Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn clostridium cố định nito trong đất trồng ngô của xã hưng lợi, hưng nguyên, nghệ an

Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học vinh Khoa Sinh học  - Lê thị thu lan Đề tài: Bước đầu nghiên cứu số đặc điểm vi khuẩn Clostridium cố định nitơ đất trồng ngô xã hưng lợi - hưng nguyên - nghệ an Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh Giáo viên hướng dẫn - GVC: Nguyễn Vinh - 2007 1 Dương Tuệ Lời cảm ơn Luận văn thực đạt kết nhờ vào phần nỗ lực, cố gắng, mệt mài, nghiêm túc công tác nghiên cứu khoa học thân Cũng suốt trình thực hiện, nhận giúp đỡ thầy cô giáo, người thân bạn bè Trước hết xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ tận tình, chu đáo giúp đỡ suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Sinh học, phòng thí nghiệm Di truyền – Vi sinh – Phương pháp, phòng thí nghiệm Hoá sinh trường Đại Học Vinh tất bạn bè, người thân giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực Đặc biệt, qua xin chân thành cảm ơn nhân dân, cán xóm 6- xã Hưng Lợi tận tình giúp đỡ để luận văn hoàn thành Tuy có nhiều cố gắng, song thân đề tài tránh khỏi thiéu sót Tôi mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn! Sinh viên: Lê Thị Thu Lan Lớp:43E1 Sinh 2 mục lục Mở Đầu…………………………………………………………… Đặt vấn đề …………………………………………………… Mục tiêu đề tài ……………………………………………….… Phần I: Tổng quan tài liệu …………………………………………… I Định nghĩa phân bón ………………………….…….……… …4 II Phân bón vi sinh vật ………… ………………………… III Tình hình nghiên cứu nước ………………………… … 3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh ……………………… 3.2 ứng dụng thực tiễn phân bón vi sinh học Việt Nam … 3.3 Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum ………… IV Đặc điểm chung vi khuẩn Clostridium pasteurianum …… V Đặc điểm bào tử ……………………………………………… VI Vòng tuân hoàn nitơ tư nhiên…………………………… VII Cơ chế trình cố định nitơ phân tử………………… .11 Phần II: Đối tượng, nội dung, phương pháp, địa điểm thời gian nghiên cứu………………………………………………………………15 I Đối tượng nghiên cứu ………………………………… 15 II Thời gian nghiên cứu ………………………………… 15 III Địa điểm phương pháp thu mẫu …………………… 15 IV Phương pháp nghiên cứu ……………………………… 16 4.1 Phương pháp phân tích số tiêu nông hoáthổ nhưỡng………………………………………… 16 4.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ………………… 17 4.3 Phương pháp xác định vi sinh vật ……………… 4.4 Phương pháp phân lập …………………………… 18 18 4.5 Phương pháp theo dõi tiêu sinh trưởng phát triển……………………………………………… 19 4.6 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Clostridium ……………………………………………… 20 4.7 Một số phương pháp khác ……………………………20 4.8 Một số phương pháp kiểm tra enzim………………….21 4.9 phương pháp xác định khả đồng hoá nitơ chủng…………………………………………………22 4.10 phương pháp xử lý số liệu……………………………22 V Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả đồng hoá nitơ……………………………………………………….… 23 5.1 ảnh hưởng pH……………………………….……23 5.2 ảnh hưởng nhiệt độ…………………………… 23 5.3 ảnh hưởng độ ẩm……………………………… 23 5.4 ảnh hưởng thời gian………………………….… 23 Phần III: Kết nghiên cứu …………………………… 25 I Một số đặc điểm khu vực nghiên cứu …………… 25 II Kết qủa phân tích số tiêu nông hoá ………… 25 Kết xác định pH ………………………… 25 Kết phân tích NH4+trong đất…………… 27 III Kết định lượng vi khuẩn Clostridium mẫu đất…… IV Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Clostridium ………… … 29 V Đặc điểm khuẩn lạc …………………………………… … 31 VI Kết khẳng định vi khuẩn Clostridium…………… … 32 6.1 Kết nuôi ống thạch sâu…………………… 32 6.2 Thử nghiệm môi trường lỏng ……………….…33 6.3 Thử hoạt tính catalaza ………………………… 33 4 VII Sinh trưởng chủng chọn……………………….33 VIII Khả cố định nitơ phân tử chủng …………35 IX Xác định khả đồng hoá nitơ chủng…… 36 X Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định nitơ phân tử …….37 ảnh hưởng pH ……………………… ……………38 ảnh hưởng nhiệt độ ……………………………… 39 ảnh hưởng độ ẩm ………………………….……….41 ảnh hưởng thời gian ……………………….………42 XI Số lượng vi khuẩn cần sử dụng ………………….… 44 - 45 kết luận kiến nghị I II Kết luận ……………………………………… Kiến nghị ……………………………………… Tài liệu tham khảo……………………… ….49 - 50 5 46 48 Mở đầu Đặt vấn đề: Vi sinh vật có vai trò quan trọng trình hình thành phát triển đất trình sinh trưởng phát triển trồng: vi sinh vật tham gia vào trình hình thành mùn làm cho đất tơi xốp, tăng khả giữ độ ẩm cho đất, tác dụng trực tiếp đến phân giải khoáng hoá hợp chất hữu cơ, nhóm vi sinh vật có khả cố định nitơ khí Nhờ đặc tính vi sinh vật kết hợp với chất mang để sản xuất phân bón sinh học làm tăng độ màu mỡ đất nâng cao chất lượng trồng Vi sinh vật cố định nitơ vi sinh vật có khả sử dụng nitơ phân tử khử thành NH3 Có nhóm có khả cố định nitơ phân tử là: nhóm sống cộng sinh nhóm sống tự Trong nhóm sống tự cố loài hiếu khí, kỵ khí vi khuẩn lam Và loài vi sinh vật có ý nghĩa không nhỏ trình cố định nitơ phân tử cho hệ sinh thái đất vi khẩn kỵ khí Clostridium pasteurianum [7] Clostridium pasteurianum loài vi khuẩn kỵ khí, sinh bào tử ,có khả cố định nitơ cao Khi đồng hoá hết 1g thức ăn cácbon, chúng tích luỹ khoảng – 10(mg) nitơ.[7] Do hiểu biết loài vi kkhuẩn hệ sinh thái đất cần thiết Vi sinh vật có tác dụng tốt đói với tính chất lý hoá sinh họccủa đất, tham gia trình chuyển hoá hợp chất hữu cơ, chất khoáng góp phần nâng cao dinh dưỡng đất đồng thời vi sinh vật có tác dụng bảo vệ môi trường sinh thái Bên cạnh giá trị thiết thực cho nông nghiệp, phân bón vi sinh kiến tạo nông nghiệp 6 ổn định, bền vững gắn liền với nông nghiêp hữu Việc sản xuất phân bón sinh học góp phần giảm bớt nguy ô nhiễm môi trường, đồng thời trả lại cho đất mà lấy Cây ngô (zemay SL) lương thực có giá trị kinh tế không nhỏ nông nghiệp nước ta nói riêng số nước giới, nguồn nuôi sống 1/3 số dân toàn giới Cây ngô có nguồn gốc từ loại hoang dại miền trung nước Mêhicô nước ta ngô lương thực đứng thứ hai sau lúa với diện tích tăng dần qua năm đến năm 2010 đạt 750.000 Từ trước tới nay, ngô loài lương thực đặc trưng nước ta số vùng dân cư ven sông Lam huyện Hưng Nguyên nói riêng [3] Sông Lam sông lớn Nghệ An hàng năm bồi đắp lượng phù sa lớn cho vùng đất nơi khu vực Hưng Nguyên, Nam Đàn Đây điều kiện tốt, thuận lợi để phát triển nghề trồng ngô số loài khác như: lạc, đỗ, vừng, vai trò cố định nitơ vùng đất chưa nghiên cứu Để tìm hiểu chất dinh dưỡng đất tìm hiểu khả cố định nitơ phân tử, tạo màu mỡ cho đất nơi việc tìm kiếm, phân lập, tuyển chọn chủng loài vi khuẩn kỵ khí Clostridium giúp chúng tacó thể xác định khả cung cấp phân đạmcho cây, biết lượng nitơ cần thiết diệnn tích cụ thể,có thể xác định nhu cầu cung cấp thêm phân vi sinh cố định nitp - đạm sinh học, xác định lượng bón phân cân đối hợp lý để nâng cao suất ngô Đồng thời góp phần vào việc điều tra khai thác tài nguyên sinh vật có ích phục vụ sản xuất 7 II Mục tiêu đề tài: Chúng tiến hành nghiên cứu vấn đề nhằm: Điều tra tình hình sản xuất ngô địa phương Hưng Lợi – Hưng Nguyên – Nghệ An kỷ thuật canh tác, tình hình sử dụng loại phân bón, suất, … Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Clostridium có khả cố định nitơ phân tử tồn đất ngô xã Hưng Lợi – Hưng Nguyên – Nghệ An Nghiên cứu số đặc điểm sinh học khả cố định nitơ tự Và lựa chọn chủng Clostridium pasteurianum có khả cố định nitơ lớn Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố điều kiện sống như, độ ẩm, pH đến đời sống chủng chọn Từ đưa trị số tối ưu để ứng dụng vào sản suất phân đạm vi sinh Rèn luyện cho thân số kỷ thực hành, thí nghiệm, làm quen với phưiơng pháp nghiên cứu khoa học 8 Phần I: Tổng quan tài liệu I Định nghĩa phân bón: Các chất đưa vào đất có tác dụng trực tiếp cải thiện dinh dưỡng thực vật cải thiện tính chất đất- gọi phân bón Phân bón chia làm hai nhóm: - Nhóm phân khoáng không chứa chất hữu cơ, bao gồm: phân nitơ, phôtphat, Kali, Magiê, phân hỗn hợp, phân Bo, phân Molipđen - Phân hữu gồm: phân chuồng, phân than bùn, phân xanh, phân rác Ngoài có phân vi sinh bước đầu sử dụng để tăng cường trình sinh học đất góp phần bảo vệ môi trường Ngoài tác dụng trực tiếp tăng suất, phân bón có tác dụng lớn đến việc tạo đất thâm canh mà lâu người sử dụng ý tới Những khiếm khuyết chế độ dinh dưỡng đất bổ cứu biết đầu tư lao động mà phải đầu tư vật chất thông qua bón phân để nâng cao dự trữ dinh dưỡng mức dễ tiêu nguyên tố Nhiều nghiên cứu khẳng định: Năng suất trồng cao, lượng dinh dưỡng lấy nhiều nhu cầu phân bón lớn Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón hoá học gây nguy ô nhiễm môi trường, làm giảm khả chống chịu trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng nông sản nguyên nhân tất yếu dẫn đến thoái hoá đất canh tác Tồn dư sản phẩm hoá học nàyđã tích luỹ hệ sinh thái trở thành mối đe doạ nghiêm trọng sức khoẻ người môi sinh 9 Chẳng hạn như: phân chuồng phân bắc không hợp vệ sinh gây nhiều bệnh đường hô hấp, tiêu hoá,…ảnh hưởng đến sức khoẻ cộng đồng Phân vô thuộc nhóm chua sinh lý: K 2SO4, (NH4)2SO4, Supe lân tồn dư axit làm chua hoá đất, dẫn đến làm nghèo kiệt ion bazơ làm xuất nhiều chất độc mà chủ yếu là: Al 3+, Fe2+, Mn2+ di động có hại cho cây, làm giảm hoạt tính sinh lý đất Ngoài bón nhiều đạm bón muộn phân đạm cho rau làm tăng đáng kể hàm lượng NO3- hại đến sức khoẻ người Do việc sử dụng phân bón vi sinh vật có tác dụng nâng cao suất chất lượng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô góp phần quan trọng bảo vệ môi trường, xây dựng nông nghiệp bền vững [2] II Phân bón vi sinh vật: Phân bón vi sinh vật phân bón chứa nhiều chủng vi sinh vật sống, hữu hiệu tuyển chọn mà hoạt động chúng có tác dụng tạo đất trồng chất dinh dưỡng chất sinh học có tác dụng nâng cao suất trồng, chất lượng nông sản cải tạo đất Phân bón vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến người, vật nuôi môi trường sinh thái [17] Các loại phân bón vi sinh kể đến phân vi sinh vật cố định nitơ- đạm sinh học Và đề tài hướng tới khả ứng dụng phân bón vi sinh cố định nitơ phân tử đơn chủng với loài vi khuẩn Clostridium pasteurianum III Tình hình nghiên cứu nước: 3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh: 10 10 Bảng 8: Sinh trưởng cuẩ chủng: Đường kính khuẩn lạc φ(nm) Ngày Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 01/12/06 0,7 1,0 1,2 0,9 1,5 1,5 04/12/06 1,4 2,2 2,6 1,9 2,9 3,5 P(%) 100 120 116 111 93 133 Như qua bảng ta nhận thấy: chủng có độ sinh trưởng mạnh Cn7 , sau đến chủng Cn2, Cn3, Cn4, Cn1 cuối chủng Cn6 có tốc độ sinh trưởng yếu Sự sinh trưởng sau ngày chủng Cn 100%, Cn2 120%, Cn3 160%, Cn4 111%, Cn6 93% Cn7 133% Nên ta phân lập sử dụng chủng sinh trưởng mạnh Cn vào thực tiễn để làm thí nghiệm VIII Khả cố định nitơ phân tử chủng : Các chủng nuôi môi trường đĩa thạch yếm khí điều kiện (nhiệt độ, độ ẩm, pH, thử hoạt tính cố định nitơ sau ( sau 24h) Đo đường kính vùng có phản ứng với: D: Đường kính vòng vàng cam (phản ứng NH3) (nm) d: Đường kính vòng vàng nhạt (phản ứng prôtêin) (nm) Bằng Digital micrometer Tính sai dị, kết thu bảng : 40 40 Bảng : Thời gian Kết đo D d (nm) So sánh D d : Các D d D-d D (%) (24 h) Ngày 18/11/2006 chủng Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 (nm) 2,5 3,6 2,7 2,1 3,2 3,3 (nm) 1,3 1,2 1,1 1,2 1,4 2,2 (nm) 1,2 2,4 1,6 0,9 1,8 1,1 48,00 66,67 59,25 42,85 56,25 33,33 Qua bảng cho ta thấy: hiệu số D –d chủng Cn lớn (2,4nm) chứng tỏ chủng có khả cố định nitơ phân tử lớn Các chủng có khả cố định nitơ thấp (1,6 1,8 nm) là: Cn 3;Cn4; Cn7 Còn lại chủng Cn1, Cn7 có khả cố định nitơ yếu (1,1 1,2 nm) IX Xác định khả đồng hoá nitơ chủng : Quá trình đồng hoá nitơ phân tử trình biến đổi từ N → NH3 nhờ enzim vi sinh vật Để đánh giá khả đồng hoá chủng, xác định lượng amon thu dịch nuôi phương pháp trình bày Qua theo dõi đo liên tiếp ngày lần Sau ngày kết thu bảng sau (bảng 7) : 41 41 Bảng : Hàm lượng NH4+ đồng hoá chủng : Chủng Ngày đo Lượng NH4+ (mg/100ml dung dịch) Cn1 Cn2 Cn3 Cn4 Cn6 Cn7 20/11/2006 0,81 0,88 0,82 0,35 0,84 0,86 21/11/2006 0,90 0,97 0,95 0,49 0,74 0,89 22/11/2006 0,98 1,05 0,99 0,53 0,87 0,84 23/11/2006 1,87 1,97 1,69 1,45 1,23 1,69 24/11/2006 1,24 1,55 1,60 1,31 1,09 1,49 Trung bình 1,16 1,28 1,21 0,82 0,95 1,15 Qua bảng nhận thấy: lượng NH4+ thu sau ngày đo liên tục cho ta thấy: lượng NH4+ cao chủng Cn2 va Cn3 (1,28 1,21) Sau chủng Cn1 Cn7 (1,16 1,15) mức trung bình.Còn chủng có lượng NH4+ thấp là: Cn4 Cn6 (0,82 0,95 mg NH4+/50ml dịch) Nhìn chung, chủng có khả cố định cao ngày thứ thứ nuôi môi trường lỏng Sau giảm dần ngày thứ ngày sau Điều với thực tế: lượng chất dinh dưỡng môi trường giảm dần nên khả cố định chúng giảm dần Theo T.S Nguyễn Thành Đạt, T.S Nguyễn Lân Dũng (1978, 1981) Clostridium pasteurianum hoạt tính cố định nitơ 10 – 12mg nitơ sử dụng hết 1g chất hữu Điều có ý nghĩa thiết thực việc sử dụng phân bón hữu vi sinh Như từ chủng có khả cố định lớn là: Cn 2,chúng lựa chọn chủng để thực nghiên cứu X Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định nitơ phân tử : 42 42 10.1 ảnh hưởng pH : pH có ảnh hưởng đến đời sống vi sinh vật,đặc biệt ảnh hưởng đến trạng thái iôn hoá bề mặt enzim làm thay đổi hoạt tính enzim khả cố định nitơ phân tử Theo dõi ảnh hưởng pH đến biểu tích luỹ amon hoá môi trường nuôi chủng Cn thu kết bảng 11: Bảng 11: ảnh hưởng pH đồng hoá nitơ: Độ pH pH = pH =5 pH =6 pH =7 pH =8 Hàm lượng NH4+ (mg/100 ml dịch chủng Cn2) 1,08 1,14 1,26 2,90 1,90 Hình 3: Liên quan pH hàm lượng Amôn Qua bảng 11 biểu đồ cho thấy: khả cố định nitơ điều kiện pH rộng từ axit đến kiềm: pH = lượng amôn 1,08 pH = lượng amôn 1,90 Chủng vi khuẩn phát triển tốt khả cố định nitơ lớn ở: pH =6 – với lượng amôn 1,26 ( mg NH 4+ /100 ml dịch chủng ) 2,90 ( mg NH4+ mg/100 ml dịch chủng nuôi ) kết 43 43 thu tố pH =7 pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển Như vậy: điều kiện pH thay đổi vi khuẩn có khả cố định nitơ Và, pH thích hợp cho vi khuẩn pH =7 Điều phù hợp với kỹ thuật phân bón phân hữu bón vôi trồng trọt – tạo dinh dưỡng cho vi sinh vật điều kiện pH thích hợp cho vi sinh vật phát triển 10.2 ảnh hưởng nhiệt độ : Nhiệt độ có vai trò lớn phản ứng enzim Và ảnh hưởng lớn đến Nitrogenaza xúc tác cho trình biến đổi nitơ phân tử thành amôn Với pH tối ưu, tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ mối liên quan nhiệt độ với hàm lượng amôn để từ tìm nhiệt độ thích hợp cho trình cố định nitơ Với phương pháp trình bày trên, số liệu phân tích nêu bảng (bảng 12): Bảng 12 : ảnh hưởng nhiệt độ đồng hoá nitơ : Nhiệt độ ( 0C ) 20 30 40 50 60 44 Hàm lượng NH4+ (mg/100 ml dịch chủngCn2) 1,00 1,56 2,74 1,38 0,94 44 Qua bảng 12 nhận thấy: + nhiệt độ 30ºC hàm lượng amôn 1,56 + nhiệt độ 40ºC hàm lượng amôn 2.74 + nhiệt độ 50ºC hàm lượng amôn 1,38 Chủng phát triển mạnh có khả cố định cao nhiệt độ 20 - 40ºC, đặc biệt 40ºC(2,74mg/100ml dịch chủng) phát triển yếu 60ºC Chứng tỏ loài vi khuẩn không sống nơi khô hạn Điều chứng minh cho thực tế : Vùng đất ven bờ Sông Lam hệ sinh thái thích hợp cho loài vi khuẩn Clostridium pasteurianum phát triển Điều dễ thấy rõ qua biểu đồ sau (hình 4): Hình : Liên quan nhiệt độ hàm lượng Amôn Qua hình cho thấy: - Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ 20 – 400C giảm dần 40 –600C - nhiệt độ 400C hàm lượng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh Và nhiệt độ tối thích chủng nghiên cứu 10.3 45 ảnh hưởng độ ẩm (RH %): 45 Độ ẩm có ảnh hưỏng lớn để cố định nitơ vi khuẩn Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm với hàm lượng amôn để từ tìm độ ẩm thích hợp cho trình cố định nitơ Với nhiệt độ tối thích 400C ,tiêp tục theo dõi RH=5%; 50%;75% 100% thu kết theo bảng (bảng 13) : Bảng 13 : ảnh hưởng độ ẩm đồng hoá nitơ : Độ ẩm Hàm lượng NH4+ (RH%) 25% 50% 75% 100% (mg/100ml dịch chủng Cn2) 1,12 1,48 2,86 1,26 Kết bảng cho thấy: nhiệt độ 25% lượng amôn 1,12 (mg/100 ml dịch chủng) + độ ẩm 50% lượng amôn 1.48 (mg/100 ml dịch chủng) + độ ẩm 75% lượng amôn 2,86( mg/100 ml dịch chủng) + độ ẩm 100% lượng amôn 1,26 (mg/100 ml dịch chủng) Chủng vi khuẩn phát triển tốt cho hàm lượng amôn cao RH% = 75% với 2,86 (mg/100 ml dịch chủng) Và độ ẩm thích hợp cho vi khuẩn phát triển 46 46 Hình : Liên quan độ ẩm hàm lượng Amôn Qua hình cho thấy: - Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ độ ẩm 25% - 75% giảm dần từ 75 – 100% - độ ẩm 75% hàm lượng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh mẽ Và độ ẩm tối ưu chủng 10.4 ảnh hưởng thời gian : Sự tích luỹ amôn vi sinh vật đồng hoá không liên quan tới yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH môi trường, … Mà liên quan tới thời gian tích luỹ Với mẫu đất thu đặt điều kiện tối ưu pH, nhiệt độ, độ ẩm, …Số vi sinh vật sau ngày/1 lần phân tích hàm lượng amôn có môi trường nuôi vi khuẩn Kết thu sau (bảng 14) : 47 Bảng 14 : thời gian tích luỹ amôn : Hàm lượng NH4+ Thờigian(ngày) (mg/100ml dịch nuôi Cn2) 1ngày(26/12/06 0,50 ) 3ngày(29/12/06 1,14 ) ngày 2,58 47 (5/01/06) 9ngày(14/01/06 0,88 ) Qua bảng 14 cho thấy : thời gian đầu (sau 24 giờ) hàm lượng amôn không đáng kể 0,5(mg NH4+/100ml dịch nuôi Cn2) + Sau ngày (72 giờ) hàm lượng amôn 1,14 (mg NH 4+/100 ml dịch chủng) + Sau ngày hàm lượng amôn 2,58( mg NH4+/100 ml dịch chủng) + Sau ngày hàm lượng amôn 0,88( mg NH4+/100 ml dịch chủng) Qua thấy rằng: sau ngày nuôi chủng môi trường có kết qủa cao là: 2,58 (mg NH4+/100 ml dịch chủng) Đó thời gian tích luỹ amôn tốt chủng Sau ngày hàm lượng amôn giảm 0,88 ( mg NH 4+/100 ml dịch chủng) thực tế môi trường cạn dinh dưỡng làm xuất số yếu tố: tồn số chất độc môi trường, … gây ảnh hưởng đến đời sống vi khuẩn Làm cho số lượng vi khuẩn giảm đồng thời lượng amôn giảm Và biểu đồ làm rõ kết thu bảng 14 : , 48 48 Hình 6: Liên quan thời gian hàm lượng Amôn Qua hình cho thấy: - Hoạt động cố định nitơ tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ giảm dần từ thứ đến ngày thứ - ngày thứ hàm lượng amôn lớn tức hoạt động cố định nitơ mạnh mẽ Và thời gian tối thích chủng nghiên cứu XI Số lượng vi khuẩn cần sử dụng: Sau biết khả cố định N 2của chủng vi khuẩn cao nhất, pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ ẩm tối ưu, thời gian tối thích, điều quan trọng phải biết số lượng vi khuẩn để từ tính số lượng cần thiết cho tác dụng lên đơn vị nguyên liệu có hiệu Số lượng vi khuẩn xác định sở đo độ đục máy đo màu quang điện Erma (Nhật) bước sóng trung tính (λ =610nm) Bảng 10: Số lượng vi sinh vật cần /đơn vị nguyên liệu: Ngày 10/12/06 →15/12 06 49 Dịch vi khuẩn (ml) Nguuyên liệu NH4+ (mg/100g) 100g 100g 100g 100g 14.9 15,7 17,2 16,4 49 Qua bảng 10 nhận thấy: với 1(ml) dịch khuẩn chưa đủ cố định nitơ phân tử ml vi khuẩn thực khả cố định tốt nhất, đạt 15,7 (mg NH4+ mg/100g nguyên liệu) ml vậy, đạt 17,2 (mg NH4+ mg/100g nguyên liệu) Nhưng tăng số lượng vi sinh vật lên có tượng ức chế cạnh tranh dinh dưỡng dẫn đến cố định nitơ giảm Kết luận kiến nghị I kết luận: Vùng đất trồng ngô xóm 6-Hưng Lợi – Hưng Nguyên – Nghệ An thuộc loại đất phù xa, pH trung tính (6,64-7,18), có hàm lượng đạm amon (NH4+) từ 0,0045-0,014mg/100g đất độ sâu (độ sâu lấy mẫu ) 20 – 30 cm 50 50 Số lượng tế bào vi khuẩn Clostridium pasteurianum trung bình chung khoảng 9,3.105 CFU/ml Kết cho thấy độ sâu 20 – 30 cm sinh cảnh thích nghi vi khuẩn Phân lập 12 chủng ký hiệu là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, Cn5, C6, Cn7, Cn8, Cn9, Cn10, C11, Cn12 Trong có: + chủng phát triển tốt là: Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, C6, Cn7 + chủng phát triển mức trung bình là: Cn 5, Cn8 (chỉ ẳ ống thạch) Còn lại số chủng bị chết quấ trình nghiên cứu - Qua phương pháp nghiên cứu hoá sinh vi sinh vật cho thấy: chủng :Cn1, Cn2, Cn3, Cn4, C6, Cn7 chủng thuộc giống Clostridium pasteurianum, có chủng Cn2 có khả cố định cao (1,28 mg NH4+/100g) dùng chủng để nghiên cứu Chủng Cn2 phát triển tốt pH = 6,0 – 7,0 với lượng amôn 1,26 – 2,90 ( mg NH4+ /100ml dịch chủng), độ ẩm:75% với lượng amôn 2,86 (mg NH4+ /100 ml dịch chủng), nhiệt độ tối ưu 40 0C với hàm lượng amôn 2,74 ( mg NH4+ /100ml dịch chủng) Kết nghiên cứu cho thấy Clostridium vi khuẩn kỵ khícó khả cố định nitơ, góp phần làm tăng dinh dưỡng nitơ cho đất, nhờ mà ảnh hưởng đến sinh trưởng – phát triển trồng Điều lý thú tích lĩy amôn nhờ vi sinh vật cố định nitơ liên quan mật thiết với chế độ phân bón biện pháp kỷ thuật (bón phân hữu cơ, bón vôi, …) Điều làm sáng tỏ thêm đắn biện pháp kỷ thuật mà ngành nông nghiệp áp dụng II kiến nghị: Có điều kiện tìm hiểu thêm chủng vi khuẩn sống tự cố định nitơ khác để phục vụ sản xuất Vì vi khuẩn sống tự docos định nitơ 51 51 dùng cho loại đất, loại trồng mà không đặc hiệu hư vi khuẩn nốt sần đậu (mỗi loài loài vi khuẩn) Có thể điều khiển sinh trưởng, phát triển chủng để tạo chế độ phân bón hữu - vi sinh, góp phần làm tăng dinh dưỡng cho đất giảm bớt việc sử dụng phân bón hoá học nhằm xây dựng hệ sinh thái bền vững Tài liệu tham khảo Kiều Hữu ảnh (2006) – Giáo trình giảng dạy vi sinh vật học - ĐHQG – Hà Nội 52 52 Nguyễn Văn Bộ (2005) – Bón phân cân đối hợp ký cho trồng – NXB Nông Nghiệp Hà Nội Đường Hồng Dật – Cây ngô (kỹ thuật canh tác tăng suất) (1986) NXB Lao Động Xã Hội Đường Hồng Dật (1978)- Giáo trình vi sinh vật học trồng trọt - NXB Giáo Dục Đường Hồng Dật – Nguyễn Lân Dũng – 1981 – Vi sinh vật học – NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng (1978) – sinh học phục vụ sản xuất đòi sống – Nguyễn Lân Dũng cộng (1978) – Hướn dẫn thực hành vi sinh vật NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng – Nguyễn Đình Quyến – Phạm Văn Tỵ (1980) – vi sinh học - NXB Giáo Dục N.DIER Uxalimxki - Nguyễn Lân Dũng - Phạm Văn Tỵ – Ngô Kế Sương (1970) – Cơ sơ sinh lý học vi sinh vật - NXB Giáo Dục 10 Nguyễn Lân Dũng – Nguyễn Đình Quyến (1981) – Vi sinh vật học - NXB Giáo Dục 11 Nguyễn Thành Đạt –Cơ sơ vi sinh vật (tập 1) (1999) - NXB Giáo Dục 12 Nguyễn Thành Đạt cộng (1990) –Thực hành vi sinh vật - NXB Giáo Dục 13 Nguyễn Thành Đạt (1980) – Hướng dẫn thực hành vi sinh vật - NXB Giáo Dục Hà Nội 14 Phạm Công Hoạt (2005) – Bài giảng vấn đề vi sinh vật học – Bộ khoa học công nghệ 15 Lê Văn Khoa cộng (2001) – Phương pháp phân tích đất, nước, phân bón trồng - NXB Giáo Dục 16 53 Trần Minh Tâm (2000) – Công nghệ vi sinh ứng dụng 53 17 Chu Thị Thơm , Phạm Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006) – ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất đời sống – NXB Lao Động Xã Hội 18 Nguyễn Dương Tuệ (1995) – Thực tập vi sinh vật học - Đại học Vinh 19 Nguyễn Dương Tuệ (2003) - Thực tập lớn vi sinh vật học - Đại học Vinh 20 Nguyễn Khắc Tuấn (1982) – Giáo trình thực tập vi sinh vật – Bộ Nông Nghiệp, trường đại học Nông Nghiệp I - Hà Nội 21 Lê Văn Tri (2004) – Phân phức hợp hữu vi sinh – NXB Nông Nghiệp 22 Trần Cẩm Vân (2001) – Giáo trình vi sinh học môi trường - NXB Đại Học Quốc Gia – Hà Nội 23 Viện nông hoá thổ nhưỡng (1976) – Tài liệu hướng dẫn phân tích nông hoá thổ nhưỡng Hà Nội 24 54 Campbell (20005) – Biology, Pearson Education 54