PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ - ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MÔC

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ - ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MÔC PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ - ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MÔC PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ - ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN-NẤM MÔC

TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

&

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN - NẤM MỐC

NỘI DUNG

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỊT

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỊT

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN – NẤM MỐC TRONG THỊT

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN – NẤM MỐC TRONG THỊT

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN – NẤM MỐC

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Khái quát

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy (O2) phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Nguyên tắc

Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí

ở 300C/72 giờ ± 6 giờ hoặc 370C/48 giờ ± 6 giờ.

Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

 Quy trình phân tích bao gồm các bước:

- Cân mẫu

- Đồng nhất mẫu

- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân

- Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên mặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng phương pháp hộp trải, hoặc hộp đổ.

- Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

 1 Định lượng mẫu

 Bước 1: Cân chính xác hay 25 g mẫu cho vào bao PE vô trùng

 2 Đồng nhất và pha loãng mẫu

 Bước 2: Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội

 Bước 3: Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây

 Bước 4: Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.

 Bước 5: Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2 Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Đếm khuẩn lạc

Chọn đĩa có 25→250 khuẩn lạc

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

 Bước 6: Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay.

 3 Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

 Bước 7: Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Bước 8: dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng

Bước 9: Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC

Bước 10: lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng

PHÂN TÍCH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ý nghĩa

 Tổng vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm.

 Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm đẫn đến biến đổi chất lượng: 106 tế bào/g (ml) là ranh giới

để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không Một vài trường hợp vi sinh vật bằng 106 tế bào/g (ml) thực phẩm chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Nguyên tắc

 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2, bề mặt sản phẩm được áp dụng để đánh giá độ nhiễm khuẩn trên bề mặt các sản phẩm thịt bằng phương pháp đếm

số khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí có trên 1cm mẫu thử đã được chuyển tương đương với 1ml

dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện thử được xác định trong TCVN.

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

 b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100 ml chứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dung dịch đệm pepton và đổ cả vào

bình chứa mẫu, lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tan vụn, sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới

khoảng 100ml

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

 c) Để lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc độ 200 vòng/ phút Gạn lấy lớp dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho thêm dung dịch đệm pepton tới vạch mức

100ml (tương đương với 100cm2 bề mặt mẫu được chuẩn bị) Dung dịch này được gọi là dung dịch

huyền phù ban đầu Cần tiến hành kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra,

dung dịch cần được bảo quản ở 0 đến + 50C nhưng không quá 1h.

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Pha loãng mẫu

 Dùng dung dịch đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha loãng dung dịch huyền phù ban đầu theo tỉ lệ 1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10-1, 10-2…10n) Cần căn cứ mức

độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ pha loãng phù

hợp.

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Tiến hành nuôi cấy

a) Với mỗi mẫu phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng nuối cấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng.

b) Dùng pipet khác nhau lấy 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vào giữa các đĩa petri Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng hồ và 5 lần ngược lai để trộn đều môi trường và dung dịch mẫu

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Đặt các đĩa chứa môi trường trên mặt phẳng ngang sao cho môi trường đông tự nhiên Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đến khi nuôi cấy xong không quá 20 phút.

c) Nếu nghi trong sản phẩm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thểm mọc lan trên bề mặt môi trường thì sau khi môi trường đã đông rót thêm 4 ml thạch màng lên bề mặt đĩa.

d) Khi môi trường đã đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 30 ±

10C trong 72 h.

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X 1) được quy ra tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được tính ở 2 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vở chitin, có nhân và các bào quan khác Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài Có thể phân biệt được nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau:

30±1oC trong 72 giờ

Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuổi

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty.

 Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phẩm khô, gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm từ sữa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

 Môi trường và hóa chất

- Dung dịch pha loãng ( nước pepton 1%)

- Môi trường thạch DBRC.

- Môi trường thạch MEA.

- Môi trường thạch PDA.

- Môi trường thạch SDA

Quy trình định lượng tổng nấm men, nấm mốc

Định lượng mẫu

Đồng nhất và pha loãng mẫu trong dung dịch SPW

Trải 0,1 ml dung dịch mẫu lên môi trường DBRC

Ủ Mẫu

Đếm khuẩn lạc

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC

Bước 1: Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây

Bước 2: Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng

Bước 3: Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều

Bước 4: Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi

đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1.

để có được các độ pha loãng cần thiết

Bước 6: Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắc mạnh bằng tay.

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

XÁC ĐỊNH TỔNG NẤM MEN, NẤM MỐC

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Đếm và số lượng khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy Khi cần thiết quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay mốc Kết quả được ghi bằng đơn vị CPU/g

Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ

ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g.

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ

ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g.

(cfu/g)

1 1

n

N A

×

× +

+

×

×

=

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Cấy sâu trong các đĩa thạch, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc chứa trong các đĩa petri, với mẫu cấy

là một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc một lượng dung dịch huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm ở dạng khác

Cấy trên các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các độ pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu

Ủ các đĩa chứa các mẫu cấy trên trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ từ 200C đến 250C trong 3 ngày, 4 ngày hoặc 5 ngày

Tính số lượng nấm men và nấm mốc có trong một gam hoặc một mililit mẫu từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng cho kết quả có ý nghĩa

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Môi trường thạch của cao nấm men, glucoza và oxitetraxyclin/gentamixin Môi trường cơ sở

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

 Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 4833 - 2: 2002 (ISO 3100 - 2).

 Tiến hành kiểm tra mẫu đã xử lý càng sớm càng tốt Nếu cần, có thể bảo quản mẫu ở nhiệt

độ từ 00C đến +20C, nhưng không quá 24h

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

2.Lặp lại quy trình với các độ pha loãng khác

3.Từ chai cấy mẫu rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 15 ml môi trường thạch của cao men, glucoza và oxitetraxilin/gentamixin, đã tan chảy và được giữ ở 470C trong nồi cách thủy Thời gian rót sang đĩa không quá 15 phút

4. Để môi trường đông tự nhiên

5.Lật ngược các đĩa và đặt chúng vào tủ ấm để ở nhiệt độ từ 200C đến 250C

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Nếu cần, tiến hành kiểm tra bằng kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc nấm men

và nấm mốc với các khuẩn lạc của vi khuẩn có kích thước nhỏ

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

Sử dụng các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc.

Tính số lượng vi sinh vật trong một gam hoặc một mililit sản phẩm, N, theo công thức sau:

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ước tính các số lượng nhỏ khuẩn lạc

Biểu thị kết quả như sau:

- Đối với sản phẩm dạng lỏng: Số lượng nấm men và nấm mốc có trong một mililit được ước tính là NE= y

- Đối với sản phẩm dạng khác: Số lượng nấm men và nấm mốc có trong một gam sản phẩm được ước tính là NE = y/d

Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Không có các khuẩn lạc trên các đĩa

Nếu không có các khuẩn lạc trên các đĩa mẫu thử (sản phẩm dạng lỏng) thì số lượng nấm men và nấm mốc trong một mililit sản phẩm được ghi là nhỏ hơn 1

Nếu không có các khuẩn lạc trên các đĩa của huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) thì số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam sản phẩm được ghi là nhỏ hơn 10

Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Ủ mẫu

30±1oC trong 72 giờ

Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ

- Phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

- Phương pháp đã sử dụng, kể cả số ngày ủ;

- Kết quả thử nghiệm thu được;

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả

Báo cáo thử nghiệm cũng phải gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử

Thank You !