Tìm hiểu và thực tập quy trình định danh vi khuẩn staphylococcus aureus, heamophilus influnenae và klebsiall peneumoniae trên bệnh phẩm đàm tại bệnh viện nhân dân Gia Định

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VÀ THỰC TẬP QUI TRÌNH ĐỊNH ĐANH VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS, HEAMOPHILUS INFLUNENAE VÀ KLEBSIALL PENEUMONIAE TRÊN BỆNH PHẨM ĐÀM TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH CBHD: Ths.BS NGUYỄN SỬ ÁNH TUYẾT KS NGUYỄN THÙY TRANG GVHD: Th.S LƯU HUYỀN TRANG SVTT: DƯƠNG NGỌC THẢO - 10066551 NGUYỄN THỊ THÙY PHẠM TRỌNG PHAN HÙNG VƯƠNG NGUYỄN NGỌC YẾN – 10271641 Lớp: CDSH12 Niên khóa: 2010 – 2013 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa thực tập tốt nghiệp báo cáo thực tập Bên cạnh nổ lực thân vận dụng kiến thức thu thập trường, tìm tịi học hỏi thu thập thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em nhận quan tâm hướng dẩn tận tâm Quý Thầy Cô , Cán Bộ Anh ( Chị ) bệnh viện, với lời động viên khích lệ từ phí gia đình bạn bè lúc em gặp khó khăn Chúng em xin gởi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, Q Thầy Cơ Viện Cơng Nghệ Sinh Học Thực Phẩm tận tình dạy dỗ, trang bị cho chúng em kiến thức, kinh nghiệm q báo, để chúng em có kiến thức thực hành thực tiển vận dụng sống Chúng em xin cảm ơn chân thành đến Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết KS Nguyễn Thùy Trang tạo điều kiện tốt cho chúng em thực tập tận tình giúp đỡ, hướng dẩn suốt trình thực tập khoa vi sinh bệnh viện Chúng em xin gởi lời cảm ơn Th.S Lưu Huyền Trang , Cơ tận tình hướng dẩn, cung cấp kiến thức giúp đỡ nhóm chúng em để hồn thành báo cáo thực tập Chúng em xin cảm ơn Anh (chị) Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định dạy, quan tâm giúp đỡ chúng em trình thực tập Bệnh Viện Đồng thời chúng em xin cảm ơn đến gia đình tập thể lớp CDSH12 trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh động viên, giúp đỡ năm học vừa qua trình thực tập Nhóm chúng em xin chân thành cảm! T.p Hồ Chí Minh tháng năm 2013 Trang NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Báo cáo thực tập Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định CBHD: Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết KS Nguyễn Thùy Trang Nhận xét: T.p Hồ Chí Minh, ngày… tháng… năm 2013 Cán hướng dẫn: Trang NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Báo cáo thực tập Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang Nhận xét: T.p Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2013 Giảng viên hướng dẫn: Trang MỤC LỤC GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ 1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH 2.1.1 Lịch sử hình thành phát triển 2.1.2 Cơ cấu tổ chức 11 2.2 KHOA VI SINH 13 2.2.1 Giới thiệu khoa 13 2.2.2 Chức nhiệm vụ 13 2.2.3 Thành tích đạt 14 2.2.4 Hướng phát triển tương lai 15 2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH 15 2.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm 15 2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 15 2.3.3 Phương pháp định danh sinh hóa 16 2.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY 25 Trang 2.3.5 Chuẩn bị môi trường 25 2.4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.4.1 Haemophilus influenzae 27 2.4.2 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 37 a Đặc điểm phân loại 37 2.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 40 NỘI DUNG THỰC TẬP 49 3.1 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 49 3.1.1 Dụng cụ 49 3.2 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU BỆNH PHẨM 50 3.2.1 Chỉ định 50 3.2.2 Thời điểm lấy mẫu 51 3.2.3 Cách lấy mẫu đàm 51 3.3 ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM 52 3.3.1 Khảo sát đại thể mẫu đàm 52 3.3.2 Khảo sát vi thể 53 3.4 TIẾN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN 53 3.4.1 Quy trình định danh H influenzae 53 3.4.2 giải thích quy trình 54 3.4.3 Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae 56 MỤC LỤC BẢNG+HÌNH Trang MỤC LỤC CÁC CHỬ VIẾT TẮT(NẾU CÓ) GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn đường hô hấp khơng gánh nặng bệnh tật mà cịn bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu số 10 bệnh lý nhiễm trùng nước có thu nhập thấp Yếu tố định để góp phần chống đở gánh nặng vấn đề tìm tác nhân đích gây bệnh tìm loại kháng sinh phù hợp điều trị kinh nghiệm đứng trước bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp Chính hiểu biết tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp thách thức phải quan tâm đề kháng kháng sinh vi khuần vấn đề Các bệnh lý nhiễm khuẩn hơ hấp cấp bao gồm viêm xoang , viêm tai , viêm amydale bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, viêm phổi, viêm phế quản – phổi bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis Riêng bệnh lý viêm amydale tác nhân siêu vi xem nguyên nhân gần 50% trường hợp, Streptococcus pyogenes tác nhân vi khuẩn hàng đầu phải nhà lâm sàng nghĩ đến Ngoài tác nhân vi khuẩn tác nhân vi khuẩn khơng điển Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae Legionella pneumophila tác nhân vi khẩn cần phải quan tâm Đó vấn đề chung tình hình bệnh hơ hấp nay.Vì quy trình tìm khuẩn gây bệnh đường hơ hấp quan trọng trước hết lấy bệnh phẩm đánh giá có tồn có mặt khuẩn hay khơng Theo xét nghiệm thường quy bệnh phẩm có liên quan đến bệnh đường hô hấp nhiều lấy từ mẫu đàm Vì bệnh phẩm đàm có chứa nhiều vi khuẩn liên quan đến bệnh lý theo khảo sát nhiều bệnh viện nước Trang Đàm tươi thường chứa nhiều lao khuẩn ẩn trú dịch phế quản vùng họng đánh giá mẫu đàm đánh giá xác nguyên bệnh đường hô hấp.các vi khuẩn thường chứa mẫu đàm gồm Staphylococci,Streptococci,Haemophilus influenza ,Klebsiella pneumoniae, M catarrhalis bacillus Koch…Sự có mặt vi khuẩn theo khảo sát có ảnh hưởng quan trọng đến bệnh lý đường hô hấp Vi khuẩn tác nhân gây nhiễm khuẩn hơ hấp phổ biến Vi khuẩn hiếu khí chiếm 73% nấm chiếm 4% vi sinh vật phân lập từ đàm dịch hút phế quản bệnh nhân Vi khuẩn thường nhiễm khuẩn đa tác nhân trực khuẩn Gram âm thường gặp Tuy nhiên, MRSA cầu khuẩn Gram dương khác kể phế cầu (Streptococcus pneumoniae) ngày xuất phổ biến Tại bệnh viện chủng Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens Proteus sp chiếm 50% tác nhân phân lập từ bệnh phẩm đường hơ hấp.Trong Escherichia coli (29,7%), Klebsiella spp (26%), Pseudomonas aeruginosa (13,7%), Staphylococcus aureus (6%), Acinetobacter spp (5%), Haemophilus influenza,(tháng 8/2008, khoa vi sinh bệnh viện nhân dân Gia Định) Trong tất tác nhân gây bệnh kể ba tác nhân: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,Klebsiella pneumoniaelà vi khuẩn thường có mặt mẫu bệnh đàm đáng quan tâm Chính lẽ đó, nhóm chúng tơi thực trình tìm hiểu , quy trình định danh phương pháp thực kháng sinh đồ ba loại vi khuẩn 1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Là mẫu bệnh phẩm đàm bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh bệnh viên nhân dân Gia định có định cấy vi khuẩn, định danh làm kháng sinh đồ 1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ  Mục đích Trang Tìm hiểu, theo dõi thực hành thao tác phân lập định danh,kháng sinh đồ với chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh phẩm đàm  Nhiệm vụ Hiểu nguyên lý, nắm vững thao tác lấy mẫu bệnh phẫm, thao tác quy trình định danh, làm kháng sinh đồ với chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae mẫu bệnh phẩm đàm 1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI Đề tài thực tất bệnh phẩm đàm thu nhận khoa vi sinh bệnh viện nhân dân Gia định Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo thao tác, quy trình áp dụng bệnh viện Nhân Dân Gia Định  Thời gian Từ 1/03/2013 đến 31/05/2013  Địa điểm Khoa Vi sinh Bệnh viên nhân dân Gia Định Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH Vị trí địa lý: Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 2.1.1 Lịch sử hình thành phát triển Trang Bệnh viện Nhân Dân Gia Định sơ khai người Pháp xây dựng với bảng hiệu Hospital de Gia Định, thập niên đầu kỷ XX -Năm 1945, Hôpital de Gia Định đổi tên thành bệnh viện Nguyễn Văn Học - Đến năm 1968 bệnh viện phá xây dựng với mơ hình tầng để tiếp nhận điều trị khoảng 450 đến 500 bệnh nhân nội trú đổi tên thành Trung tâm thực tập y khoa Gia Định - Từ sau năm 1975, bệnh viện Nguyễn Văn Học đổi tên thành bệnh viện Nhân Dân Gia Định - Đến năm 1996, bệnh viện phân hạng bệnh viện loại I (quyết định số 4630/QĐ-UB-NC) với nhiệm vụ khám chữa bệnh sở thực hành trường Đại học Y – Dược TP Hồ Chí Minh - Từ bệnh viện ban đầu xây dựng với quy mô cho 450 đến 500 bệnh nhân nội trú khoảng 1.000 lượt người đến khám chữa bệnh ngoại trú, số lượng người đến khám chữa bệnh ngoại trú trung bình khoảng 3.000 lượt/ngày bệnh nhân điều trị nội trú 1.000 bệnh Trang 10 1.6.1 Các Protein bề mặt: Các protein thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ Tạo protein gắn kết fibrinogen fibronetin làm kích thích kết dính khối máu mô bị chấn thương 1.6.2 Các dung huyết tố: Tác động lên màng hồng cầu nhiều động vật khác -Dung huyết tố α: Chỉ có tụ cầu nguồn gốc từ người, làm tan máu thỏ, gây nhiễm độc tế bào lympho, đại thực bào, gây hoại tử da, gây độc tế bào thần kinh Dung huyết tố α ngoại độc tố nên tác dụng tác nhân lý hoá biến thành giải độc tố làm vacxin -Dung huyết tố β: Chỉ có tụ cầu nguồn gốc từ động vật làm tan máu cừu, gây độc cho tế bào tuyến sữa, gây chết chuột thỏ, chưa xác định vai trị người -Dung huyết tố γ: Làm tan máu thỏ, cừu, người, gây chết chuột lang -Dung huyết tố δ: Làm tan máu thỏ, người, cừu, khỉ -Dung huyết tố ε: Chỉ có tụ cầu da, làm tan máu phối hợp với dung huyết tố β 1.6.3 Các độc tố -Độc tố diệt bạch cầu (leucocidin): Tác động trực tiếp thành tế bào bạch cầu đa nhân, đại thực bào làm phá huỷ tế bào -Độc tố ruột (enterotoxin): Phát độc tố ruột: А, B, C1, C2, D, E độc lực mạnh gây ngộ độc thức ăn, viêm đại tràng (xảy người điều trị kháng sinh kéo dài) Độc tố ruột có đặc tính: Vững bền với nhiệt độ vững bền với enzym tiêu hố -Độc tố gây sốt: Có typ độc tố gây sốt A, B, C, gây sốt, ảnh hưởng tới phân bào tham gia vào shock -Độc tố gây bong da: Thường tác động trẻ sinh gây bong da chúng làm tách lớp biểu bì -Độc tố gây shock: Độc tố TSST (toxic shock syndrome toxin) 1.6.3 Các enzym -Coagulase: Bản chất protein, hoạt động prothrombin làm fibrinogen thành fibrin, làm đông huyết tương người, thỏ Các tế bào vi khuẩn khoác fibrin đề kháng với opsonin hoá thực bào Coagulase thường có S aureus, tạo huyết cục tĩnh mạch gây nhiễm khuẩn huyết -Fibrinolysin (Staphylokinase) làm phân huỷ fibrin nên chủng có enzym phát triển cục máu làm vỡ tạo mảnh nhỏ theo mạch máu gây tắc mạch nhiễm khuẩn lan rộng Phát enzym cách tìm khả gây phân huỷ fibrin bị kết tủa sức nóng Trang 43 -Enzym chuyển hố đường manit S aureus có khả chuyển hố đường manit, phát mơi trường schapman (mơi trường gồm có đường manit, natriclorua nồng độ 6,5%, thị màu đỏ phenol), vi khuẩn lên men đường làm chuyển màu môi trường từ đỏ da cam sang màu vàng) -Catalase phân huỷ hydrogen peroxide tạo qúa trình thực bào (H202 -> H20 + 02), tính chất giúp phân biệt tụ cầu với cầu khuẩn Gram dương khác -Hyaluronidase phá huỷ tổ chức liên kết phân huỷ acid hyaluronic giúp vi khuẩn lan rộng -Desoxyribonuclease (DNase) làm phân huỷ acid desoxyribonucleic dẫn đến tổn thương tổ chức -Penicillinase làm phá huỷ cấu trúc, làm tác dụng penicillin  Khả gây bệnh bệnh phẩm đàm Tụ cầu cư trú người lành (20-40%), gây bệnh có điều kiện thuận lợi bệnh tụ cầu lan truyền trực tiếp gián tiếp qua khơng khí, đồ dùng, dụng cụ, thức ăn… Trong đàm Staphylococcus aureus thường gây bệnh viêm mũi họng, amydal, viêm xoang… đặc biệt nguy hiểm bệnh hơ hấp: viêm khí quản, viêm phổi hoại tử, áp xe phổi biến chứng tràn khí màng phổi, tràn khí trung thất, tràng khí da, tràn mũ màng phổi  Các phương pháp phát Staphylococcus aureus 3.1 Phương pháp nuôi cấy Trước nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá mẩu đàm Các loại môi trường nuôi cấy: Môi trường thạch máu _ Blood Agar (BA): Khuẩn lạc có màu kem trắng, tiêu huyết www.benhphoi.com Trang 44 Trên môi trường thạch thường: Có khả sinh sắc tố, khuẩn lạc có màu vàng chanh S.aureus không mọc môi trường Mac Conkey Agar (BA) 3.2 Nhuộm gram Trêm lame S.aureus có hình cầu, bắt màu tím (gram dương) Trang 45 4.3 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa Sơ đồ định danh Staphylococcus aureus (-) Streptococci (+) Cầu khuẩn Micrococci Oxidase Gram (+) Staphylococci (+) Micrococci Staphylococci (-) (-) (R) S.aureus Coagulase Polymycin B 300UI S.aureus S.intermedius S.intermediuss Trang 46 S.saprophyticus Ghi chú: MSA (Manitol Salt Agar); URE ( Urease); ODC (Ornithindecarboxylase) Pb (Polymycin B 300UI, R25 >25 Nhiễm 10 - 25 >25 Chấp nhận Mẫu đạt, tiến 25 Tốt hành cấy 3.4 TIẾN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUẨN 3.4.1 Quy trình định danh H influenzae Trang 53 Mẫu không đạt, lấy mẫu lại Sơ đồ 1: Quy trình định danh Haemophilus influenzae 3.4.2 giải thích quy trình  Mẫu đàm Thu nhận mẫu bệnh phẩm đàm: Nếu người lớn, đàm lấy vào buổi sáng sớm, ho khạc sâu, đàm giữ hộp vơ khuẩn chuyển phịng thí nghiệm Hình 1: dụng cụ lấy mẫu đàm vòng -6 (nhiệt độ phịng thí nghiệm) Dịch tỵ hầu (mũi-họng): bệnh nhân không khạc trẻ nhỏ dùng tăm cán mảnh mềm lấy chất dịch ngã ba mũi - họng theo đường mũi (dịch tỵ hầu): đưa tăm vào sâu nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai phía, vê nhẹ rút Chú ý, chưa vào đủ độ sâu có vật cản khơng cố lấy mà phải làm lại mũi bên Tăm Trang 54 phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bơng vào khí quản cán làm kim loại mảnh, mềm không gỉ không dễ gẫy thực thao tác Chất dịch hô hấp lấy máy hút chân khơng nhẹ: cách thay cho cách ngốy tỵ hầu Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi khoảng cách 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai bệnh nhân để hút dịch Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm vô khuẩn làm ẩm nước muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát nhẹ hốc amidan, thành sau họng (sau lưỡi gà) Tránh không chạm vào lưỡi, răng, mặt má lưỡi gà Sau phải cắm tăm bơng vào mơi trường vận chuyển  Đánh giá mẫu đàm Tất mẫu bệnh phẩm đàm thu nhận được đánh giá đại thể vi thể trước đem nuôi cấy vào môi trường Các bước thực đánh giá mẫu đàm trình bày mục 3.3 (ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHẨM ĐÀM) Sau đánh giá mẫu đàm vật kính x10 ta chuyển qua vật kính x100 có giọt dầu soi kính, Hình 2: mẫu bệnh phẩm đàm đánh giá quan sát vùng nhầy nhớt quanh tế bào bạch cầu trước nuôi cấy để ghi nhận diện vi khuẩn Qua việc quan sát ta nghi ngờ loại vi khuẩn mẫu bệnh phẩm theo bảng …  Cấy vào môi trường Trang 55 Các mẫu đàm đạt tiêu chuẩn tiến hành cấy vào môi trường thạch nâu máu ngựa bổ sung Bacitracin (CAHI ), ủ 37 , CO2 5% 24-48h tiến hành định danh  Định danh Trên môi trường thạch CAHI, H influenzae mọc thành khúm đục nhẹ, dẹt đường kính khoảng 1mm dễ nhận diện kết hợp với quan sát hình dạng, kích thước, bắt màu thuốc nhuộm nhuộm Gram, ta định danh cách dễ dàng vi khuẩn H influenzae  Kháng sinh đồ Thực đặt đĩa kháng sinh đồ theo bảng sau: STT Tên kháng sinh đồ Ký hiệu SAM CXM CRO AUG cefaclor CFC ciprofloxacin CIP tetracycline TET Ampicillin AP TS 3.4.3 Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae Lấy mẫu đàm tươi Quy trình phân lập +Tiến hành nhuộm gram Trang 56 Quan sát kính hiển vi đánh giá số lượng tế bào đếm +nếu mẫu đặc tiến hành làm lỗng bang NALC sau pha vào dung dịch nước muối NaCl 0,9% Sau tiến hành phân lập vi khuẩn Klebsiella pneumoniaetrên mơi trường MC, BA (CẦN TÌM MÔI TRƯƠNG PHÂN LẬP VÀ THỜI GIAN Ủ) Đặc điểm nhận dạng khóm khuẩn Klebsiella pneumoniaetrên mơi trường dĩa thạch Thử nghiệm định danh Klebsiella pneumoniaeTa tiến hành thực thử nghiệm theo bảng định danh vi khuẩn (SƠ ĐỒ ĐỊNH DANH) Bảng.Một số thử nghiệm sinh hóa lồi chi Klebsiella Lồi OXI NO2 KIA/TSI GLU LAC GÁ H2S PAD ỦE IND MOB CIT VP MR LDC ML K pneumoniae - + + + + - - + - - + + - + + K oxytoca - + + + + - - + + - + + - + + K ornithinolytica - + + + + - - + + - + +/- + + + K planticola - + + + + - - + - - + + + + + K ozanae - + + +/- +/- - - - - - +/- - + +/- - K rhinoscleromatis - + + - - - - - - - - - + - + K terrigena + + + + - - - - - +/- + +/- + + - Trang 57