INDUSTRIAL ˆ
UNIVERSITY BỘ CÔNG THƯƠNG
OF HOCHIMINH CIT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP DE TAI:
TIM HIEU VA THUC TAP QUI TRINH DINH DANH VI KHUAN STAPHYLOCOCCUS AUREUS, HEAMOPHILUS INFLUNENAE VA KLEBSIALL PENEUMONIA4E TREN
BỆNH PHẨM ĐÀM TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH
Trang 2LOI CAM ON
Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp và bài báo cáo thực tập này Bên cạnh sự nỗ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được sự quan tâm cũng như hướng dẫn tận tâm của Quý Thây Cô, Cán Bộ và các Anh ( Chị ) tại bệnh viện, cùng với những lời động viên và khích lệ từ phí gia đình và bạn bè trong lúc em gặp khó khăn
Chúng em xin được gởi lời cảm ơn đến Quý Thây Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phó Hô Chí Minh, Quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm đã tận
tình dạy dỗ, trang bị cho chúng em những kiến thức, những kinh nghiệm quí báo, để chúng em có được kiến thức thực hành trong thực tiển và vận dụng trong cuộc sống
Chúng em xin cảm ơn chân thành đến Ths.BS Nguyễn Sử Ánh Tuyết và KS Nguyễn Thùy Trang
đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng em thực tập và tận tình giúp đỡ, hướng dẩn trong suốt quá trình thực tập khoa vi sinh của bệnh viện
Chúng em xin gởi lời cảm ơn Th.Š Lưu Huyền Trang, Cô đã tận tình hướng dẫn, cung cấp kiến thức và giúp đỡ nhóm chúng em để hoàn thành bài báo cáo thực tập này
Chúng em cũng xin cảm ơn các Anh (chị) tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Dinh đã chỉ dạy, quan tâm và giúp đỡ chúng em trong quá trình thực tập tại Bệnh Viện
Đồng thời chúng em xin cảm ơn đến gia đình và tập thể lớp CDSHI2 trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phó Hô Chí Minh đã động viên, giúp đỡ trong những năm học vừa qua và trong quá trình thực tập
Nhóm chúng em xin chân thành cảm!
Trang 4NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định
GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang
Nhận xét:
T.p Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2013
Giảng viên hướng dẫn:
Trang 51.1 1.2 1.3 1.4 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 2.2.1 2.2.2 2.243 2.2.4 23 BENH 2.3.1 2.3.2 2.3.3 243.4 MỤC LỤC
GIỚI THIỆU 2-2 ©E££EEE9EEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEEEEEEEELEEEEEErkrrrker 7 DAT VAN DE nvceecssssssssssesssssecssssesssssccsssscesssscsssusesssusessssessssucesssusesssssesssuessssseessuecsssueessssseessse 7 DOI TUGNG NGHIEN CUU MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ PHẠM VI ĐỀ TÀI .-22-22£©S+E£9SEEEEEEEEEESEEEEEEEE1111271111271112711177111121111121112111 1e 9 TỎNG QUAN -252-222222EEE9E2111921111127111121111171111171111121111211111111111111.1.111 11 1e 9 GIỚI THIỆU VẺ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH -2 2- z2 9 Lịch sử hình thành và phát triỂn -22++£+22EEEEEE+++++ttttEEEEEEYvrrrrrrrrrrrrrres 9 Cơ cấu tổ chức -222222++++22222222111121122222211111111.2222121111111 22121111112 crrrrrrrrrk 11 KHOA VI SINH wiseesssssssssssssssssssssccscsssssssssssescsssssssuunssesecssssssnsusscsesceesssssuuusssseceessssssunseseeesessss 13
GiGi thiG KO A8 13
Chức năng và nhiỆm VỤ - - ¿5% xxx 101111111 1 xxx ng ng 13
Thành tích đạt được 2++£°22VEVVVvv2+++tt2EEEEE2211211122222211111222 221221111112 crrrrrrrrrer 14 Hướng phát triển trong tương lai - + ©2+£++EEV+++£+EEEE+E+ttEEEEAeertrrvAzeerrrrrrcee 15
CƠ SỞ LÝ THUYÉT VÈ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUÂN GÂY
15
Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm 2 £+EV22££+EEE+E+£EEEEEeertEEvEEeerrrrrrree 15 Phương pháp nhuộm TraIm ¿+ + + xxx k*k#k#E£EEESEeEeEeEeEEsrkrkrkrkrkrkrkekrkrkrrrrrrsre 15 Phương pháp định danh sinh hóa - 2-5 x*#E#EeEeEeEeExEkrkrkrkrkrkrkrkekrkerrrrrrrsre 16 Phương pháp làm kháng sinh đỗ với kỹ thuật KIRB.Y .-2 -c¿2c5se2 25
Trang 6
2.3.5 24 2.4.1 2.4.2 2.4.3 3.1 3.1.1 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3
Chun bi mi trurOng sceccsscssssesssssssseessosssecsccsssssesessssssssecssssscsssssssecsesssssesssssssseeseessseeseessnee 25 DOI TUGNG NGHIEN CUU weeeesssscssssssssssesssssessssscsssssesssssscssseessssessssecsssseesssseessssessnseess 27
Haemophilus infÏu€ïiZဠ- - + 5s xxx xxx kk v3 EE v.v vn ng ve 27 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 2 -£°©©2££+EEE2E+£+EEEEEE+ttEEEEEeeevrrvvzeerrrrrrcee 37
l2;iiroi80 1 812T0PPP 4xa )H.HgBR H,)HA.,.: 37
STAPHYLOCOCCUS AUREUS occssssssssssssssssssssssssusssssssssssssssssssssssssssssssusssseesssssssssssessesssssss 40 NỘI DUNG THỰC TẬP . -22+£©22EEEEEES2+++ttt222222222222t 22222111122errrrrrrrrer 49
DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 22-©s£©S++£9SEEEE9EEEEEEEEEEEEEEEE12271111711112711227112272 E2 49
Mì) 49
PHƯƠNG PHÁP LÁY MẪU BỆNH PHẨM - 22 ©222EE+£+EEEEeEEEEerrreeerrr 50
Chỉ định
Thời điểm lấy mẫu
Cách lấy mẫu đàm . 2-V2+£+EE++++£EEEE.EEEEEE2151227211111222211112227111112271122.22211Xee 51
ĐÁNH GIÁ MẪU BỆNH PHÂM ĐÀM -22- +2 +E++++EEEEESEEEEEEEEEEtEEELerrrkrerrrr 52 Khảo sát đại thể mẫu đàm 22-2 ++£+SE+EESEEEEEEEEE1E1271112271111711112711117112 271 re 52
Khảo sát vi thỂ -2222222222+E2222221111111.2222211111111T 211111111111T 211111111 ccrrrrrrrrrii 53
TIỀN HÀNH ĐỊNH DANH CÁC VI KHUÂN .-2-2©+++E++e£+E2+e2+tzxeerr+ 53
Quy trình định danh H irjfÏUU€HZ€ 5 k$kEE‡E$EeEeEeEeEeEererrkrkrkrkrkekrkerrrrrrrsre 53 giải thích quy trÌnh - - << + xvvvvvTnTTTHgTT Tn HH nrre 54 Phương pháp định danh Klebsiella pneurmoniae - - + + + x+x+zxexexexexexexexsrs 56
MỤC LỤC BẢNG+HÌNH
Trang 7MUC LUC CAC CHU VIET TAT(NEU CO)
1 GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VAN DE
Nhiễm khuẩn đường hô hấp không chỉ là gánh nặng bệnh tật mà còn là bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm trùng ở các nước có thu nhập thấp Yếu tó rất quyết định để góp phần chống đở được gánh nặng này là vấn đề tìm ra tác nhân đích gây bệnh và tìm ra loại kháng sinh phù hợp trong điều trị kinh nghiệm khi đứng trước một bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hap Chính vì vậy sự hiểu biết về các tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp cũng như các thách thức phải quan tâm hiện nay trong đề kháng các kháng sinh của các vi khuẩn này là những vấn đề gì
Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang, viêm tai giữa , viêm amydale là các
bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, và viêm phổi, viêm phế quản — phổi là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây các bệnh lý
nhiễm khuẩn hô hấp cấp là Š£repfococcus pneumoniae, Haemophilus infÏluenzae và Moraxella cafarrhalis Riêng đối với bệnh lý viêm amydale thì mặc dù tác nhân siêu vi được xem là nguyên nhân của gần 50% các trường hợp, nhưng S/repfococeus pyogenes là tác nhân vi khuẩn hàng đầu phải được các nhà lâm sàng nghĩ đến Ngoài các tác nhân vi khuẩn trên thì các tác nhân vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumophila cũng là những tác nhân vi khân cần phải được quan tâm
Đó là van đề chung trong tình hình bệnh hô hấp hiện nay Vì vậy quy trình tìm khuẩn gây bệnh
đường hô hấp là rất quan trọng trước hết là lấy bệnh phẩm rồi đánh giá có tồn tại sự có mặt của
khuẩn hay không Theo xét nghiệm thường quy thì bệnh phẩm có liên quan đến bệnh đường hô hấp nhiều nhất được lấy từ mẫu đàm Vì trong bệnh phẩm đàm có chứa rất nhiều vi khuẩn liên quan đến bệnh lý theo khảo sát tại nhiều bệnh viện trong nước
Trang 8
Đàm tươi thường chứa nhiều lao khuẩn ẩn trú dịch phế quản và vùng họng vì vậy đánh giá mẫu
dam là đánh giá khá chính xác nguyên căn bệnh về đường hô hấp.các vi khuẩn thường chứa
trong mau dam gém Staphylococci,Streptococci,Haemophilus influenza ,Klebsiella pneumoniae,
M catarrhalis va bacillus Koch Sy_ c6 mat cia cdc vi khuẩn này theo khảo sát có ảnh hưởng
quan trong đến bệnh lý đường hô hắp
Vi khuẩn là tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp phổ biến nhất Vi khuẩn hiếu khí chiếm ít nhất 73% và nâm chiếm 4% các vi sinh vật phân lập được từ đàm và dịch hút phế quản ở bệnh nhân
Vi khuẩn thường là nhiễm khuẩn đa tác nhân và trực khuẩn Gram âm là các thường gặp Tuy nhiên, MRSA và các cầu khuẩn Gram đương khác kế cả phế cầu (Streptococcus pneumoniae) ngày càng xuất hiện phổ biến Tại các bệnh viện thì các chủng Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens va Proteus sp
chiếm 50% các tác nhân phân lập được từ bệnh pham dudng h6 hap.Trong d6 Escherichia coli
(29,7%), Klebsiella spp (26%), Pseudomonas aeruginosa (13,7%), Staphylococcus aureus (6%), Acinetobacter spp (5%), Haemophilus influenza,(thang 8/2008, khoa vi sinh bénh vién nhan dân Gia Dinh)
Trong tất cả các tác nhân gây bệnh kể trên thi ba tác nhân: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,Klebsiella pneumoniaelà những vi khuẩn thường có mặt trong mẫu bệnh đàm đáng được quan tâm Chính vì lẽ đó, nhóm chúng tôi đã thực hiện quá trình tìm hiéu , quy trình
định danh và phương pháp thực hiện kháng sinh đồ đối với ba loại vi khuẩn này 1.2 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Là những mẫu bệnh phâm đàm của các bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh tại bệnh
viên nhân dân Gia định có chỉ định cấy vi khuẩn, định danh và làm kháng sinh đồ
1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ
Trang 9Tìm hiểu, theo dõi và thực hành thao tác phân lập và định danh,kháng sinh đồ với các chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phan lap tt’ mau bénh
pham dam
s* Nhiệm vụ
Hiểu được nguyên lý, nắm vững các thao tác về lầy mẫu bệnh phẫm, các thao tác trong quy trình định danh, làm kháng sinh đồ v6i ching Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,
Klebsiella pneumoniae trong mau bénh pham dam
1.4PHAM VIDE TAI
Dé tài được thực hiện trên tất cả các bệnh phẩm đàm thu nhận được tại khoa vi sinh bệnh viện
nhân dân Gia định Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo là những thao tác, quy trình đang được áp dụng tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định s* Thời gian Từ 1/03/2013 đến 31/05/2013 %% Địa điểm Khoa Vi sinh Bệnh viên nhân dân Gia Định Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 2 TONG QUAN
2.1 GIỚI THIỆU VẺ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH
Vị trí địa lý: Số 01 Nơ Trang Long, Phường 7, Quận Bình Thạnh, Thành Phố Hồ Chí Minh 2.1.1 Lịch sử hình thành và phát triển
Trang 10Bệnh viện Nhân Dân Gia Định sơ khai do người Pháp xây dựng với bảng hiệu là Hospital de
Gia Định, trong những thập niên đầu của thế kỷ XX
-Năm 1945, Hôpital de Gia Định được đổi tên thành bệnh viện Nguyễn ‘Van Hoc
- Đến năm 1968 bệnh viện được phá đi va xây dựng mới với mô hình 4 tầng để tiếp nhận điều trị khoảng 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và đổi tên thành Trung tâm thực tập y khoa Gia Định
- Từ sau năm 1975, bệnh viện Nguyễn Van Học được đổi tên thành bệnh viện Nhân Dân Gia
Định
- Đến năm 1996, bệnh viện được phân hạng là bệnh viện loại I (quyết định số 4630/QĐÐ-UB-NC)
với nhiệm vụ khám chữa bệnh và là cơ sở thực hành của trường Đại học Y — Dược TP Hồ Chí
Minh
- Từ bệnh viện ban đầu được xây dựng với quy mô cho 450 đến 500 bệnh nhân nội trú và khoảng
1.000 lượt người đến khám chữa bệnh ngoại trú, hiện nay số lượng người đến khám chữa bệnh
ngoại trú trung bình khoảng 3.000 lượt/ngày và bệnh nhân điều trị nội trú trên 1.000 bệnh
Trang
Trang 11
nhân/ngày Trước tình hình qúa tải tram trọng cả khu vực nội trú và ngoại trú, bệnh viện đã được
xây dựng mới khu khám bệnh — cấp cứu 4 tầng với tổng diện tích 10.100 m2, đã đưa vào sử dụng
vào tháng 7/2007
- Hiện tại, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là bệnh viện đa khoa loại 1 trực thuộc Sở Y tế TP Hồ Chí Minh với quy mô 1.200 giường, khám chữa bệnh cho nhân dân sinh sống trên địa bàn TP Hồ Chí Minh (các quận trong tuyến: Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, một phần Quan I va cdc
quận ngoài tuyến: Thủ Đức, Quận 2, 12, 9 ), ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bệnh nhân đến
từ các tỉnh thành lân cận như Đồng Nai, Bình Dương, Vũng Tàu và một số tỉnh miền Trung Bệnh viện có đủ các chuyên khoa lớn, với nhiều phân khoa sâu, bệnh viện được trang bị khá đầy
đủ trang thiết bị y tế nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán, điều trị và chăm sóc bệnh nhân, đáp
ứng được nhu cầu khám chữa bệnh ngày càng cao của nhân dân
Trang 12Phòng chỉ đạo tuyến Phòng hành chính quản trị Phòng kế hoạch tổng hợp Phòng điều dưỡng Phòng tài chính kế toán Phòng vật tư — thiết bị Phòng cán bộ Khoa lâm sàng: Khối nội: Nội tiêu hóa Hồi sức tích cực — chống độc Khoa lão học
Khoa nội hô hấp — cơ xương khớp Khoa nội tiết — thận — niệu
Khoa nội thần kinh — huyết học — y học cổ truyền Khoa nội tim mạch Khối ngoại: Khoa phẫu thuật - gây mê — hồi sức Khoa chấn thương chỉnh hình Khoa tông hợp Khoa ngoại thần kinh Khoa ngoại tiêu hóa Khoa ngoại thận — tiết niệu
Khoa ngoại lồng ngực - mạch máu Khối sản: Khoa sản bệnh Khoa sản phụ Khoa sản trường Khoa sanh Khoa bệnh lý sơ sinh Khoa nhi Chuyên khoa: Khoa tai mũi họng Khoa răng hàm mặt Khoa mắt Các khoa khác: Khoa cấp cứu Khoa khám bệnh Khoa cận lâm sàng: Khoa dược
Khoa dinh dưỡng Khoa sinh hóa huyết học Khoa vi sinh
Khoa chuẩn đoán hình ảnh
Khoa nội soi - thăm dò chức năng
Khoa giải phẩu bệnh lý
Khoa chống nhiễm khuẩn
Trang 13Với nhiều trang thiết bị ngày càng tiên tiến cùng với đội ngũ y bác sĩ giàu kinh nghiệm,bệnh viện
sẽ có nhiều hướng phát triển hơn nữa trong tương lai
2.2 KHOA VISINH 2.2.1 Giới thiệu khoa
Năm 1978, từ khoa xét nghiệm bao gồm sinh hoá - huyết học — vi trùng, bộ phận vi trùng học tách ra để lập khoa riêng với tên gọi KHOA VI TRÙNG hoạt động độc lập với khoa Sinh hoá - Huyết học
Năm 1998, khoa được đổi tên thành KHOA VI SINH cho đến nay
Khoa gồm có 17 công nhân viên chức
Phó trưởng khoa: Ths.Bs Nguyễn Sử Minh Tuyết Cán bộ trên đại học: 01 (thạc sỹ vi sinh y học) Cán bộ đại học: 04 (02 bác sĩ, 02 kỹ sư) Cán bộ trung cấp (kỹ thuật viên xét nghiệm): 11 Hộ lý: 01 2.2.2 Chức năng và nhiệm vụ a Chức năng
Khoa Vi sinh là nơi thực hiện các kỹ thuật về vi khuẩn học, ký sinh trùng học, miễn dịch học
Trang 14s Thực hiện các xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn cho bệnh nhân nội trú và ngoại trú tại bệnh viện Bên cạnh đó, chúng tôi còn thực hiện nuôi cấy vi khuẩn cho các đơn vị bạn: bệnh viện Ủng
Bướu, Bình Thạnh, Quận 1, bệnh viện quốc tế Vũ Anh
» Thực hiện các xét nghiệm miễn dịch học bao gồm: HIV, viêm gan siêu vi A, B, C, sốt xuất huyết Dengue, Helicobacter pylori; xét nghiệm sàng lọc một số bệnh bâm sinh (Toxoplasmosis, Rubella, Cytomegalovirus) Các phản ứng huyết thanh học như: Widal, ASO, RF; thử phản ứng
lao t6 (IDR), test thtr thai
+ Thực hiện nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm; thẩm định kết quả xét nghiệm trước khi trả cho
các khoa lâm sàng
» Thực hiện công tác kiểm tra vô khuẩn chung trong toàn bệnh viện và một số bệnh viện tuyến dưới (bệnh viện Bình Thạnh, bệnh viện Quan 1)
* Theo dõi sự đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được s Nghiên cứu khoa học các đề tài thuộc lãnh vực vi sinh y học
+ Phối hợp với các khoa lâm sàng giải quyết các vấn đề liên quan về chuyên môn, hội chân các
trường hợp nhiễm trùng đa kháng thuốc 2.2.3 Thành tích đạt được
Nuôi cấy các loại bệnh phẩm như máu, mủ, đàm, nước tiểu, phân, các loại dịch (mật, não tuỷ,
màng phổi .); phân lập và định danh các loại vi khuẩn thông thường; tiến hành làm kháng sinh đồ; theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn mỗi 6 thang — 1 nam
+ Kiểm tra vô khuẩn định kỳ các khoa trong bệnh viện, lưu ý các khoa trọng điểm như Hồi sức
Trang 15« Các xét nghiệm miễn dịch học: HIV (Determine, Vironostika, Murex), viêm gan siêu vi (HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, antiHBc-IgM/IgG, antiHCV, antiHAV-IgM/IgG), Toxoplasma gondii (IgM, IgG), Rubella (IgM, IgG), Cytomegalovirus (IgM, IgG)
+ Tham gia công tác ngoại kiểm tra chất lượng của Trung tâm Kiểm chuẩn TP.HCM với đánh giá “Kết quả hoàn tồn phù hợp”
« Hướng dẫn sinh viên các trường Đại học đến thực tập và làm Luận văn tốt nghiệp
s Tham dự và báo cáo trong các hội nghị Khoa học kỹ thuật, lao động sáng tạo — sáng kiến cải tiến trong và ngoài bệnh viện
2.2.4 Hướng phát triển trong tương lai
Triển khai nuôi cấy vi khuẩn ky khí, huyết thanh chân đoán bệnh do ký sinh trùng, các xét
nghiệm sinh học phân tử đáp ứng nhu cầu cung cấp các dịch vụ xét nghiệm chân đốn tồn diện
243 CO SG LY THUYET VE CAC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUÂN GÂY
BỆNH
2.3.1 Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm 2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram
Mục đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước định danh tiếp theo
Trang 16- Phủ tím Genatin lên phết nhuộm trong 1 phút Rửa nước và nghiêng kính đếcho ráo - Phu Lugol lên phết nhuộm trong 2 phút.Rửa nước và nghiêng kính cho ráo
- Rửa acetol lên phết nhuộm, tẩy giọt cuối cùng còn phết tím Rửa bằng nước và nghiêng kính cho ráo
- phủ lại với dung dịch Safranin trong 30 giây Rửa nước và thấm khô vết nhuộm
- Quan sát ở vật kính dầu
Đọc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ mầu tím của tím gentian, vi khuẩn Gram âm giữ màu hồng đỏ của Safranin
2.3.3 Phương pháp định danh sinh hóa
Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên các loại môi trường khác nhau như MC,
BA, Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh
Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh
* Thử nghiệm khả năng lên men
Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2, Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường s Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-
Trang 17Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả2 loại men lactose permease va B-galactosidase Mot số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được B-galactosidase Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi B-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng
+ Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối
ammonium làm nguồn đạm duy nhất.Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường
* Thử nghiệm Urease
Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa Chất chỉ thi Phenol Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường
chuyển sang màu đỏ
* Phenylalanine deaminase (PAD)
Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% dé cho ra màu xanh lá cây
* Thử nghiệm bile esculine
Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen * Thử nghiệm khả năng sinh indol
Trang
Trang 18
Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ
s Thử nghiệm VP (Voges — Proskauer)
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao
đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành
diacetyl, đưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ + Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường Các vi sinh vật biến đưỡng malonate sẽ sửdụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một
chất diệt khuẩn Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng
ammonium là nguồn đạm duy nhất Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự
phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH
* Thử nghiệm KIA
Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1% Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:
+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid Điều này có thẻ giải thích do visinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít oi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Ở phần sâu trong môi
trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men ky khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH
Trang 19+ Nếu vi sinh vật có thê sử dụng cả glucose và lactose, tồn bộ mơi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton đẻ tạo năng lượng
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng đề biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật Tuy nhiên, do pepton
chỉ được biến đưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của
bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu
trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu
Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ
các khí này đây ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch Thử nghiệm này cũng có thé phát hiện khả
năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate Vi sinh vật khử sulfate
có thể khử hợp chất này đề giải phóng H2S Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng
tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi
trường
sThử nghiệm tính di động
Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium
chloride dé phat hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất
này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ * Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axit amin đặc hiệu đề xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện ky khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự
đổi màu của chỉ thị pH
Trang
Trang 20
Thử nghiệm MR
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong qusa trình taaoj và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose Vỉ sinh vật lên men glucose tap và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến thành các sản phẩm trung tinh,
không làm đổi màu thuốc thử
-chất chỉ thị màu Ph môi trường là methyl red đỏ
-môi trường thử nghiệm: môi trương VP-MR -Sau thử nghiệm: môi trường chuyền sang đỏ :+
Môi trường không đổi màu: -
Thử nghiệm catalase
Dùng để phân biệt vi khuẩn hiếu khí va vi khuẩn ky khí Vi sinh vật hiếu khí có enzyme
catalase, có khả năng phân giải H2Oa thành HO và Oz Hóa chất : H20230% dugc giữ lạnh
Nhỏ một giọt sinh khối lên H2O2: Néu sui bọt : +
Nếu không sủi bọt :-
(BO SUNG THU NGHIEM VA HINH ANH)
Cách tiến hành Bộ hóa chất bao gồm:
Trang 21- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng đương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm
tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen
+ Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng
- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành
huyền dịch có độ đục McFarland 2,0
- Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống
chưa các thử nghiệm tượng ứng
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ
-Đọc kết quả theo bảng 2.1
Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm
Trang 22Ket qua thử nghiệm OOO OOOOOOOOOOO GUU NIT a ONPG URE PAD 2 4 Tổng số điểm tông cho từng nhóm
[ Sô điệm nẻn nhu ket qua dvong tinh
Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa
ve MLO | LOC MOB 1 2 4 1 2 F—rL Ì
Thuốc Kết quả thử nghiệm
Giéng | Ký Thử nghiệm | thử thêm
số hiệu sinh hóa vào (+) (-)
1 GLU Lén men Vang tim glucose 2 NIT Khử nitrat Tìm nitite Đỏ/hồn/xuất hiện vòng 3 Càng thành nitite phút nhạt 3 ONPG Thủy giải Vàng nhạt ONPG 4 URE Sinh urease Đỏ cánh sen Càng/đỏ nhạt 5 PAD Phenyl alanine | FeCls Xánh lá (xuât hienj khibỏ | Vàng deaminase thuốc thử) nhạt 6 CIT Sử dụng citrate Xanh biên (có ánh xnah Xanh lá/ biển) vàng 7 ESC Thủy giải Đen( có màu từ đen nhạt Không
Esculine qua đen đậm) đen
§ HaS Sinh H;S Đen (xuát hienj dưới đáy Không
Trang
Trang 23
giếng, mắt màu khi nhỏ đen kovac) IND Sinh indol Kovac Đỏ bê mặt (đọc sau I phút) | vàng bê mặt 9 VP Voges- KOH+napthto | Đỏ(xuất hiện 5 phút) Vàng prokauer 1 nhạt 10 MLO Sử dụng Xanh biên Xanh malonate lá/vàng Đọc kết quả định danh
hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hinh 2.1
3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHÀN NÀY CHƯA NĂM RÕ CÀN TÌM HIỂU KỸ)
Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC (SPUTAPREP-QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đàm Tiến hành như sau:
~ Trong một tube 15 ml vô trùng (loại Falcon) đã chứa 10 ml nước muối sinh lý vô tring (NS), cho thêm vào 50 mg NALUC (NĐ-Acetyl-L-Cystein), tức là tồn bộ bột NACL chứa trong một tube Eppendorf Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và đủ cho 2 — 3 mẫu Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 4 °C
- Lay một thể tích đàm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha Lắc nhẹ cho đến khi đàm tan trong dung dịch này Như vậy chúng ta đã có đàm pha loãng 1/2 Sau khi đàm tan hồn tồn, pha lỗng tiếp mẫu đàm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng Như vậy chúng ta đã có mẫu đàm pha loãng 1/20
Trang 24va 1 ml (0,001 ml) hay dùng micropipett để hút 10 pl va 1 pl cay lên mặt thạch Với mẫu đàm pha loãng 1/20, dùng khuên cAy 1 pl hay ding micropipet dé hit 1 pl cay lên mặt thạch và cũng như trên 3 loại hộp thạch như trên Phương pháp cấy định lượng trên mặt thạch được thực hiện
như cấy định lượng nước tiểu Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường
CO; còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ 1a 35 — 37 °C, thoi gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ Đọc kết quả và định lượng các vi khuẩn mọc trên các hộp thạch như trong bảng trình bày sau:
Bảng 1 : Cach doc két quả định lượng các loại vi khuẩn trong mẫu đàm dựa trên số lượng các loại khóm vi khuẩn mọc trên các hộp thạch
Hộp thạch Mẫu đàm pha Vòng cây định | Thê tích đàm Sô vi khuân được
loãng lượng được cấy định lượng
1 12 10 pl 5ụI 2N x 102/ ml
2 1/2 1ml 0,5 ul 2N x10/ ml
3 1⁄20 Tl 0,05 ul 2Nx 10ml
Đàm pha loãng 1/2 Đàm pha loãng 1/20
trong dung địch P ang
NALC trong NS
Trang 25
Sơ đồ cấy định lượng mẫu đàm trên các hộp thạch
NÑ là số khóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch Để có con số định lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả Ví dụ: ứng với các khóm nghỉ ngờ K pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MCI là 200 khóm, lượng vi khuẩn K pneumoniae trong 1 ml dam 14 40000 CFU/ml (2 x200 x 107); trén hép thach MC2 là 15, lượng
vi khuan / ml dam 1a 30000 CFU/ml (2 x 15 x 103); và trên hộp thạch MC3 1a 3, lượng vi khuẩn
là 60000 CFU/ml (2 x 3 x10) Như vậy kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K pneumnoniae trong
mẫu đàm sẽ được tính là (40000 + 30000 + 60000)/3 = 43333 CFU/mIl Nếu các hộp thạch 1 và 2
có vi khuẩn quá nhiều (> 200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3
Bàn luận và kết quả
- Các vi khuẩn có lượng > 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ Có nghĩa là
tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khuẩn nào mọc được trên hộp thạch 2
và 3 hay có số lượng > 5 trên hộp thạch 1 Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi
khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghỉ sử dụng.(theo TS.Phạm
Hùng Vân)
-Tuy vậy, tùy từng Labo xét nghiệm chọn các vi khuẩn có hrgng tir 103 — 107 CFU/ml dé tién
hành làm kháng sinh đồ
2.3.4 Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY
2.3.5 Chuẩn bị môi trường
Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cắt trung tính, kiểm tra pH trước
khi hấp tiệt khuẩn Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dai hon sự cần
thiết, vì điều đó sẽ làm giảm khả năng đệm và thay đổi pH của môi trường Sau khi để nguội môi
Trang
Trang 26
trường tới 50 — 60%C (có pH khoảng 7,2 — 7,4) có thể thêm máu hoặc các sản phâm của máu, lắc cho đều và đỗ vào dia petri da vô khuẩn với độ dày 3,5 — 4,5 mm (có nghĩa 25 ml thạch cho một
đĩa Petri đường kính 90 mm hoặc 40 ml thạch cho đĩa có đường kính 110mm v.v ) Các đĩa nay
phải đặt trên mặt phẳng nằm ngang để đảm bảo cho độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa bằng nhau Để đĩa môi trường nguội ở nhiệt độ phòng rồi bảo quản trong túi nilon ở tủ lạnh 4 — 80C Các đĩa thạch này được dùng trong vòng 7 ngày kể từ ngày chuẩn bị
Các đĩa thạch có máu hoặc chế phẩm của máu phải được kiểm tra vô khuẩn trong tủ am qua dém mới được sử dụng
Ria cấy vi khuẩn:
Sau khi vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy qua đêm trên các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5 — 10 khuẩn lạc (hoặc 3 vị trí khác nhau, nếu vi khuẩn ở trong ống) đề tránh
phải các vi khuẩn đột biến, nghiền vào một ống PBS (hoặc nước muối sinh lý) vô trùng, lắc đều
bằng máy lắc Votex, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá thì cho thêm PBS hoặc nước muối sinh lý; ngược lại nếu không đủ đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn
dịch vi khuẩn = 108 CFU/ml Dùng que tăm bông vô trùng nhún vào hỗn dịch vi khuẩn trên ép
vào thành ống cho bớt nước, rồi ria đều khắp với những đường bắt chéo nhau 1200 lên mặt thạch đã được để trong tủ ấm cho khô (nhưng không quá 30 phút)
Chuẩn bị khoanh giấy kháng sinh:
Lấy ống khoanh giấy kháng sinh từ tủ lạnh để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho thăng bằng nhiệt độ
giữa trong và ngoài ống
Đặt các khoanh giấy đã chọn lựa với từng vi khuẩn được thử sao cho mặt của khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa 15 mm và khoanh nọ cách khoanh kia 20mm Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, rồi để môi trường trong tủ ấm 350C qua đêm Các đĩa thử với cdc ching H.influenzae, S
pneumoniae và phải đễ trong tủ ấm có 5 -10% COz
Trang 27Dùng thước đo đường kính vùng ức chế, dựa vào tiêu chuẩn của từng hãng sản xuất khoanh giấy
kháng sinh, ta có mức độ nhạy cảm, trung gian và kháng của từng loại vi khuẩn
(BIEN LUẬN TÍNH KHÁNG *ĐƯỜNG KÍNH VƠ KHUÂN*) 2.4 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu bệnh phẩm đàm
Đàm tươi thu nhận được từ các bệnh nhân có bệnh lý liên quan đến đường hô hấp như suy hô
hấp, viêm phổi do vi trùng, thoe dõi tràn khí màn phổi, cường giáp,
Trong mẫu đàm có chứa nhiều tác nhân đích gây bệnh như chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae
2.4.1 Haemophilus influenzae
a lịch sử và tên gọi
H influenzae duge phan lập lan dau béi Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị
viêm phổi - cúm trong đại dịch cúm năm 1890 Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên
nhân gây ra bệnh cúm nên được gọi là trực khuẩn cum (Influenzae bacteria) Mai cho đến khi đại dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H influenzae chỉ là thành viên
của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải lúc nào cũng gây bệnh Đến năm
1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên của bệnh cúm, vai trò của ÖI in/luenzae mới được làm sáng tỏ: virus cam gay ra bénh cam, con Haemophilus influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng nề bởi virus cúm Vì
vậy, vi khuan nay cé tén 1a H influenzae duge xuat phát từ nhu cầu đòi hỏi môi trường giàu chất
đinh dưỡng, đó là các yếu tố phát triển có ở máu (Haemophilus: ưa máu), đặc biệt là yếu tố X
(hemin) và yếu tố V (NAD hoặc NADP) Thêm vào đó, vi khuẩn này lại có mối liên quan lịch sử
với bệnh cúm (Inffuenzae: bệnh cúm) Cho nên, vi khuẩn được gọi tên là như vậy Đặc điểm sinh học đặc trưng của Haemophilus influenzae typ b
Trang
Trang 28
b Hinh thái và cấu trúc
H influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, còn được gọi là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0—1,5um) nhưng uốn cong ở hai đầu trông như hình cầu Tuy nhiên, khi vi khuân này ở địch não tuỷ hình thể có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều dài thông thường (Hình 1.1) H influenzae c6 đặc tính bat mau Gram am, khong di động và không hình thành nha bào Thành tế bào vi khuẩn này có cấu trúc bề mặt lipopolysaccharide—
protein tương tự như thành của các vi khuẩn Gram âm khác Ngoài ra, H in/iuenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại không vỏ polysaccharide (non-typeable không xác định được typ huyết
thanh) và loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh) Loai H influenzae (Hi) cd v6 boc
được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh tir a dén ƒ tuỳ thuộc vào đặc tính kháng nguyên
của vỏ polysaccharide do gen qui định Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP) Polysaccharide bé mat nay liên
quan mạnh mẽ đến tính gây độc của vi khuẩn, đặc biét 1a H influenzae typ b (Hib), 1a nguyén nhân của nhiều trường hợp nhiễm trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng não mủ
Trang 29Trên thực tế lâm sàng, nếu nhuộm gram bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân mà trên vi trường cho thấy nhiều vi khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái thì đây là dấu hiệu rất quan
trọng gợi ý cho chân đoán sớm viêm màng não mủ do H influenzae typ b
Sức đề kháng
H influenzae typ b là loại vì khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại cảnh Trong
bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu đề ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh
giá Các chất sát khuẩn thông thường tiêu diệt vi khuẩn này một cách đễ dang
Vì vậy, bệnh phẩm đề chân đoán vi sinh nên được vận chuyền về phòng thí nghiệm trong
vòng 2h, hoặc không quá 6h ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (24 - 28°C) Nếu là tăm bông phải giữ
trong môi trường vận chuyển (bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8°C tối đa 24h trong môi
trường vận chuyển
c Đặc điểm nuôi cấy
% Điều kiện nuôi cấy
H influenzae là loại vì khuẩn khó nuôi cấy Chúng không mọc trên các trường nuôi cấy
thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả hai yếu tố X và V Yếu tố X có lẽ không phải là một chất thuần tuý mà là hỗn hợp của các chất màu có chứa sắt (như hemin và
hematin), khi không có hai yếu tố này trong môi trường nuôi cấy thì chúng không phát triển được
H infiuenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase, peroxidase va các
cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử Máu và các sản phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng để sản xuất yếu tố X Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố X mà ïi influenzae can thiết phát triển Khi dùng hematin tinh
chế thì nồng độ cần thiết là 0,1 — 1,0 ug/ml Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt trong
máu, nhưng một phần do chúng nằm bên trong tế bào Mặt khác, trong máu của nhiều loài động vật có NADase, nên trong máu tươi không có NAD ở dạng tự do Trong thạch chocolate, NAD
được giải phóng ra khỏi tế bào và NADase bị phá huỷ Khi dùng NAD tỉnh chế, nồng độ cần
thiết là 0,2 - 1,0 pg/ml
Trang
Trang 30H influenzae hiếu khí, đòi hỏi CO› (2-5%) khi mới phân lập Mọc tốt trên môi trường
chocolate và Levinthal ở nhiệt độ khoảng 23-39%C, tối ưu là 370C Không mọc được trên thạch
máu cừu; nếu mọc trên các loại thạch máu khác (ví dụ máu thỏ) thì không gây tan máu và khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cùng các điều kiện nuôi cấy khác Cũng trên thạch máu, người ta thấy các khuẩn lac H influenzae moc xung quanh cdc khuan lac Staphylococcus aureus bội nhiễm thi rat to, trong khi đó ở những vùng xa thì hoặc là không mọc, hoặc là rất bé Hiện tượng này gọi là hiện tượng “vệ tỉnh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi khuẩn bội nhiễm đó giúp H influenzae phát triển được trên thạch máu thông thường
(nếu
Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae nén
Trang 31
q) (2)
Hinh: (1) Khuan lac H influenzae moc tron mui trường chocolate ; (2) Khuẩn lac H
influenzae moc trờn mụi trường thạch máu thỏ tươi 7% Sau 18 - 24h, quan sát các khuẩn lạc của
H influenzae mọc trên môi trường với đặc điểm: khuẩn lạc nhỏ kích thước khoảng 1-2 mm, tròn, vồng nhẹ và hơi trong, óng ánh khi chiếu sáng và khụng gây tan huyết
Sau 16 - 18h nuôi cấy, Haemophilus influenzae phát triển thành những khuẩn lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1- 2mm và khụng gõy tan huyét Vi khuan Hib luôn có vỏ, khuẩn
lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn
Ngồi ra, mơi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indole) Sau 24 - 48h, trang thai mat vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mắt, vi khuẩn tự ly giải và có thé tính chất bắt màu Gram thay đổi
Trên môi trường lỏng, Haemophilus infÏuenzae thường phat triển làm đục môi trường
Tinh trang mat vỏ xảy ra sớm hơn trên môi trường thạch, vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn
thời điểm nuôi cấy thích hợp (18h)
d Dac điểm phân biệt các loài khác nhau của Haemophilus
Trang
Trang 32
Những đặc điểm này cũng cần phân biệt với các loại eamophilus khác ở những đặc điểm sau đây: Tinh chat k x k £ x k k x Tan huyét Can yêu tô X Cân yêu tô V Cân COz Loài H influenzae - + + + H parainfluenzae - - + - H hemolyticus + + + - H.parahemolyticus + - + + H aphrophilus - + - + H paraphrophilus - - + + Bang ???: Nhitng dic diém sinh hoc sinh học để phan biét H influenzae vi cdc Haemophilus khac
e Tính chất sinh hóa đặc trưng của H influenzae và phương pháp xác định
Tính chất sinh hóa đặc trung cua H influenzae 1a nhu cau doi hoi bắt buộc 2 yếu tố phát
triển là X và V trong môi trường nuôi cấy Tính chất này có thể được xác định bằng một trong các thử nghiệm sau :
- Thử nghiệm với yếu tố X và V:
Sử dụng một đĩa môi trường thạch dinh dưỡng Trypticasein Soya, cây vi khuẩn phân lập được nghỉ ngờ là H in/iuenzae lên một nửa đĩa thạch bằng cách ria dày theo 3 hướng Sau đó,
đặt các khoanh giấy X, V và XV lên vùng nuôi cấy, khoảng cách giữa các khoanh giấy là 1,5 -
2,0 em Ủ ở 37°C với khí trường 5% CO2 qua đêm rồi đọc kết quả:
+ Nếu vi khuẩn chỉ mọc xung quanh khoanh giấy XV hoặc giữa 2 khoanh giấy X và V thì đó chính là H influenzae, nếu chỉ mọc xung quanh V thì đó là H parainfiuenzae
Trang 33
Hình: Thử nghiệm với yếu tố X, V bằng 2 khoanh giấy X, V cho kết quả là vi khuẩn đòi
hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X, V cho sự phát triển
Hình Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV, cho thấy vi khuẩn đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu tố X và V cho sự phát triển
Trang
Trang 34
Hình: Vi khuẩn chỉ đòi hỏi bắt buộc phải có cả 1 yếu tố V cho sự phát triển (H parainfluenzae) - Thử nghiệm "vệ tinh": Hình: Thử nghiệm "vệ tỉnh" dương tính
Được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn phân lập được nghỉ ngờ là H influenzae lên cả
đĩa thạch hoặc một nửa đĩa thạch máu thỏ (5%) với các đường ria dày theo 01 hướng Sau đó,
bằng kỹ thuật vô trùng, dùng que cấy lẫy khuẩn lạc S aureus chuan quéc tế cấy một đường thắng lên bề mặt đĩa thạch máu vuông góc với các đường đã nuôi cấy vi khuẩn nghỉ ngo H influenzae Để đĩa thạch mỏu đã nuôi cấy vào tủ ấm ở 379C, 5 - 10% CO2 khoảng 18 - 24 giờ thì đọc kết quả (hình 1.6)
Trang
Trang 35
+ Nếu trên đĩa thạch mỏu chỉ xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn thử nghiệm mọc xung quanh đường cấy cua vi khuan S aureus thì được chân đoán là thử nghiệm "vệ tinh" dương tính (vi khuẩn Š øureus có khả năng gây tan máu, do đó sẽ giải phóng ra yếu tố V từ trong tế bào hồng cầu Kết quả môi trường thạch máu ban đầu chỉ có yếu tố X, nay có thêm yếu tố V)
+ Nếu trên đĩa thạch máu xuất hiện những khuẩn lạc mọc hầu hết trên môi trường hoặc
không thấy vi khuẩn thử nghiệm mọc, được chân đoán là thử nghiệm "vệ tỉnh" âm tinh
- Xác định nhu cầu đòi hỏi bắt buộc 2 yếu tố phát triển X và V bằng đĩa thạch
Haemophilus Quad ID:
Hinh: Dia thach Haemophilus Quad ID
Dia thach Haemophilus Quad ID dugc chia ra thành 4 phần (như hình 1.7): 1/4 đĩa thạch
với môi trường có chứa haemin (yếu tố X), 1⁄4 đĩa thạch với môi trường có chứa NAD (yếu tố
V); 1/4 khác của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V; 1/4 dia thạch còn lại của
với môi trường thạch máu ngựa 5% dùng để phân biệt giữa H hemolyticus (cũng đòi hỏi bắt
buộc phải có 2 yếu tố phát triển là X và V, nhưng lại có tính chất gây tan máu) với H infÏuenzae
Tiến hành thử nghiệm:
+ Pha chủng vi khuẩn nghỉ ngờ HH infiuenzae thuần vào canh thang Trypticase soy hoặc
nước cất dé có độ đục tương đương với 0,5 Mc Farland
+ Sử dụng que cấy vô trùng lấy đầy một ăng huyền dịch vi khuẩn cần xác định cấy zích zac lên từng 1/4 dia thach Haemophilus Quad ID, bat đầu từ 1/4 có chứa yếu tố V và kết thúc ở
Trang
Trang 361/4 có chứa thạch máu (chú ý: cấy tồn bộ mơi trường ở từng 1/4 đĩa thạch, bắt đầu từ phía thành
đĩa tới trung tâm của đĩa thạch Chọc que cấy vào phần 1/4 đĩa có chứa thạch máu đề xác định
tính chất gây tan máu yếu)
+ Ủ môi trường nuôi cấy ở 37°C với khí trường 5% CO¿ qua đêm rồi đọc kết quả bằng cách quan sát vùng thạch máu để xác định tớnh chất gây tan máu và các vùng khác đề xác định
vi khuẩn có mọc hay không
Chỉ có yếu tố X Gồm có yếu tố X và V
Chỉ có yếu tố V -
Môi trường thạch máu ngựa (có các khuẩn lạc gây tan máu)
Hinh: Dia thach Haemophilus Quad ID: cho thấy vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vùng: vùng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch lại của
Trang 37Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vựng: vựng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có
chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch với môi trường thạch máu ngựa 5% nhưng không cú
kèm theo tan mau thi day la H influenzae
Nếu vi khuẩn thử nghiệm mọc trên cả 2 vựng: vựng 1/4 của đĩa thạch với môi trường có
chứa cả 2 yếu tố X và V và 1/4 đĩa thạch chứa môi trường thạch máu ngựa 5% nhưng cú kèm
theo tan mau, day la H hemolyticus (khéng phai H influenzae)
2.4.2 Vikhuan Klebsiella pneumoniae a Dac diém phan loai
Nam 1884, nha khoa hoc ngwoi Dan Mach Hans Christian Gram (1853-1938) da phat triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae va Streptococcus pneumoniae Klebsiella
được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức thế ki 19, Edwin Klebs
Dựa vào độ tương đồng di truyền, chỉ Klebsiella được chia làm 8 loài: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiellaterrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolyticavà Klebsiella variicola Klebsiella pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ làKIlebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae va Klebsiella rhinoscleromatis Sự phânchia này dựa theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ không phải dựavào khoảng cách di truyền Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae làthành viên quan trọng nhất về bệnh học và đã trở thành một trong những tác nhângây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây
Trang 38Họ: Enterobacteriaceae Chỉ: Klebsiella
Loai: Klebsiella pneumoniae
b Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố
Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng Lớp áo này giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệcủa tế bào chủ
Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét của khuẩn lạc K pneumoniae
K pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose K pneumoniae có phản ứng
indole âm và có khả năng tăng trưởng với cảmelezitose và 3-hydroxybutyrate
Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên như ở đất, nước, nước thải, các sản phẩm thực vật, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao.Nó có thể gây ra những thay đổi phá hoại đến phổi của con người
K pneumoniae cé thé gây ra bệnh viêm phổi Klebsiella Chúng gây ra các thay đổi phá hoại
phổi người và xuất huyết với tế bào chết ( hoại tử ) mà đôi khi sản xuất, dày, đờm, máu chất
nhầy (currant thạch đờm)
Trang
Trang 39
Klebsiella pneumoniaephân lập được từ các bệnh phẩm trên người như viêm phổi, apxe phổi, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng huyết
c Các nhân tố gây bệnh
Klebsiella pneumoniae biểu hiện 2 loại kháng nguyên bềmặt: kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide và kháng nguyên vỏ K có bản chất polysaccharide Có khoảng hơn 80 kháng nguyên K và 9 kháng nguyên O Cảhai kháng nguyên này là cơ sở cho sự phân nhóm huyết thanh và đều góp phần vào quá trình phát sinh bệnh Dựa vào tính biến động trong cấu trúc của
những kháng nguyên này, người ta lại phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau Độc tính của tất cả các loại huyết thanh dường như là như nhau
Klebsiella pneumoniaecó khả năng đông tụ hồng cầu nhờ những lông lipi
Để vượt qua hàng rào phòng vệ của tế bào chủ, ngồi việc thốt khỏi sự thực bào do hoạt động
của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải còn phải tìm cách thoát khỏi ảnh hưởng của các chất
diệt khuẩn trong huyết thanh Hoạt tính diệt khuẩn chủyếu qua trung gian các protein bổ thể Bổ
thể được hoạt hóa khi có hay không có kháng thể đặc hiệu nhưng đều dẫn tới hoạt hóa protein
C3, hình thành opsonin C3b và sản phẩm cuối cùng là protein C5b-C9 Protein này tạo ra các
kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm cho Na+ được bơm vào trong, thay đổi ấp
suất thâm thấu bên trong tế bào vi khuẩn Cho tới nay, cơ chế giúp vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ., giả thuyết được đưa ra là do lớp vỏpolysaccharide bao bọc và che lớp
lipopolysaccharide nằm ở đưới hoặc do chuỗi bên của kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo
thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bồ thé
Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủsắt Đây là nhân tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn, có chức năng xúc táccác phản ứng oxi hóa khử trong
quá trình truyền điện tử
d Đặc điểm gây bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh
Klebsiella pneumoniae là tác nhân đứng thứ 2 sau E.coli gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng Chúng có thể gây bệnh viêm phổi, apxe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm trùng ngoài
Trang
Trang 40
phổi như viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu Yếu tố nguy cơ đề nhiễm các chủng này ở bệnh viện là do bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm
lắn như đặt Ống thông tiểu, đặt nội khí quản, Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella
tăng cao chủyếu do việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng những chủng kháng thuốc.Tính đề kháng kháng sinh của chúng là rất cao
2.4.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS
og Đặc điểm sinh học Nguồn gốc_ vị trí phân loại:
Nguồn gốc:
Staphylococcus c6 nguồn gốc từ tiếng Latinh Staphylo (chùm nho) Coccus (hạt) Năm 1871 Recklinghausen thu nhận cầu khẩu trong thận chết do nhiễm khuẩn huyết
Staphylococcus aureus do Robert Koch phát hiện vào năm 1878 phân lập từ mủ u nhọt và Loius
Pasteur (1880) đều nghiên cứu về tụ cầu từ lịch sử đầu của ngành vi sinh vật học
Ngày 9 tháng 4 nim 1881, bac si Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phau Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn
(Staphylococcus), trinh bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng
Năm 1882 Rosenbach nghiên cứu và đặt tên cho cầu khuẩn tạo khuẩn lạc màu vàng là Staphylococcus pyrogen aureus.(tl:luanvan.co/luan-van/tong-quan-ve-staphylococcus-aureus-
2021/)
Năm 1926 Julius von Daraniy là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagula huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến nay 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi
Vi trí phân loại: