Báo cáo các phương pháp phân tích định lượng Chondroitin Sulfate từ ống hô hấp gà

Chondroitin một polymer mạch thẳng, cấu tạo từ các đơn vị cơ bản là disaccharide acid D-glucuronic (GlcA) và N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), các gốc đường này được sulfate hóa hay không bị sulfate hóa. Chiều dài của chuỗi thì khác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vị disaccharide. Disaccharides của Chondroitin sulfate có thể khác nhau về số lượng và vị trí sulfate hóa. Các vị trí sulfate hóa thông thường sẽ tạo thành các loại chondroitin sulfate: Chondroitin-4-sulfate (CS4): gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 của GalNAc, có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. Chondroitin-6-sulfate (CS6): gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 GalNAc. Chondroitin-2,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-2 của GlcA và C-6 GalNAc. Chondroitin-4,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 và C-6 GalNAc. Mỗi chuỗi Chondroitin sulfate có thể chứa nhiều disaccharide và sẽ có chiều dài khác nhau. Phần sulfate là một polysaccharide phức tạp, không đồng nhất với sự khác nhau về mật độ điện tích và khối lượng phân tử, dẫn đến ảnh hưởng đến đặc tính hóa học và tác dụng sinh dược học.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

MỤC LỤC

Chondroitin một polymer mạch thẳng, cấu tạo từ các đơn vị cơ bản là disaccharide acidD-glucuronic (GlcA) và N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), các gốc đường này được sulfatehóa hay không bị sulfate hóa Chiều dài của chuỗi thì khác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vịdisaccharide

Disaccharides của Chondroitin sulfate có thể khác nhau về số lượng và vị trí sulfate hóa.Các vị trí sulfate hóa thông thường sẽ tạo thành các loại chondroitin sulfate:

 Chondroitin-4-sulfate (CS4): gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 của GalNAc, có nhiều ở môsụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit

 Chondroitin-6-sulfate (CS6): gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 GalNAc

 Chondroitin-2,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-2 của GlcA và C-6 GalNAc

 Chondroitin-4,6-sulfate: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 và C-6 GalNAc

Mỗi chuỗi Chondroitin sulfate có thể chứa nhiều disaccharide và sẽ có chiều dài khácnhau Phần sulfate là một polysaccharide phức tạp, không đồng nhất với sự khác nhau về mật độđiện tích và khối lượng phân tử, dẫn đến ảnh hưởng đến đặc tính hóa học và tác dụng sinh dượchọc

Hình 1: Các dạng của Chondroitin sulfate (CS)

Chondroitin sulfate là một trong năm loại glycosaminoglycan (GAGs) bao gồm:Chondroitin sulfate, Heparan sulfate, Keratan sulfate, Dermatan sulfate và acid Hyaluronic (HA).GAGs là một polysaccharide mạch dài và thẳng, chứa chuỗi lặp đi lặp lại, mỗi đơn vị bao gồmmột hexosamin (N-acetylglucosamin hoặc N-acetylgalactosamin) và một acid uronic (acidglucuronic hoặc iduronic)

Hình 2: Các loại glycosaminoglycan (GAGs)

Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy Chondroitin sulfate thường gắn với proteinbằng liên kết o-lycosid tạo thành một proteoglycan (PG), là hợp chất hữu cơ thuộc nhómmucopolysaccharide Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhómcacboxyl (-COO-) của gốc acid làm cho phân tử Chondroitin sulfate mang điện tích âm nhiều

(amonic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hóa trị với các protein trong cấu tạo của PG.Chuỗi Chondroitin sulfate được gắn với nhóm –OH của gốc serine ở một số protein

Hình 3: Cấu trúc của proteoglycans

Proteoglycan (PG) gắn kết với acid Hyaluronic (HA) tạo thành một phức hệ thủy động cókhả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự nén ép biến dạng nhỏ nhất Dướiđiều kiện bình thường, nước sẽ bị hút vào sụn bởi những GAG tích điện âm và bị đính trongmạng lưới đó Khi có lực lên bề mặt sụn làm hơi bị biến dạng hay méo mó (ví dụ như lực đểchịu đựng một trọng lượng nặng) thì nước trong sụn sẽ có sự kháng cự lại giữa ái lực của nướcvới GAG và cản trợ vật lý tạo ra bởi khối aggrecan-hyaluronate

Hình 4: Cấu trúc của sụn

Chondroitin Sulfate ở ống hô hấp gà

1.2 Vai trò

Chondroitin sulfate có nhiều trong sụn khớp cũng như nhiều mô khác như: xương, dâychằng, đĩa đệm giữa các đốt sống, động mạch chủ, giác mạt (mắt) và da Chiều dài của chuỗi thìkhác nhau, khoảng 200 – 250 đơn vị disaccharide

Các vị trí sulfate hóa hiện chưa được nghiên cứu và hiểu rõ ràng nhưng mật độ xuất hiệncủa các vị trí sulfate hóa tùy vào tuổi và vị trí Sulfate hóa tại vị trí thứ 4 có nhiều tại các sụnnon, sâu hơn, chưa trưởng thành trong khi sulfate hóa tại vị trí thứ 6 được tìm thấy trong các sụntrưởng thành, già hơn, mỏng hơn Thêm vào đó, sự khác thường trong sự sulfate hóa thường xuấthiện trong những sụn bị viêm khớp

Chondroitin sulfate ở sụn khớp

- Các công trình nghiên cứu những năm gần đây cho thấy Chondroitin (sụn vi cá mập)

có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp, đó là do chondroitin tham gia vàocấu trúc màng tế bào, có trong thành phần các sợi chun ở các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệcao trong chất cơ bản ở mô sụn và xương nên bảo đảm cho sụn xương không những có

độ chắc mà còn có tính đàn hồi

- Chondroitin là nguyên liệu chủ yếu trong quá trình tái tạo mô sụn và xương Chất nàycũng có tác dụng ức chế enzym elastase (enzyme này là chất trung gian gây thoái hóa sụnkhớp); kích thích quá trình tổng hợp các proteoglycan (là một glycoprotein có tỷ lệ glucidrất cao) nên được chỉ định dùng bổ trợ trong các chứng hư và thoái hóa khớp Ở nhiềunước, chondroitin sulfat được xem là chế phẩm bổ sung dinh dưỡng; nó cũng được nhiềubác sĩ chuyên khoa phối hợp với glucosamin sulfat (một hợp chất thiên nhiên khác) dùngvào điều trị viêm xương khớp có tác dụng tốt

Chondroitin sulfate ở mắt

- Tại mắt, Chondroitin sulfate có tác dụng quan trọng trong cấu trúc trong suốt và đànhồi của giác mạc, duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của mắt Các nhà nghiên cứu

đã thấy Chondroitin sulfate có trong thành phần của phim nước mắt, góp phần bảo vệ tếbào biểu mô giác mạc

- Khi nhỏ vào mắt, Chondroitin Sulfate tạo nên một lớp nhầy giữ cho nước mắt lưu lạitrên bề mặt nhãn cầu lâu hơn, chống khô mắt Với phát hiện này, Chondroitin sulfateđược dùng như thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị tình trạng khô mắt Ngoài ra,Chondroitin sulfate còn được sử dụng để điều chế chất nhầy - một chất thường được dùngtrong phẫu thuật lấy thể thủy tinh và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô vànội mô của giác mạc

 Tác dụng chữa bệnh ung thư

Cá mập là loại cá duy nhất rất hiếm mắc bệnh ung thư Tần suất bị ung ở cá mập làmột phần triệu, trong khi các loài cá khác tần suất mắc bệnh là 2-3% Lý giải cho khảnăng kỳ diệu này chính là chất chondroitin sulfat có trong sụn vi cá mập Các khối ungthư phát triển rất nhanh, nên phải luôn luôn tạo ra các mạch máu mới nhằm đáp ứng nhucầu cao về máu và chất bổ dưỡng cho nó phát triển, tăng trưởng mạnh Để làm được việc

đó các khối ung thư luôn luôn sinh ra chất angiogenesis có tác dụng kích thích quá trìnhtạo sinh tân mạch Nếu hoạt chất angiogenesis bị ức chế, tân mạch sẽ không được tạo ra,khối u sẽ thiếu máu nuôi, các tế bào ung thư không sinh sản được, khối u sẽ ngừng tăngtrưởng, bệnh ung thư bị chặn lại Người ta thấy chính chất chondroitin trong sụn vi cámập đã ức chế được hoạt chất angiogenesis

Chondroitin sulfate ở tế bào

- Chondroitin sulfate tham gia cấu trúc tế bào và các bào quan, bảo đảm cho các tế bàothực hiện được các chức năng của nó và ngăn chặn sự thoái hoá tế bào

- Chondroitin sulfate ở mạch máu

- Chondroitin sulfate tham gia cấu trúc màng nền của mạch máu, góp phần đảm bảo tínhđàn hồi đặc biệt ở các mạch máu lớn có nhiều sợi chun thì Chondroitin sulfate càng cóvai trò quan trọng

- Chondroitin sulfate trong các mô, đặc biệt mô liên kết: gân - cơ - dây chằng,Chondroitin sulfate đảm bảo tính đàn hồi

Nguồn nguyên liệu chứa nhiều Chondroitin sulfate chủ yếu ở động vật như các loài giasúc, gia cầm: heo, bò, gà Chúng tập trung chủ yếu vào các mô sụn như: (keel) ức gà, chân gà, tai

heo, sụn khí quản bò, mũi heo, sụn chim… các nguồn khác như vi cá mập, sụn cá cũng chứachúng.

Hình 5: Nguyên liệu chứa Chondroitin

Sụn từ xương hàm cá sấu và sụn gà (keel) là những thực phẩm chứa nhiều chondroitinsulfate, 14.84 và 14.08% tính theo trọng lượng sụn khô (Bảng 1) Chondroitin sulfate keel gà sụnchiếm (16,8%) [báo cáo của Luo et al.] Hàm lượng chondroitin sulfate từ các sụn khác như: sụnxương ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sườn cá sấu5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (Bảng 1) Sự khác biệt về hàm lượng chondronitin sulfate do sựkhác nhau về loài, địa điểm sinh sống, các phương pháp phân tách và trích xuất khác nhau chotừng loại sụn

Bảng 1 Tỷ lệ và loại chondroitin sulfate (CS) từ các loài động vật khác nhau

Bảng 2 Tỷ lệ các loại chondroitin sulfate (CS) từ các loài động vật khác nhau

Theo phân tích thành phần chondroitin sunfate từ sụn của các nguồn điển hình trong tựnhiên Phân tử lượng của chondroitin sulfate từ động vật có sừng và heo: 14 - 26 kDa, nhưng từ

cá mập và cá đuối cao hơn (50 -70 kDa)

Ở động vật có sừng thì tỷ lệ chondroitin-4-sulfate: 61% và chondroitin-6-sulfate: 33%,trong khi ở gà thì chondroitin-4-sulfate: 72% và ở heo thì chondroitin-4-sulfate: 80% Cá đuối cóchodroitin-6-sulfate: 39%, chondroitin disulfate: 15% và cá mập có chondroitin-6-sulfate: 50%,chondroitin disulfate: 18%

Nhìn chung, có rất nhiều phương pháp chuẩn dùng để phân tích hàm lượng protein, hàmlượng carbohydrate, hàm lượng lipid, hàm lượng tro, độ ẩm… có thể kể đến như: AOAC, FAOFBN, TCVN, ISO…

Báo cáo này tham khảo phương pháp phân tích của Trung Tâm 3 (QUATEST 3), đốitượng phân tích vào nhóm: Thịt và sản phẩm thịt

Cát được sử dụng vì khả năng hút ẩm tốt của nó Thông thường, hàm lượng ẩm trong thịt

là khá cao, nếu chỉ sấy thông thường, ẩm sẽ không thoát ra triệt để Vì vậy, phương pháp nàydùng cát như là một loại nguyên liệu hỗ trợ quá trình sấy

Sạch, được rửa bằng axit, cỡ hạt lọt được qua sàng cỡ lỗ 1,4 mm và giữ lại trên sàng cỡ lỗ

250 µm

Trước khi sử dụng, sấy cát ở nhiệt độ 150 oC đến 160 oC và bảo quản trong lọ có nắp đậykín khí

Chú thích: Nếu không sẵn có cát sạch (được rửa bằng axit), thì cát có thể được làm sạch

như sau: Rửa cát dưới dòng nước chảy Đun sôi cát với axit clohydric loãng, ρ20 = 1,19 g/ml, đãđược pha loãng (1:1), trong 30 phút trong khi liên tục khuấy Lặp lại quá trình đun sôi với mộtphần khác của axit cho đến khi axit không có màu vàng sau khi sôi Rửa cát bằng nước cất chođến khi âm tính với phép thử clorua Sấy cát ở 150 °C đến 160 °C để bảo quản

 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Thiết bị đồng hóa bằng điện hoặc bằng cơ, có khả năng đồng hoá mẫu phòng thửnghiệm Thiết bị này gồm: máy cắt quay tốc độ cao, hoặc máy xay có gắn tấm đục lỗ,đường kính lỗ không quá 4,0 mm

- Đĩa đáy phẳng, bằng sứ hoặc kim loại (ví dụ, niken, nhôm, thép không gỉ), đườngkính ít nhất 60 mm và cao khoảng 25 mm

- Đũa thủy tinh mỏng, một đầu bằng, hơi dài hơn đường kính của đĩa (5.2)

- Tủ sấy, được làm nóng bằng điện, có khả năng hoạt động ở 103 °C ± 2 °C

- Bình hút ẩm, chứa chất hút ẩm hiệu quả, ví dụ silica gel

- Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g

 Lấy mẫu & chuẩn bị

Lấy ít nhất là 200 g mẫu đại điện Đồng hóa mẫu trong phòng thử nghiệm Chú ý để nhiệt

độ của mẫu nguyên liệu không tăng quá 25 °C Lưu trữ vào vật chứa kín và bảo quản để mẫukhông bị giảm chất lượng Phân tích mẫu thử trong vòng 24 h sau đồng hóa

 Cách tiến hành

Dùng đũa thủy tinh để trộn đều mẫu trong đĩa

Chuyển vào đĩa một lượng ~ 5-8 g, và sấy khô đĩa Sấy cùng với mẫu và đũa thủy tinh ~2

h trong tủ sấy ở 103 °C Lấy đĩa cùng với mẫu, đũa thủy tinh ra khỏi tủ sấy và đặt trong bình hútẩm

Để đĩa cùng với mẫu và đũa thủy tinh nguội đến nhiệt độ phòng, rồi cân chính xác đến

0,001 g (m o)

Lặp lại qui trình sấy, làm nguội và cân được qui định trong ở trên cho đến khi chênh lệch

giữa các kết quả của hai lần cân liên tiếp (m 2) trong thời gian sấy 1 h, không quá 0,1 % khốilượng phần mẫu thử

 Tính toán kết quả

Độ ẩm, w, tính bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau đây

Trong đó, m o là khối lượng của đĩa, đũa và cát , m 1 là khối lượng của đĩa cùng với phần

mẫu thử, đũa và cát trước khi sấy, m 2 là khối lượng của đĩa cùng với phần mẫu thử, đũa và cát,sau khi sấy Kết quả được làm tròn đến một chữ số thập phân

Phương pháp này còn được gọi là phương pháp Kjedahl Mặc dù được chọn là phươngpháp chuẩn để phân tích hàm lượng nito tổng (nito protein và nito phi protein) nhưng phươngpháp này cũng có những ưu và nhược điểm riêng Cụ thể:

Ưu điểm: Sử dụng được cho hầu hết mọi loại thực phẩm Là phương pháp chuẩn để so

sánh với các phương pháp khác Đồng thời, phương pháp này hiện đang được thế giới công nhận

và sử dụng rộng rãi So với nhiều phương pháp khác, Kjehdahl mang lại độ chính xác khá cao vàtính tận dụng lại nguyên liệu

- Tốn nhiều thời gian

- Sử dụng acid sunfuric mang lại nhiều mối nguy an toàn hóa chất

Ngày nay, song song với phương pháp Kjedahl, có thể kể đến 1 phương pháp khá tốt như

phương pháp Dumas Theo đó, chênh lệch giữa 02 phương pháp chỉ là 0.8 ~ 1.2% (thực

nghiệm) Nguyên tắc: Phương pháp đốt cháy Dumas để xác định protein thô Quy trình dùng mộtthiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích lên đến 600 oC trong một lò phản ứng được bịt kín với sựhiện diện của oxy Hàm lượng nitơ của khí đốt sau đó được đo bằng cách dùng máy dò dẫn nhiệt.Mỗi lần xác định chỉ cần khoảng 2 phút

Ngoài ra còn có thể kể đến các phương pháp ít được sử dụng hơn như: Lowry, phươngpháp quang phổ, phương pháp Coomassie Brilliant Blue G – 250

 Vật liệu: Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích

Nước được sử dụng phải là nước cất hoặc ít nhất là nước có độ tinh khiết tương đương.Đồng (II) sulfat ngậm năm phân tử nước (CuSO4.5H2O)

Kali sulfat (K2SO4), khan

Axit sulfuric, ρ20 = 1,84 g/ml

Dung dịch natri hydroxit, không chứa cacbonat, chứa khoảng 33 g natri hydroxit (NaOH)trong 100 g dung dịch

Hòa tan 500 g natri hydroxit trong 1 000 ml nước

Dung dịch axit boric

Hòa tan 40 g axit boric (H3BO3) trong nước và pha loãng bằng nước đến 1 000 ml.Axit clohydric, dung dịch chuẩn 0,1 N, đã biết nồng độ đương lượng đến bốn chữ số thậpphân

Dung dịch chỉ thị: Chỉ thị hỗn hợp (đỏ metyl-xanh metylen), được chuẩn bị bằng cáchhòa tan 2 g đỏ metyl và 1 g xanh metylen trong 1 000 ml etanol 95 % (thể tích)

Sự thay đổi màu của dung dịch chỉ thị này xuất hiện ở pH 5,4

Bảo quản dung dịch chỉ thị trong lọ màu nâu ở nơi tối và mát

Chất điều chỉnh sôi

- Dùng để phân hủy: Bi thủy tinh, silic cacbua hoặc mảnh sứ cứng

- Dùng để chưng cất: Silic cacbua hoặc các viên đá bọt vừa mới được nung

- Giấy không thấm mỡ, có kích thước khoảng 9 cm x 6 cm

- Buret, 50 ml phù hợp với loại A của TCVN 7149 : 2007 (ISO 385 : 2005)

- Bình Kjeldahl, dung tích không lớn hơn 800 ml, có bầu thủy tinh hình quả lê đậykính, nếu cần.

- Thiết bị chưng cất bằng hơi, hoặc thiết bị chưng cất thông thường

- Thiết bị gia nhiệt, để làm nóng bình Kjeldahl ở tư thế nghiêng sao cho nguồn nhiệtchỉ tiếp xúc với thành bình thấp hơn mức chất lỏng Khi sử dụng khí để đốt, thì nêndùng tấm amiăng thích hợp có lỗ tròn sao cho chỉ phần dưới của bình tiếp xúc vớingọn lửa

- Buồng hút khói hiệu quả, dùng để hút khói axit thoát ra trong quá trình phân hủy

- Cân phân tích

 Lấy mẫu & chuẩn bị

Lấy ít nhất là 200 g mẫu đại diện

Dùng máy xay thịt xay mẫu ít nhất hai lần và trộn đều để thu được mẫu đồng nhất Bảoquản mẫu đã đồng nhất trong vật chứa kín khí, đậy nắp vật chứa và bảo quản sao cho không làmgiảm chất lượng và thay đổi thành phần của mẫu Nếu sử dụng chất bảo quản thì các chất nàykhông được chứa các hợp chất nitơ với lượng có thể đo được

Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, chỉ trong vòng 24 h sau khi đồng hóa

Chuyển giấy không thấm mỡ và phần mẫu thử vào bình Kjeldahl

Thêm 25 ml axit sulfuric vào bình Kjeldahl Trộn nhẹ bằng cách xoay bình chứa chấtlỏng Có thể chèn bầu thủy tinh hình quả lê vào cổ bình bằng cách cho đầu nhọn xuống dưới, nếucần

Đặt bình ở tư thế nghiêng (nghiêng khoảng 400 so với chiều thẳng đứng) lên thiết bị gianhiệt Đầu tiên, đun nhẹ bình cho đến khi ngừng sủi bọt và mẫu hoàn toàn hóa lỏng Sau đó phânhủy bằng cách cho sôi mạnh, thỉnh thoảng xoay bình, cho đến khi dịch lỏng trở nên trong suốt và

có màu xanh lam nhạt Giữ dung dịch lỏng sôi thêm 90 phút

Tổng thời gian phân hủy không ít hơn 2 h Tiến hành cẩn thận không để chất lỏng ngưng

tụ chảy tràn ra ngoài bình Tránh làm thất thoát quá nhiều axit sulfuric do bị quá nhiệt trong quátrình phân hủy, điều này có thể dẫn đến hao hụt nitơ

Để nguội đến khoảng 40 °C và cẩn thận thêm khoảng 50 ml nước Trộn đều và để nguội.Dùng ống đong rót 50 ml dung dịch axit boric vào bình nón dung tích 500 ml, thêm 4giọt dung dịch chỉ thị, trộn đều và đặt bình dưới bình ngưng của thiết bị chưng cất sao cho đầu racủa ống nối nhúng trong chất lỏng

Xử lý lượng chứa trong bình Kjeldahl bằng một trong những cách sau đây:

a) Trong trường hợp chưng cất bằng hơi

Chuyển lượng chứa trong bình Kjeldahl sang thiết bị chưng cất và tráng bình bằngkhoảng 50 ml nước Dùng ống đong cho thêm 100 ml dung dịch natri hydroxit, rót cẩn thận dọctheo độ nghiêng cổ bình sao cho hai lớp trong bình không bị khuấy trộn Gắn ngay bình cầu vàođầu phun của thiết bị chưng cất Đun nóng dung dịch kiềm bằng cách cho hơi đi qua cho đến sôi

và giữ sôi trong 20 phút Đầu tiên đun nóng nhẹ để giảm thiểu sự sủi bọt Thể tích thu được củadịch cất phải ít nhất là 150 ml

b) Trong trường hợp chưng cất bình thường

Cẩn thận pha loãng lượng chứa trong bình Kjeldahl bằng khoảng 300 ml nước vàxoay bình Chuyển vào bình 1 lit, nếu cần Sau khoảng 15 phút, dùng ống đong cho thêm 100 mldung dịch natri hydroxit, rót cẩn thận dọc theo độ nghiêng cổ bình sao cho hai lớp trong bìnhkhông bị khuấy trộn Gắn ngay bình vào đầu phun của thiết bị chưng cất

Chưng cất ít nhất 150 ml dịch lỏng, ngay cả khi hỗn hợp sôi không đều Tiếp tụcchưng cất cho đến khi hỗn hợp bắt đầu sôi hoặc cho đến khi thu được 250 ml dịch cất Đảm bảorằng dịch cất thực sự nguội và tránh để cho dung dịch axit boric ấm lên

Trong cả hai trường hợp, hạ thấp bình nón ngay trước khi kết thúc chưng cất, sao chođầu ra của ống nối cao hơn mức dịch lỏng Tráng đầu ra của ống nối trên dịch lỏng (phía trong

và phía ngoài) bằng một ít nước Kiểm tra việc kết thúc chưng cất amoniac bằng giấy quỳ đỏ, đãđược làm ẩm bằng nước cất; màu không được ảnh hưởng bởi dịch lỏng chảy nhỏ giọt từ bìnhngưng Ngừng gia nhiệt Nếu cho thấy chưa hoàn thành quá trình chưng cất, thì tiến hành phépxác định mới, tuân thủ các hướng dẫn

Chuẩn độ lượng chứa trong bình nón bằng dung dịch axit clohydric Ghi lại thể tíchcủa dung dịch axit clohydric đã dùng, tính chính xác đến 0,02 ml

Tiến hành hai lần xác định trên các phần mẫu thử lấy từ cùng một mẫu thử

 Tính toán kết quả

Hàm lượng nitơ của mẫu, biểu thị theo phần trăm khối lượng, tính bằng công thức:

Trong đó, V0 là thể tích của dung dịch axit clohydric 0,1 N dùng cho phép thử trắng, tínhbằng mililit (ml); V1 là thể tích của dung dịch axit clohydric 0,1 N dùng cho phép xác định, tínhbằng mililit (ml): m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g)

Kết quả là trung bình các kết quả của hai lần xác định,

Báo cáo kết quả chính xác đến 0,01 g nitơ trên 100 g mẫu

Cuối cùng, hàm lượng protein = hàm lượng nito tổng số * 6.25

 Viện dẫn: TCVN 8316:2009 (tương đương ISO 1443:1973)

 Nguyên tắc

Dùng n-hexan hoặc dầu nhẹ chiết phần đã khô thu được theo phương pháp xác định độ

ẩm được quy định trong TCVN 8135 : 2009 (ISO 1442 : 1997) Loại bỏ dung môi bằng cách chobay hơi sau đó sấy khô và cân chất chiết

 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt tinh khiết phân tích Nước phải là nước cắt hoặc ít nhất lànước có độ tinh khiết tương đương

- Dung môi chiết: n-hexan hoặc dầu nhẹ được chưng cất ở nhiệt độ 40 °C đến 60 °C và

có chỉ số bromua nhỏ hơn 1 Đối với dung môi, sau khi cho bay hơi hoàn toàn không

để lại lượng cặn quá 0,002 g/100 ml

- Axit clohydric, dung dịch khoảng 4 N Pha loãng 100 ml axit clohydric đậm đặc (ρ20

- Mặt kính đồng hồ hoặc đĩa petri, đường kính không nhỏ hơn 80 mm

- Túi chiết, bằng giấy lọc và đã khử chất béo

- Bông vải, đã khử chất béo

- Thiết bị chiết, liên tục hoặc bán liên tục, ví dụ thiết bị Soxhlet, có bình chiết dung tíchkhoảng 150 ml

- Bể cát hoặc nồi cách thủy, làm nóng bằng điện hoặc thiết bị thích hợp tương tự

- Tủ sấy, làm nóng bằng điện, có thể kiểm soát được nhiệt độ 103 °C ± 2 °C

- Bình hút ẩm, chứa chất hút ẩm hiệu quả

- Cân phân tích

- Giấy lọc gấp nếp, loại định lượng, tốc độ lọc trung bình

 Lấy mẫu & chuẩn bị

Lấy ít nhất 200 g mẫu đại diện

Đồng hóa mẫu bằng cách xay mẫu ít nhất hai lần bằng máy xay thịt và trộn Giữ đầy mẫutrong vật chứa kín khí và bảo quản sao cho mẫu không bị giảm chất lượng và không bị thay đổithành phần Phân tích mẫu càng sớm càng tốt, chỉ trong vòng 24 h

 Cách tiến hành

Cân từ 3 g đến 5 g mẫu đã xay, tùy thuộc vào hàm lượng chất béo dự kiến, chính xác đến0,001 g cho vào bình nón 250 ml

Làm khô bình của thiết bị chiết, chứa một vài hạt trợ sôi trong 1 h ở 103 °C ± 2 °C trong

tủ sấy Để bình nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,001 g

Thêm 50 ml axit clohydric vào phần mẫu thử và đậy nắp bình nón bằng mặt kính đồngnhỏ Đun nóng bình nón trên lưới amiăng của bếp ga cho đến khi mẫu bắt đầu đến sôi Tiếp tụcđun sôi trên ngọn lửa nhỏ trong 1 h và lắc liên tục Thêm 150 ml nước nóng

Làm ẩm giấy lọc gấp nếp đựng trong phễu thủy tinh bằng nước và rót mẫu còn nóngtrong bình sang giấy lọc Rửa bình và mặt kính đồng hồ kỹ ba lần bằng nước nóng và làm khôtrong tủ sấy Rửa giấy lọc bằng nước nóng cho đến khi nước rửa không làm chuyển màu giấyquỳ xanh Đặt giấy lọc lên mặt kính đồng hồ hoặc đĩa petri và sấy khô 1 h trong tủ sấy ở 103 °C

± 2 °C Để nguội

Cuộn giấy lọc và đặt vào trong túi chiết Dùng bông vải đã được làm ẩm bằng dung môichiết để lau sạch chất béo trên mặt kính đồng hồ hoặc đĩa petri và chuyển bông vải vào túi chiết.Lắp túi chiết vào thiết bị chiết Dùng kẹp để lấy giấy lọc ra hoặc dùng tay thì phải lót giấy Rótdung môi chiết vào bình đã sấy của thiết bị chiết Rửa mặt trong của bình nón được sử dụng đểphân hủy bằng axit clohydric, mặt kính đồng hồ được rửa bằng một phần dung môi và chiết chovào bình chiết Lượng dung môi tổng số phải gấp rưỡi hoặc gắp đôi dung tích của túi chiết Lắpbình vào thiết bị chiết Đun nóng bình chiết 4 h trên bể cát, nồi cách thủy hoặc thiết bị khác

Sau khi chiết, lấy bình chứa dịch lỏng ra khỏi thiết bị chiết và chưng cất hết dung môi, ví

dụ trên bể cát hoặc trong nồi cách thủy Cho bay hơi hết các vết dung môi trên nồi cách thuỷ,dùng khí thổi, nếu cần

Sấy bình chiết 1 h trong tủ sấy ở 103 °C ± 2 °C, sau khi để nguội đến nhiệt độ phòngtrong bình hút ẩm, cân chính xác đến 0,001 g Lặp lại qui trình này cho đến khi kết quả của hailần cân liên tiếp không chênh lệch quá 0,1 % khối lượng phần mẫu thử

Kiểm tra xác nhận quá trình chiết đã hoàn thành hay chưa bằng cách chiết lần thứ hai vàchiết thêm 1 h với phần dung môi mới Chênh lệch khối lượng không được quá 0,1 % phần mẫuthử

Tiến hành hai lần xác định trên cùng mẫu đã chuẩn bị

 Tính toán kết quả

Hàm lượng chất béo tổng số của mẫu, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng, tính theocông thức:

Trong đó mo là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); m1 là khối lượng bình chiết

có các hạt trợ sôi, tính bằng gam (g); m2 là khối lượng bình và các hạt trợ sôi với chất béo sau

khi sấy, tính bằng gam (g); Lấy kết quả là trung bình của hai lần xác định Kết quả được làm trònđến một chữ số thập phân

 Viện dẫn: TCVN 4295 – 86

 Nguyên tắc: Đây là phương pháp trực tiếp Được tiến hành theo nguyên tắc sau:

Ở môi trường kiềm mạnh các đường khử (glucose, fructose, mantose…) có thể dễ dàngkhử oxi của Cu(OH)2 tạo kết tủa dạng Cu2O màu đỏ gạch Hòa tan kết tủa Cu2O bằng Fe 3+ đẩy ramột lượng Fe 2+ Chuẩn lượng Fe 2+ sinh ra bằng KMnO4 , từ đó tính hàm lượng đường khử

Cụ thể:

CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4

Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + H2O + 2FeSO4

10FeSO4 + 8H2SO4 + 2KMnO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 +8H2O

Ngày nay, tại một số trung tâm phân tích ở Việt Nam, còn có thể xác định hàm lượngGluxit theo phương pháp gián tiếp Hàm lượng này được tính bằng 100% - (% protein + % Lipid+ % ẩm + % tro) Phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng tro cũng được mô tả trong báo cáonày

 Dụng cụ thiết bị và hóa chất:

Cân phân tích có độ chính xác 0,0002 g;

Máy chưng cách thủy;

Máy hút chân không hoặc bộ hút chân không bằng vòi nước

Bình định mức dung tích 200 hoặc 250 ml;

Bình cầu dung tích 200 hoặc 250 ml;

Ống sinh hàn dài 30 – 40 cm;

Phễu xốp số 4;

Axit clohydric (HCl), d = 1,19

Natrihydroxyt (NaOH), dung dịch 20%;

Chì axêtat dung dịch 30%;

Natri sunfat (Na2SO4) dung dịch bão hòa

Dung dịch pheling A: 40 g sunfat đồng ngậm 5 phân tử nước hòa trong 1 lit nước cất(CuSO4.5H2O);

Dung dịch pheling B: 200 g kali natri tatrat, 15g natri hydroxyt tinh thể hóa trong 1 lítnước cất;

Dung dịch sắt sunfat: 50 g sắt sunfat ngậm 9 phân tử nước (Fe2(SO4).9H2O);

200g axit sulfuric đậm đặc (96 – 98%), tất cả hòa trong nước cất để đủ một lít dung dịchKali pemanganat (KMnO4) dung dịch 0,1 N

Chuyển toàn bộ lượng mẫu đã được thủy phân sang bình định mức dung tích 250ml.Thêm vào bình định mức từ 5 đến 10 ml dung dịch chì axêtat sao cho đủ khả năng kết tủa hoàntoàn dung dịch mẫu đã được thủy phân Lắc thật đều và để yên cho dung dịch lắng trong hoàntoàn

Cho dung dịch bão hòa natri sunfat vào bình để khử lượng chì axêtat dư (kiểm tra bằngcách cho chảy theo thành bình 1 giọt natri sunfat bão hòa mà không làm đục lớp trên của dungdịch mẫu là được) Thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều và để lắng trong

Lọc dung dịch mẫu sang một bình tam giác khô sạch, đậy kín để tiến hành phân tích.Dùng pipet hút 20 ml dung dịch mẫu cho vào bình tam giác khô sạch cho thêm vào bình20ml dung dịch pheling A và 20 ml dung dịch pheling B, lắc đều và đun trên bếp điện Đun sôidung dịch 3 phút, nếu thấy dung dịch mất màu xanh đồng sunfat thì làm lại với lượng dung dịchmẫu nhỏ hơn sao cho dư thừa dung dịch pheling A và B để kết tủa oxyt đồng hóa trị 1

Để nghiêng bình cho kết tủa lắng hoàn toàn, gạn nhẹ nhàng lọc kết tủa qua phễu xốp số 4sao cho kết tủa oxyt đồng theo lên phễu càng ít càng tốt Rửa kết tủa còn lại trong bình và trên

phễu bằng nước cất đun sôi cho hết kiềm Hòa tan kết tủa oxyt đồng hóa trị 1 trong bình và trênphễu bằng dung dịch sắt sunfat.

Chuẩn độ dung dịch bằng kali pemanganat 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền sau 30giây

Kết quả thử là trung bình cộng hai lần xác định đồng thời và tính tới số lẻ thứ nhất Sailệch giá trị giữa hai lần xác định đồng thời không được vượt quá 0,5%

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thử nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

- Thiết bị đồng hóa mẫu, sử dụng điện hoặc cơ, có khả năng đồng hóa mẫu phòng thửnghiệm

- Thiết bị này gồm máy cắt quay tốc độ cao, hoặc máy xay gắn một tấm đục lỗ với các

lỗ có đường kính không quá 4,0 mm

- Đĩa, đáy phẳng, được làm bằng sứ, thạch anh hoặc kim loại (thí dụ niken, platin, thépkhông gỉ) hoặc các vật liệu khác không ảnh hưởng đến các điều kiện tiến hành phépthử Đường kính của đĩa tối thiểu là 60 mm, và chiều cao của đĩa tối thiểu là 25 mm