi trong môi trờng lỏng. Sau đó giảm dần ở ngày thứ 5 và những ngày sau đó. Điều này đúng với thực tế: khi đó lợng chất dinh dỡng trong môi trờng giảm dần nên khả năng cố định của chúng cũng giảm dần.
Theo T.S Nguyễn Thành Đạt, T.S Nguyễn Lân Dũng (1978, 1981) ở
Clostridium pasteurianum hoạt tính cố định nitơ của nó là 10 – 12mg nitơ khi sử dụng hết 1g chất hữu cơ. Điều này có ý nghĩa thiết thực trong việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh.
Nh vậy từ chủng có khả năng cố định lớn nhất là: Cn2,chúng tôi lựa chọn chủng này để thực hiện nghiên cứu tiếp theo.
X. Các yếu tố ảnh hởng đến sự cố định nitơ phân tử : 10.1. ảnh hởng của pH : 10.1. ảnh hởng của pH :
pH có ảnh hởng đến đời sống vi sinh vật,đặc biệt ảnh hởng đến trạng thái iôn hoá bề mặt enzim làm thay đổi hoạt tính enzim cũng nh khả năng cố định nitơ phân tử. Theo dõi ảnh hởng của pH đến biểu hiện bằng sự tích luỹ amon hoá trong môi trờng nuôi ở chủng Cn2 thu đợc kết quả ở bảng 11:
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Bảng 11: ảnh hởng của pH đối với đồng hoá nitơ:
Hình 3: Liên quan giữa pH và hàm lợng Amôn
Độ pH (mg/100 ml dịch chủng Cn2)Hàm lợng NH4+ pH = 4 1,08 pH =5 1,14 pH =6 1,26 pH =7 2,90 pH =8 1,90
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Qua bảng 11 và biểu đồ cho thấy: khả năng cố định nitơ trong điều kiện pH khá rộng từ axit đến kiềm:
ở pH = 4 lợng amôn là 1,08 ở pH = 8 lợng amôn là 1,90
Chủng vi khuẩn này phát triển tốt nhất cũng nh khả năng cố định nitơ
lớn nhất của nó là ở: pH =6 – 7 với lợng amôn là 1,26 ( mg NH4+ /100 ml
dịch chủng ) và 2,90 ( mg NH4+ mg/100 ml dịch chủng nuôi ) và kết quả thu
đợc tố nhất ở pH =7 đó chính là pH thích hợp nhất cho vi khuẩn này phát triển .
Nh vậy: trong điều kiện pH thay đổi vi khuẩn này vẫn có khả năng cố định nitơ. Và, pH thích hợp nhất cho vi khuẩn này là pH =7. Điều này khá phù hợp với kỹ thuật phân bón phân hữu cơ và bón vôi trong trồng trọt – tạo dinh dỡng cho cả vi sinh vật và điều kiện pH thích hợp cho vi sinh vật phát triển .
10.2. ảnh hởng của nhiệt độ :
Nhiệt độ có vai trò lớn trong phản ứng enzim. Và vì thế nó cũng ảnh h- ởng lớn đến Nitrogenaza xúc tác cho quá trình biến đổi nitơ phân tử thành amôn.
Với pH tối u, tiếp tục nghiên cứu về ảnh hởng của nhiệt độ và mối liên quan của nhiệt độ với hàm lợng amôn để từ đó tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình cố định nitơ. Với phơng pháp đã trình bày ở trên, những số liệu phân tích đợc nêu ra trong bảng (bảng 12):
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị Thu Lan
Bảng 12 : ảnh hởng của nhiệt độ đối với đồng hoá nitơ :
Nhiệt độ ( 0C ) Hàm lợng NH4 + (mg/100 ml dịch chủngCn2) 20 1,00 30 1,56 40 2,74 50 1,38 60 0,94 Qua bảng 12 nhận thấy: + ở nhiệt độ 30ºC hàm lợng amôn là 1,56 + ở nhiệt độ 40ºC hàm lợng amôn là 2.74 + ở nhiệt độ 50ºC hàm lợng amôn là 1,38.
Chủng này phát triển mạnh nhất và có khả năng cố định cao nhất ở
nhiệt độ 20 - 40ºC, đặc biệt là ở 40ºC(2,74mg/100ml dịch chủng) và phát triển
yếu ở <20ºC và > 60ºC. Chứng tỏ loài vi khuẩn này không sống đợc ở những
nơi khô hạn. Điều này chứng minh cho thực tế : Vùng đất ven bờ Sông Lam
này là một hệ sinh thái thích hợp cho loài vi khuẩn Clostridium
K
hóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học sinh học - Sinh viên Lê Thị