Các phương pháp định danh và định lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus

Trước khi nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá. Sau đó tiến hành nuôi cấy và xác định khuẩn lạc đặc trưng. Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 11,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 25 mm (do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3 )và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase của S.aureus) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do S.aureus có khả năng lên men mannitol, sinh acid sẽ làm đổi màu chất chỉ thị đỏ phenol trong môi trường Chapman từ đỏ sang vàng ) (Mary K. S. và cs, 2002).

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VÀ ĐỊNH LƯỢNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

GVHD: TS.Trần Thị Ngọc Yên HVTT: Nhóm 1

Nguyễn Hồng Phương Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường Bair-Paker và Chapman

Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus

Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát dưới kính hiển vi

Hình 4: Kết quả thử nghiệm Oxidase dương tính và âm tính9

Hình 5: Kết quả thử nghiệm Coagulase

Hình 6: Vòng vô khuẩn khi thử nghiệm kháng sinh11

Hình 7: Đĩa giếng plastic sử dụng trong kĩ thuật ELISA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus

Bảng 2: Kháng sinh đồ của Staphylococcus aureus ATCC 25923

Chương 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.1.Đặc tính hình thái và sinh hóa của Staphylococcus aureus

 Hình thái:

S aureus là những vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.5-1.5 µm, tế bào xếp thành

hình chùm nho, không di động, không tạo bào tử

 Sinh hóa:

• Gram ( +)

• Catalase ( +)

• Oxidase (-)

• Enzyme Coagulase (+)

• Thermonuclease (+)

• DNAse (+)

• Phosphatase (+)

• Sử dụng: glucose (+), manitol (+), trehalose (+), sucrose (+)

1.2.Các môi trường chọn lọc Staphylococcus aureus

Có nhiều môi trường chọn lọc để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là S.aureus Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng khả năng chọn

lọc Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium chloride và nhiều kháng sinh khác nhau Một số môi trường dùng để phân lập và xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm là : môi trường Staphylococcal 110, thạch Vogel-Johnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch tellurite-polymixin-egg yolk và Baird-Parker

Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus

Gelatin

2 Vogel-Johson Potassium telluriteLithium chloride

Glycin

Manitol Tellurite Phenol red

3 Egg yolk-sodium azide Potassium telluriteLithium chloride

Polymixin B sulfate

Egg yolk Tellurite

4 Baird-Parker Potassium telluriteLithium chloride Egg yolk

Tellurite

Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường, chưa

bị tác động Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản, điều kiện bất lợi,

khi vi khuẩn bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus cần sử dụng

môi trường Baird-Parker, là môi trường thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị tổn thương

1.3 Các phương pháp truyền thống định danh Staphylococcus aureus

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy

Trước khi nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá Sau đó tiến hành nuôi cấy và xác định khuẩn lạc đặc trưng Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc

trưng của S aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc

có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3 )và khả năng

thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase của S.aureus) (Rosamund M B và cs, 1995; Mary

K S và cs, 2002)

Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung

quanh khuẩn lạc (do S.aureus có khả năng lên men mannitol, sinh acid sẽ làm đổi màu

chất chỉ thị đỏ phenol trong môi trường Chapman từ đỏ sang vàng ) (Mary K S và cs, 2002)

Nhuộm Gram

S.saprophyticus S.epidermidis

(+)

(S)

Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường Bair-Paker và Chapman

1.3.2 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa

Các bước thử nghiệm sinh hóa để xác định S.aureus ở sơ đồ hình 2

Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus

• Bước 1: Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, ta sẽ xác định vi khuẩn có

dạng cầu khuần

• Bước 2: Tiến hành nhuộm gram để phân biệt Staphylococci và Streptococci.

Staphylococci sẽ bắt màu gram (+) có màu xanh tím khi quan sát dưới kính hiển

vi

Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát dưới kính hiển vi

• Bước 3: thử nghiệm Oxidase: phân biệt Staphylococcus (âm tính) với

Micrococcus (dương tính) Phản ứng Oxidase dương tính có hiện tượng đổi màu

thuốc thử sang màu xanh tím, âm tính không đổi màu

Hình 4: Kết quả thử nghiệm Oxidase dương tính và âm tính

• Bước 4: Thử nghiệm Coagulase: dùng để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu

khác Tụ cầu vàng S.aureus do có enzyme coagulase nên gây đông huyết Những

tụ khác không có coagulase không gây đông huyết tương

Hình 5: Kết quả thử nghiệm Coagulase

• Bước 5: thử nghiệm tính kháng kháng sinh polymycin B Đặt polymycin trên môi

trường Mueller Hinton Agar (MHA): đo vòng vô khuẩn R<=10 mm là

Staphylococcus aureus.

1.3.3.Phương pháp xác định S.aureus bằng kháng sinh đồ

Phương pháp này thường được dùng trong y học để xác định S.aureus Kỹ thuật

kháng sinh đồ thực hiện theo phương pháp của Kirby Bauer, còn gọi là phương pháp định tính khuếch tán kháng sinh trong thạch Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại vi khuẩn sẽ có mức độ nhạy với khác nhau với các loại kháng sinh, mức độ này thể hiện mức độ khuếch tán của kháng sinh trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nó được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn (không có vi khuẩn mọc trong vòng vô khuẩn) Sau đó sẽ so sánh kết quả thử nghiệm với các bảng chuẩn về vòng vô khuẩn đã được xây dựng cho mỗi loài Các bước tiến hành như sau:

• Pha dịch khuẩn thử nghiệm (Staphylococcus aureus) trong NaCl 0.85%, so với

ống đục chuẩn 0.5Mac Farland có mật độ tương đương 108 vi khuẩn/ml

• Trải dịch khuẩn lên thạch Mueller Hinton Agar (MHA)

• Thử nghiệm với 2 kháng sinh : Clindamycin (2 µg/ml), Cefoxitin (30 µg/ml)

• Đặt khoanh giấy chứa kháng sinh lên mặt thạch MHA đã trải vi khuẩn (2 khoanh giấy kháng sinh/ 1 đĩa môi trường), sau đó mang ủ 37 0C/18-24h

• Kết quả: sau khi ủ 18 giờ, đo được đường kính các vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn (bảng 2), đường kính được tính ra milimet Đường kính này đựơc chia thành các mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng chuấn theo hướng dẫn của tài liệu CLSI

• Trong điều trị thường thử nghiệm nhiều loại kháng sinh cùng lúc kết quả kháng sinh đồ được chia thành các loại A, B, C, U, O để ưu tiên chọn lọc trong điều trị

Hình 6: Vòng vô khuẩn khi thử nghiệm kháng sinh

Bảng 2: Kháng sinh đồ của Staphylococcus aureus ATCC 25923

1.4.Các phương pháp hiện đại để định danh S.aureus

1.4.1.Phương pháp ELISA:

(Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ) là 1 kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu xét nghiệm Hiện nay, Elisa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt là trong kiểm tra an toàn trong các sản phẩm sinh học Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng Mỗi giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm

• Phương pháp Elisa trực tiếp (direct Elisa): dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

• Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa): dùng dể phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh

 Nguyên tắc kỹ thuật Elisa:

Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng và sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp như: horeseradich perosidase hay alkaline phosphatase Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu, KN sẽ tạo phức hợp với

KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép (sandwich) Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi

sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện của KN Cần tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện phản ứng Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106 CFU/ml

 Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus:

Chuẩn bị vật liệu:

• Chuẩn bị các KN: S aureus được nuôi cấy trên môi trường Staphylococal 110

ủ ở 370C trong 24h Thu chủng vi khuẩn với dung dịch muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin0.3% và đun nóng ở 1000C trong 1h

• Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch vi khuẩn dưới da với lượng 0.5; 1;

1.5 và 2ml trong khoảng 4 ngày Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus

được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu nhận máu và huyết thanh khi giết

• Tinh sạch và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh sạch

một phần thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate và hàm lượng protein đã được ước tính bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của huyết thanh bò albumin

• Sự tiếp hợp KT-enzyme: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp

hợp với một phần KT tinh khiết của thỏ

• Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phosphate)

được đổ vào từng giếng ủ ở 40C trong 24h Sau đó, các giếng được rửa năm lần với dung dịch đệm rửa Các KT được giữ cố định bởi 100µl dung dịch đệm phosphate (PBS) đổ vào từng giếng và ủ ở 370C trong 24h Sau khi ủ, các giếng

đã được rửa sạch bằng đệm rửa

Phương pháp thực hiện:

• Elisa trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme Các tiếp hợp enzyme này pha loãng trong PBS ở các nồng độ là 1:100; 1:200; 1:400 và 1:

800 100µl PBS được thêm vào mỗi giếng

tục thêm 50µl H2SO4 1M (thuốc dừng) vào mỗi giếng, O.D đã được ghi lại ngay lập tức trong cùng vi đĩa đọc Elisa, đọc ở bướcsóng 450nm

1.4.2.Kỹ thuật PCR:

PCR là phương pháp dùng tổng hợp nhân tạo một đoạn DNA chọn lọc Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ: Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính khoảng 950C trong 30-60 giây

Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-700C, kéo dài 30-60 giây

Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 720C giúp cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất

Đầu dò oligonucleotide:

Mồi được lựa chọn trên cơ sở trình tự nucleotide được công bố của các gen nuc

966-bp có nguồn gốc từ chủng S aureus Foggi Hai mồi đã được lựa chọn sau khi kiểm

tra trình tự bổ sung là:

5'-GCGATTGATGGTGATACGGTI-3' (primer 1)

5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 '(primer 2)

Các mồi đã nằm trong 447-bp nuc gen A, mã hóa các nuclease A; mồi là 1 đoạn giữa nucleotide 48 và 70 Các mồi được sử dụng mà không cần tinh chế thêm Đối với nghiên cứu lai tạo, một đầu thăm dò 33-mer với chuỗi

5'-GGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-3 'đã được sử dụng; trình tự tương ứng với các nucleotide giữa các vị trí + 147 và 181 + của gen nuc A (23)

Chuẩn bị các vi khuẩn cho PCR:

Canh trường của vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch muối thanh trùng trước khi ly giải và khuếch đại bằng PCR Vi khuẩn được xoáy trộn và ly giải trong 100 µl của (20 mM Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, 0.50% [v/v] Tween 20, 0.45% [v/v] Nonidet P-40, 0.01% [w/v] gelatin, và 60 µg của proteinase K mỗi ml) ở 55 0C trong 1 giờ Các mẫu sau đó được gia nhiệt ở 95 ° C trong 5 phút

Khuếch đại PCR được thực hiện sau khi S.aureus (10 tế bào/ml) tiếp xúc với

cloxacillin (2.5 µg /ml), gentamicin (10 µg / ml), hoặc 0.5% (v / v) formaldehyde ở mức

22 ° C trong 120 phút hoặc sau khi tiếp xúc với bức xạ tia cực tím dưới một đơn vị photopolymerization trong 15 phút

Khuếch đại PCR:

Khuếch đại PCR được thực hiện trong một chu trình nhiệt, bằng cách sử dụng một Taq DNA polymerase tái tổ hợp Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl của lysate, 10 µl dung dịch PCR đệm khuếch đại (200 mM Tris-HCl [pH 8,3], 500 mM KCI, 15 mM MgCl2, 0,1% [wt / vol] gelatin, 0,5% Tween 20), 2.0 µl của các đoạn mồi, 10µl của triphosphate deoxynucleoside, 0.4 µl của AmpliTaq và 25.6 µl nước cất 2 lần Dầu khoáng (50 µl) được thêm vào hỗn hợp để ức chế sự bay hơi Có tổng cộng 37 Chu kỳ PCR được chạy theo các điều kiện sau đây: DNA biến tính ở 94 °C trong 1 phút, ủ mồi ở 55 °C trong 0.5 phút, và kéo dài DNA ở 72 °C trong 1.5 phút Sau chu kỳ cuối cùng, các phản ứng đã được chấm dứt bằng cách giữ nó ở 72 ° C trong 3,5 phút Sản phẩm PCR được lưu trữ tại

4 °C cho đến khi chúng được thu thập

Điện di trên gel Agarose:

Các mẫu PCR khuếch đại được phân tích bằng điện di agarose gel 1.3% (w/v) trong đệm điện di 1x TBE (pH 8,3; 0,09 M Tris, 0,09 M axit boric, 2.0 mM EDTA) và với 0.003% (w/v) ethidium bromide để nhuộm DNA Sản phẩm PCR không pha loãng

Sản phẩm PCR được tách ra trên gel agarose và chuyển qua một màng Blotting Zeta Probe (Bio-Rad) Các màng đã được cố định dưới ánh sáng tia cực tím trên máy soi

UV (5 phut), ủ trong 1 giờ ở 51°C trong 40 ml dung dịch lai (6x SSC [0.9 M NaCl, 0.09

M sodium citrate, pH=7.0], 0.5% [w/v] sodium dodecyl sulfate [SDS], và 10 x dung dịch Denhardt [0.25% Ficoll 400, 0.25% polyvinylpyrrolidone, 0.25% albumin huyết thanh bò]), và lai trong 3 giờ ở 52°C trong dung dịch lai với 10 pmol của 33-mer mẫu dò DNA Các mẫu dò DNA đã đánh dấu với [γ-32P] ATP bằng cách sử dụng T4 polynucleotide kinase Màng được rửa trong 0.1x SSC-0.1% SDS cho 2 giờ ở 45°C và tiếp xúc với Hyperfilm-MP (Amersham) cho 1 h ở -80 ° C để phát hiện lai

Chương 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

2.1.Đếm khuẩn lạc

2.1.1.Đồng nhất mẫu và pha loãng

Cân chính xác 10 ± 0.1 g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu 30 giây Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa

2.1.2.Phân lập trên môi trường chọn lọc

Cấy 0.1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1oC trong

24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu

Sau 24 giờ, khuẩn lạc S aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0.5

Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48

giờ Sau 48 giờ khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 – 1.5mm, có màu đen bóng,

lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc Khuẩn

lạc một số dòng S aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên Cần

đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc

Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm Hầu hết S aureus có vùng

tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này

2.1.3.Khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ

Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường Tryptic soy agar (TSA) vào các ống nghiệm chứa huyết tương, ủ ở 37 ± 1oC Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)) Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy

2.1.4.Kết quả

Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau :

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2)

Trong đó: F - là độ pha loãng