Đang tải... (xem toàn văn)
Phương pháp SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein được gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác nhân làm biết tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2- mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S – S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, dưới tác động của điện trường sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel): Thông thường lớp gel này có nồng độ gel thấp vào khoảng 4 – 5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trường các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel gom, và nằm phía dưới. Có tác dụng chính trong việc tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Kĩ thuật SDS- PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 – 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%.
I HC BCH KHOA TP H CH MINH KHOA K THUT HO HC B MễN CễNG NGH THC PHM MễN HC: MT S PHNG PHP PHN TCH HO Lí TRONG NGHIấN CU THC PHM TI: THU NHN CC NHểM PROTEIN T RONG BN NC L Enteromorpha sp V XC NH CC TNH CHT CHC NNG CA CHNG GVHD: TS Phan Ngc Ho LP: HVTH: Cao hc 2015.1 TP H Chớ Minh, thỏng 03 nm 2016 MC LC DANH MC HèNH DANH MC BNG Chng 1.Tng quan Rong (Algae) Rong (to) l ngun sinh cht vụ tn i vi ngi qua chui thc phm, l thc n trc tip ca nhiu vựng trờn th gii Hu ht cỏc loi rong cú mụi trng sng l nc v 70% b mt trỏi t l lónh a ca rong to nờn õy cú th xem l ngun ti nguyờn vụ tn Vi s phỏt trin ca khoa hc, kin thc khoa hc v rong ngy cng m rng Cỏc ng dng ca rong ngy mt ph bin hn cỏc lnh vc trng trt, chn nuụi, y dc Cỏc sn phm thu nhn t rong nh agar, alginate, -carotene, cỏc acid bộo khụng bóo hũa u cú giỏ tr kinh t cao Rong cng ó gúp phn khụng nh vo vic gii quyt nn protein cỏc nc chm phỏt trin nh hm lng protein khỏ cao ca chỳng Vic phõn loi rong l khỏ khú khan, nhiờn theo quan im hin i, rong to thuc phõn gii thc vt bc thp bao gm cú cỏc ngnh nh sau: - Ngnh Chrysophyta- Kim to - Ngnh Xanthophyta- Hong to - Ngnh Pyrrophyta- Giỏp to - Ngnh Bacillariophyta- Khuờ to - Ngnh Rhodophyta- To - Ngnh Phaeophyta- To nõu - Ngnh Euglenophyta- To mt - Ngnh Chlorophyta- To lc Rong lc Chlorophyta l mt ngnh ln nht v a dng nht hin nay, cú th lờn n 20.000 loi Mụi trng sng ca rong lc ch yu l nc ngt Trong mụi trng nc mn thng cú cỏc ging Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia, Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium c im khỏc bit ch yu ca rong lc l chỳng cú mu xanh lc v cht d tr l tinh bt Theo Phm Hong H (1972),ngnh To lc c chia lm lp: - Lp Rong lc (Chlorophyceae) - Lp Rong tip hp (Zygophyceae) - Lp Rong vũng (Charophyceae) Enteromorpha l mt ging rong thuc lp Rong lc Chlorophyceae v cú v trớ phõn loi nh sau: - Lp ph Septophycidae - B Ulothricales - H Ulvacea Rong Enteromorphacú dng hỡnh ng, c, rng hoc hỡnh tỳi Nhỡn t b mt t bo, thnh hỡnh ch nht hay hỡnh vuụng, sp xp thnh hng dc hay khụng cú qui lut, t bo cú mt nhõn, mt lp hỡnh bn mang mt hoc nhiu hch lp Sinh sn vụ tớnh bng ng bo t hocsinh sn hu tớnh theo li ng giao hay d giao Loi thng gp l Enteromorpha intestinalis ng dng ca rong ngnh thc phm 2.1 Cỏc ng dng truyn thng Rong, c bit cỏc to ln t lõu ó l thc phm truyn thng ca nhiu dõn tc chõu nh Nht Bn, Hn Quc, Trung Quc ó cú khong 100 nhúm rong bin c nuụi trng cung cp cho th trng t thp k 1950 Khong 88% rong c s dng nh rau ci, 11% dựng sn xut keo nhagar, carrageenan, alginate, cũn li 1% dựng lm cht b sung Cỏc hydrocolloid (agar, alginate, carrageenan) ca rong t lõu lõu ó c chit xut thng mi lm cht n nh, cht to c cho thc phm Cỏc hp cht chng oxi húa giỳp rong c dựng kộo di thi gian bo qun ca thc phm.Carbohydrate chit t rong c dựng lm vt liu to cỏc loi bao bỡ cú th n c 2.2 ng dng hin i v xu hng Cỏc ng dng hin i ngy cng c m rng nh vo thnh tu ca ngnh cụng ngh di truyn Ngoi ra, ngy ngi ta thng quan tõm ti ngun cung cp cỏc thnh phn cú hot tớnh sinh hc cú rong s dng thc phm chc nng, mt xu hng s dng thc phm hin i.Xu hng hin i ang hng ti cỏc cht trao i th cp cú giỏ tr thng mi rt cao t to vỡ chỳng to hiu qu cao nng rt thp ng dng cho ngnh thc phm Rong l ngun thc phm nng lng thp ớt cht bộo, nhiờn cht bộo rong li cú giỏ tr cao vỡ giu cỏc PUFA (cỏc acid bộo khụng bóo hũa nhiu ni ụi), giỏ tr cú th cao hn c du cỏ, cú th cú tỏc dng cha gan nhim m nu c s dng thng xuyờn Cỏc loi rong nh Enteromorpha sp., U pinnatifida, H elongate, P Umblicalis, S thubergii ó c da vo nhiu loi thc phm nh snack, pasta, bỏnh nng, bỏnh bao patty, xỳc xớch frankfurter ớt bộo, sn phm tht, patty hamburger Cỏc loi rong ln (macroalgae) thng sng iu kin mụi trng khỏc nghit u tranh sinh tn ó lm chỳng cú nhng ng chuyn húa c bit nờn chỳng cú nhiu cỏc protein, c bit l cỏc peptide cú 3-16 acid amin cú chc nng sinh hc nh kh nng chng oxi húa, chng tng huyt ỏp, cú tỏc dng lờn h dch Lectin t mt s loi rong lc nh Ulva pertusa, Bryopsis plumose, Codium barbatum c a vo cỏc sn phm h tr iu tr ung th, tng sc khỏng, khỏng viờm, thm khỏng virus Phytochelatin l mt oligopeptide giu sulfur cú th giỳp gii c kim loi cho t bo, peptide ny thng dng phc vi kim loi v cú th thy rong nõu, rong , c bit l rong lc Trong rong cú s hin din ca rt nhiu acid amin c bit ngoi 20 loi acid amin t nhiờn tham gia cu to nờn protein Rt nhiu s cỏc acid amin ny th hin hot tớnh sinh hc v c ng dng vo thc phm chc nng nh kainoid Kanoid cú cu trỳc tng t cysteine cú rong nõu, dựng lm thc phm chc nng h tr iu tr cỏc bnh ri lon thn kinh nh Alzheimer, ng kinh, Parkinson Cũn rt nhiu cỏc hp cht cú cu to protein t rong ang c nghiờn cu v a vo ng dng thc t Lý chn ti Ngnh nuụi tụm hin ó phỏt trin rng rói vựng ng bng sụng Cu Long v nhiu tnh trờn c nc iu ny ó to nờn cỏc vựng nc mn nhõn to bờn vựng chõu th v t ú lm gia tng sinh ca cỏc qun th rong nc l Do s giao thoa gia hai vựng nc nờn rong sng khu vc ny cú nhng c im khỏc bit vi cỏc loi rong sng hai vựng nc riờng bit Cỏc loi rong nc l phn ln di chuyn t bin vo v thớch nghi dn vi mn thp hn ca vựng nc ny Rong bỳn Enteromorphaintetinalis l mt s cỏc loi rong nc l c tỡm thy cỏc m nuụi tụm qung canh Cỏc nghiờn cu hng ti s dng ngun nguyờn liu ny l thc s cn thit bi vỡ: - õy l ngun nguyờn liu r tin d tỡm v cha c s dng ỳng mc - Rong bỳn cú thnh phn dinh dng cao, c bit l protein vỡ cú cha cỏc acid amin thit yu, mt c im m protein thc vt khụng cú c iu ny hn vic to nhiu sn phm mi, cú giỏ tr cao t ngun protein phi ng vt - Cỏc tớnh cht chc nng cú c t protein ca rong bỳn nh kh nng to bt, to nh cho thc phm cú th c ng dng vic to nhiu loi ph gia thc phm va cú hiu qu cao va an ton cho ngi s dng vi mt giỏ thnh phự hp so vi cỏc loi ph gia nhp khu tn dng ngun nguyờn liu di r tinv sn cú nc - Nhng sn phm s i t nghiờn cu vic s dng rong bỳn v protein rong bỳn s giỳp ci thin ỏng k thu nhp ca ngi nụng dõn vỡ tn dng hiu qu ngun li cú sn m nuụi tụm - Cỏc hiu qu v mt kinh t s kớch thớch ngi dõn quan tõm nhiu hn ti ngun li t cỏc loi rong ny v m rng vic nuụi trng, phỏt trin cỏc loi rong lc cú tỏc ng tớch cc vi mụi trng õy thc s l mt hot ng hiu qu vic ng phú vi bin i khớ hu ang nh hng sõu sc ti mt t nc cú ng b bin di nh Vit Nam Protein hin c thu nhn t nhiu ngun khỏc v khụng ch n gin l lm thc phm nh trc õy Ngun protein t rong bỳn hn vic to nhiu sn phm cú giỏ tr sinh hc cú cha cỏc loi peptide cú hot tớnh sinh hc nh cỏc peptide cú kh nng kim soỏt huyt ỏp, gim cholesterol mỏu v cú kh nng chng oxi húa Tớnh mi ca ti i tng nghiờn cu l rong Bỳn nc l Enteromorpha intestinalis thu nhn ti cỏc tnh cú din tớch nuụi tụm nc l ca vựng ng Bng Sụng Cu Long Vựng sinh thỏi nc l nuụi tụm ny ch mi c hỡnh thnh khong hn 15 nm ti mt s tnh ng Bng Sụng Cu Long nờn i tng nghiờn cu cha c quan tõm nhiu Mc dự ó cú nghiờn cu thu nhn protein t rong mn nc l Chaetomorpha sp nhngrong Bỳn nc l Enteromorpha intestinalis cú c im hỡnh thỏi, cu to t bo, v trớ tng nc sinh sng v v rt khỏc rong mn nờn kt qu thu nhn protein, c bit l vic s dng protein ny s cú nhng giỏ tr rt mi - ti nghiờn cu s c thc hin c lnh vc nghiờn cu c bn ln nghiờn cu ng dng Tỡm hiu thnh phn sinh húa, thu nhn tng phõn on protein v xỏc nh cỏc tớnh cht dinh dng, tớnh cht chc nng ca tng phõn on ny s giỳp cú c nhng thụng tin cn thit v mt loi protein thu nhn t ngun nguyờn liu rt mi l Enteromorpha intestinalis Kt hp gia vic s dng cỏc k thut hin v nhng phng phỏp thu nhn protein truyn thng, ti s tin hnh nghiờn cu cỏc giai on cn thit cú s cú mt qui trỡnh hiu qu cao, cú th a vo s dng thc t Cỏc k thut, phng phỏp phõn tớch hin i s c ỏp dng trit cú th ỏnh giỏ tng tn cỏc tớnh cht ca ch phm protein thu c nhm tỡm cỏc kh nng ng dng mi ca protein thu c ngnh thc phm - Mc tiờu chớnh ca ti l tỡm kim gii phỏp cụng ngh mi cho vic chuyn húa ngun sinh rong nc l mc t nhiờn gõy ụ nhim mụi trng thnh nhng sn phm cú giỏ tr gia tng ng dng cụng nghip thc phm Mc tiờu nghiờn cu Xỏc nh cỏc giỏ tr dinh dng v tớnh cht chc nng ca cỏc phõn on protein thu c t ngun nguyờn liu di vựng ng Bng Sụng C Long a c mt qui trỡnh thu nhn protein hon chnh, hiu qu nhng kinh t, cú th ng dng vo thc t sn xut Xỏc nh c ht cỏc tớnh cht v tớnh cht chc nng m protein sn phm cú c t ú xut cỏc ng dng c lnh vc thc phm Chng 2.Cỏc phng phỏp phõn tớch s dng ti Cỏc phng phỏp xỏc nh thnh phn sinh hoỏ ca rong 1.1 nh lng Nit tng bng phng phỏp KJELDAHL 1.1.1 nh ngha Tt c cỏc dng nit cú c th hay cỏc mụ c gi l nit tng s Nit cú cỏc thnh phn amino acid ca protein l nit protein Nit khụng cú thnh phn protein nh ca cỏc mui NH4+, cỏc amino acid t do, cỏc peptide, urea v cỏc dn xut ca urea, cỏc alkaloid, cỏc base purin v pyrimidine, l nit phi protein Nit tng s = Nit protein + Nit phi protein m tng s hay protein tng s l nit tng s nhõn vi h s chuyn i H s ny ph thuc vo hm lng nito protein Thụng thng nito chim 16% protein nờn h s chuyn i thng s dng l 100/16 = 6.25 m tng s = Nit tng s x H s chuyn i Bng H s chuyn i c th cho cỏc i tng mu khỏc MU Ngun gc ng vt H S CHUYN I 6.25 Ht bụng u phng u nnh Ht hng dng Cm da Ht mố Bp Go Lỳa mỡ 5.30 5.46 5.71 5.3 5.3 5.3 6.25 5.95 5.83 1.1.2 Nguyờn tc a Vụ c húa mu: Trc tiờn mu c vụ c húa bng H2SO4 c nhit cao v cú cht xỳc tỏc Cỏc phn ng ca quỏ trỡnh vụ c húa xy nh sau: 2H2SO4 2H20 + 2SO2 + O2 Oxi to thnh phn ng li oxi húa cỏc nguyờn t khỏc Cỏc phõn t cha nito di tỏc dng ca H2SO4 to thnh NH3 Vớ d cỏc protein b thy phõn thnh amini acid, cacbon v hidro ca acid amine to thnh CO2 v H2O, cũn nito c gii phúng di dng NH3 kt hp vi H2SO4 d to thnh (NH4)2SO4 tan dung dch 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 Cỏc nguyờn t P, K, Ca, Mg,chuyn thnh dng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO, b Chng ct m: ui NH dung dch bng NaOH (NH ) SO + 2NaOH Na SO + 42 4 H O + 2NH NH bay c lm lnh bin i thnh NH OH ri vo bỡnh hng, bỡnh hng cha H SO 0.1N: 2NH OH + H SO (NH ) SO + 2H O + H SO (d) 4 42 2 c Chun H2SO4 d: Chun H SO d bng NaOH 0.1N: H SO + NaOH Na SO + H O (d) d Tớnh kt qu: Hm lng % nito tng s c tớnh theo cụng thc: N(%) = {1.42/1000*(V1 V2)*100/m}*n Trong ú: + V1: s ml H2SO4 cho vo bỡnh + V2: s ml NaOH 0.1N ó chun + m: s gam mu hay ml mu sau chun li + n: h s pha loóng mu vụ c húa mu a vo chng ct 1.1.3 Nhng yu t cú th nh hng n kt qu phõn tớch Nng HCl 0,25N khụng m bo chớnh xỏc Ly mu khụng i din Cõn mu khụng chớnh xỏc Ngun nc b nhim N 1.1.4 Kh nng ng dng ca phng phỏp Kjeldahl Phng phỏp ny cú kh nng ng dng cho hu ht cỏc loi mu: + Mu thc phm: thu hi sn, nc mm, cỏc loi u, thc n nuụi tụm cỏ, rau qu + t, nc thi + Bó men bia, bỏnh du u nnh, bỏnh du cao su 1.1.5 Nguyờn tc hot ng ca mỏy Kjeldahl Mu c a vo bn t (h thng vụ c hoỏ mu) thụng qua cỏc ng Kjeldahl Sau vụ c hoỏ mu xong, ton b mu + ng Kjeldahl c a qua h thng chng ct NH3 v ton b sn phm c a qua thit b chun 1.2 nh lng protein bng phng phỏp BRADFORD 1.2.1 nh ngha Protein c nh lng bng phng phỏp Bradford l protein tan dung dch Vỡ vy, mun xỏc nh hm lng protein mt mu ta phi trớch ly protein Hm lng protein xỏc nh s ph thuc vo hiu qu trớch ly (kh nng hũa tan ca protein dung mụi trớch ly) 1.2.2 Nguyờn tc Phng phỏp ny da trờn s thay i bc súng hp thu cc i ca thuc nhum Coomassie Brilliant Blue to phc hp vi protein Trong dung dch mang tớnh acid, cha kt ni vi protein thỡ thuc nhum cú bc súng hp thu cc i 465 nm; kt hp vi protein thỡ thuc nhum hp thu cc i bc súng 595 nm hp th bc súng 595 nm cú liờn h mt cỏch trc tip ti nng protein xỏc nh protein mu, u tiờn ta xõy dng mt ng chun vi dung dch protein chun ó bit trc nng Dung dch protein chun thng l bovine serum albumin (BSA) Sau cho dung dch protein vo dung dch thuc nhum, mu s xut hin sau phỳt v bn ti gi Tin hnh o dung dch bng mỏy quang ph k ta c OD , hp th s t l vi lng mu Thc hin mt i x chng vi nc ct (OD ) Ly giỏ tr OD = OD - OD Lng protein mu x dung dch o c xỏc nh bng cỏch chm trờn ng chun theo OD, ly giỏ tr ca im ú trờn trc honh ú chớnh l lng protein mu dung dch Cụng thc phõn t ca Coomasie Brilliant Blue G-250: 10 kt qu tỏch mi theo yờu cu thỡ chỳng ta phi thay i bn cht pha ng (s dng dung mụi khỏc), tc thay i ụi cú th phi thay i c pha tnh Trong quỏ trỡnh tỏch ca SKP, s tng tỏc gia hp cht cn phõn tớch v pha ng ph thuc rt nhiu vo moment lng cc, tớnh acid (cho proton) hoc tớnh base (nhn proton) ca dung mụi Thụng thng pha ng SKP bao gm mt hn hp nc hoc dung dch m vi mt hoc nhiu dung mụi hu c phõn cc tan c nc Nc l mt dung mụi rt phõn cc nờn nú khụng tng tỏc vi nhng nhúm alkyl khụng phõn cc pha tnh, ú nú c coi nh pha ng yu nht v cú tc gii chm nht tt c cỏc dung mụi ng ca SKP Hn hp nc v dung mụi hu c thng lm gia tng nht dn n vic tng ỏp sut ct Hỡnh nht ca hn hp nc vdung mụi hu c 250C Vic la chn dung mụi v thnh phn dung mụi pha ng c ti u húa cho nhng hp cht cn phõn tớch Thụng thng, ngi ta s dng hn hp dung mụi MeOH/nc trc, ri ACN/nc hay THF/nc Vi mt hn hp cht phõn tớch phc thỡ s cú s trn ln ca cỏc dung mụi hu c vi nc Khi la chn thỡ phi chn cỏc hn hp MeOH, ACN v THF vi nc cú gii tng ng 40 Thnh phn pha ng cú th c nh sut quỏ trỡnh chy sc ký (ch isocratic) hoc c thay i theo mt chng trỡnh ó nh sn (chng trỡnh gradien dung mụi) cú hiu qu tỏch tt hn 3.5 Mụt sụ lng c ban phõn tớch sc ký 3.5.1 H s phõn b Cõn bng ca mt cu t X h sc ký cú th c mụ t bng phng trỡnh nh sau: Hng s cõn bng K cho cõn bng ny c gi l t l phõn b hay hng s phõn b (partition coefficient) v c tớnh nh sau: Vi CS : nng cu t pha tnh CM : nng cu t pha ng H s K tựy thuc vo bn cht pha tnh, pha ng v cht phõn tớch 3.5.2 Thi gian lu tR : thi gian lu ca mt cu t t vo ct n tỏch ct tO : thi gian cho cht no ú khụng cú ỏi lc vi pha tnh i qua ct; ú cng l thi gian pha ng i t u ct n cui ct v cũn gi l thi gian lu cht tR' : thi gian lu tht ca mt cu t Hỡnh Thi gian lu ca cu t phõn tớch 41 3.5.3 H s dung lng k k c nh ngha theo cụng thc sau: Vi VS : th tớch pha tnh VM : th tớch pha ng Nu k~ 0, tR~ tO: cht rt nhanh, ct khụng cú kh nng gi cht li Nu k cng ln (tR cng ln): cht ct cng lõu, thi gian phõn tớch cng lõu, mi cú kh nng b tự Khong k lý tng l 2-5, nhng phõn tớch mt hn hp phc tp, k cú th chp nhn khong rng 1-20 3.5.4 Hiu nng Hiu nng hay s a lý thuyt N ca ct c trng cho kh nng tỏch mi sc ký ca cỏc cu t trờn ct N cng ln, hiu nng tỏch cng cao S a lý thuyt cú th o trờn sc ký Ngi ta chng minh c: Hay Vi W1/2 l chiu rng mi sc ký v trớ ẵ chiu cao mi (phỳt) W l chiu rng mi sc ký v trớ ỏy mi (phỳt) 3.5.5 chn lc c trng cho kh nng tỏch hai cht ca ct 3.6.6 phõn gii õy l i lng biu th rừ c ba kh nng ca ct sc ký: s gii hp, s chn lc v hiu qu tỏch Nú c xỏc nh qua phng trỡnh sau: Hay 42 Vi N c xỏc nh t phng trỡnh (2.5) hoc (2.6) 3.6 H thng HPLC H thng sc ký lng hiu nng cao gm cú cỏc b phn c bn nh sau: Hỡnh S h thng HPLC Trong ú: 1: Bỡnh cha pha ng 2: B phn kh khớ 3: Bm cao ỏp 4: B phn tiờm mu 5: C sc ký (pha tnh) 6: u dũ 7: H thng mỏy tớnh cú phn mm ghi nhn tớn hiu, x lý d liu v iu khin h thng 8: In d liu 3.6.1 Bỡnh cha pha ng Mỏy HPLC thng cú ng dung mụi vo u bm cao ỏp cho phộp chỳng ta s dng bỡnh cha dung mụi cựng mt ln gii theo t l mong mun v tng t l ca ng l 100% Tuy nhiờn, ngi ta ớt s dng ng dung mụi cựng mt lỳc m thng s dng hoc ng cho h pha ng luụn c pha trn ng nht hn, h pha ng n gin hn giỳp n nh quỏ trỡnh gii 43 Tt c dung mụi dựng cho HPLC u phi l dung mụi tinh khit s dựng cho HPLC Tt c cỏc húa cht dựng chun b mu v pha h m u phi l húa cht tinh khit dựng cho phõn tớch.Vic s dng húa cht tinh khit nhm trỏnh hng ct sc ký hay nhiu ng nn, to nờn cỏc peak quỏ trỡnh phõn tớch 3.6.2 B kh khớ Degases Mc ớch s dng b kh khớ nhm lai tr cỏc bt nh cũn sút li dung mụi pha ng, trỏnh xy mt s hin tng cú th cú nh sau: T l pha ng ca cỏc ng dung mụi khụng ỳng lm cho thi gian lu ca peak thay i Trong trng hp bt quỏ nhiu, b kh khớ khụng th lai tr ht c thỡ bm cao ỏp cú th khụng hỳt c dung mụi, ú nh hng n ỏp sut v hot ng ca c h thng HPLC Trong cỏc trng hp trờn u dn n sai kt qu phõn tớch 3.6.3 Bm cao ỏp Mc ớch bm pha ng vo ct thc hin quỏ trỡnh chia tỏch sc ký Bm phi dt c ỏp sut cao khang 250-600bar v to dũng liờn tc Lu lng bm t 0.1 n 10ml/phỳt 5.4 B phn tiờm mu a mu vo ct phõn tớch theo vi th tớch bm cú th thay i Cú cỏch a mu vo ct: bng tiờm mu th cụng v tiờm mu t ng (autosampler) 3.6.4 Ct sc ký Ct cha pha tnh c coi l trỏi tim ca ca h thng sc ký lng hiu nng cao Ct pha tnh thụng thng lm bng thộp khụng r, chiu di ct thay i t 5-25cm ng kớnh 1-10mm, ht nhi c 0.3-5àm,Cht nhi ct ph thuc vo lai ct v kiu sc ký 3.6.5 u dũ L b phn phỏt hin cỏc cht chỳng ct v cho cỏc tớn hiu ghi trờn sc ký cú th nh tớnh v nh lng Tựy theo tớnh cht ca cỏc cht phõn tớch m ngi ta la chn lai u dũ phự hp Tớn hiu u dũ thu c cú th l: hp th quang, cng phỏt x, cng in th, dn in, dn nhit, chit sut, Trờn c s ú, ngi ta sn xut cỏc lai u dũ sau: - u dũ quang ph t ngai 190-360nm phỏt hin UV - u dũ quang ph t ngoi kh kin (UV-VIS) (190-900nm) phỏt hin cỏc cht hp th quang õy l lai u dũ thụng dng nht - u dũ hựynh quang (RF) phỏt hin cỏc cht hu c cha hunh quang t nhiờn v cỏc dn sut cú hunh quang 44 - u dũ DAD (Detector Diod Array) cú kh nng quột chng ph nh tớnh cỏc cht theo hp th cc i ca cỏc cht - u dũ khỳc x (chit sut vi sai) thng dựng ú cỏc loi ng - u dũ in húa: o dũng, cc ph, dn - u dũ o dn nhit, hiu ng nhit, 3.6.6 B phn ghi nhn tớn hiu B phn ny ghi tớn hiu u dũ phỏt hin i vi cỏc h thng HPLC hin i, phn ny c phn mm h thng ghi nhn, lu cỏc thụng s, sc ký , cỏc thụng s liờn quan n peak nh tớnh i xng, h s phõn gii, ng thi tớnh toỏn, x lý cỏc thụng s liờn quan n kt qu phõn tich Phng phỏp quang ph phỏt x nguyờn t (ICP-AES) 4.1 Gii thiu Phng phỏp phõn tớch quang ph phỏt x nguyờn t ngun plasma cm ng cao tn (ICP-AES) cũn gi l quang ph phỏt x quang hc ngun plasma cm ng cao tn (ICP-OES) õy l mt k thut giỳp phõn tớch thnh phn nguyờn t ca mt mu vi cỏc u im nh sau: Phỏt hin, nh lng c nhiu nguyờn t húa hc chớnh xỏc lp li thng tt hn 1% t xy hin tng nhiu húa hc, nhiu ph Tc phõn tớch nhanh so vi cỏc k thut khỏc Khõu chun b mu khỏ n gin v thit b hnh tng i d dng 4.2 ng dng Cỏc ng dng tiờu biu ca ICP-AES l xỏc nh cỏc kim loi ru, arsen thc phm, v cỏc nguyờn t vt liờn kt vi cỏc protein ICP-OES c s dng rng rói cụng nghip ch bin khoỏng sn cung cp cỏc d liu v thnh phn ca cỏc dũng khỏc nhau, giỳp cho vic xõy dng phng phỏp cõn bng nh lng (tớnh toỏn s thay i v lng, tỡm nguyờn t cha bit) ICP-AES thng c s dng phõn tớch cỏc nguyờn t vi lng t, v vỡ lý ú nú thng c s dng phỏp y xỏc nh ngun gc ca cỏc mu t c tỡm thy ti hin trng phm ti hoc v nn nhõn ICP-AES cng nhanh chúng tr thnh phng phỏp phõn tớch c la chn xỏc nh mc dinh dng t nụng nghip Sau ú thụng tin ny c s dng tớnh toỏn lng phõn bún cn thit ti a húa nng sut v cht lng v 45 ICP-AES c s dng nghiờn cu du ng c Phõn tớch du ng c cho bit nhiu thụng tin v cỏch hnh ca ng c Cỏc b phn trang b ng c s li cỏc vt tớch du, nhng du vt ú cú th c phỏt hin bng ICP-AES Phõn tớch ICP-AES cú th giỳp xỏc nh cỏc b phn ang b li Ngoi ra, ICP-AES cú th xỏc nh lng ph gia du cũn li v ú ch vi s du cũn li ng c cũn hot ng c bao lõu 4.3 Nguyờn tc hot ng ca thit b ICP-AES Quang ph phỏt x nguyờn t s dng plasma ghộp ụi cm ng to cỏc nguyờn t v ion b kớch thớch, chỳng s phỏt nhng bc x in t cỏc bc súng c trng ca tng nguyờn t õy l k thut ngn la s dng ngn la cú nhit khong t 6.000 n 10.000K Cng phỏt x ny l biu hin nng ca cỏc nguyờn t mu 4.4 C ch hot ng ca thit b 46 Mỏy ICP-AES bao gm hai phn: phn ICP v phn mỏy o quang uc ICP gm ng thy tinh thch anh ng tõm Cỏc u hoc h vũng lm vic ca mỏy phỏt súng cao tn (RF) qun quanh mt phn ca ngn uc thch anh ny Khớ Argon thng c s dng to plasma Khi ngn uc c bt, mt in t trng cng ln c to h thng vũng lm vic ny bi ngun nng lng ln tn s vụ tuyn i cun dõy Tớn hiu cao tn RF ny c to bi mỏy phỏt RF hot ng c tn s 27 hoc 40 MHz Dũng khớ argon i qua ngn uc c kớch thớch bi mt n v Tesla (t trng) s to mt vũng h quang in ngn qua dũng khớ argon bt u quỏ trỡnh ion húa Khi plasma ó c t chỏy, t trng Tesla ó c tt i Khớ argon c ion húa trng in t cng cao v i vo mt gng quay c bit i xng vi hng v vựng t trng ca h vũng cm ng RF Nhng va chm khụng n hi c to gia cỏc nguyờn t argon trung hũa v cỏc ht tớch in to ngn la Plasma cú nhit cao khong 7000 K n nh Mt bm nhu ng bm mu dung dch nc hoc hu c vo u phun sng, ti õy chỳng c bin i thnh sng mự v a trc tip vo bờn ngn la plasma Cỏc mu ny lp tc va chm vi cỏc electron v cỏc ion tớch in plasma v bn thõn chỳng s t to cỏc ion tớch in Cỏc phõn t khỏc b phỏ 47 v thnh cỏc nguyờn t tng ng, sau ú b mt in tớch tỏi kt hp nhiu ln plasma, to bc x cỏc bc súng c trng ca cỏc nguyờn t cú liờn quan Trong mt s mu thit k, mt dũng khớ ct thng l nit hoc khớ nộn khụ, c s dng ct uụi plasma ti mt im c th Sau ú mt hoc hai thu kớnh truyn sỏng c dựng trung ỏnh sỏng phỏt x vo mt h cỏch t nhiu x, ti õy ỏnh sỏng c tỏch thnh cỏc bc súng thnh phn ca nú b phn o quang Trong nhng thit k khỏc, plasma c dn trc tip vo mt b giao thoa quang hc cú mt l phun dũng khớ argon, lm chch hng cng nh lm mỏt plasma ỏnh sỏng phỏt x t ngn la plasma i vo bung o quang Vn cũn nhng thit k khỏc s dng si quang hc truyn ỏnh sỏng ti nhng bung quang hc riờng bit Trong nhng bung quang hc, sau ỏnh sỏng c tỏch thnh cỏc bc súng (mu sc) khỏc nhau, cng ỏnh sỏng c o bng mt ng nhõn quang hoc nhng ng khỏc c t vo v trớ phự hp quan sỏt cỏc bc súng c th cho mi loi nguyờn t liờn quan, hoc cỏc h thng hin i hn, s o mu sc phn chiu thnh mt dóy trờn b tỏch súng quang bỏn dn, vớ d nh b cm bin tớnh in kộp (CCD) Trong cỏc mỏy s dng loi u dũ dng mng ny, cng ca tt c cỏc bc súng (trong phm vi di o ca h thng) cú th c o ng thi, cho phộp thit b phõn tớch tt c cỏc nguyờn t cú th b kớch thớch cựng mt lỳc Nh vy, cỏc mu cú th c phõn tớch rt nhanh chúng Sau ú, cng ca mi vch súng sau ú s c so sỏnh vi cng cỏc vch tiờu chun ó c o trc ú, v t ú nng ca cỏc vch súng ny c tớnh bng cỏch ni suy theo ng chun Ngoi cũn cú phn mm c bit hiu chnh hin tng nhiu nn gõy s cú mt ca nhiu nguyờn t khỏc nn ca mu phõn tớch 4.5 Mt s b phn quang trng thit b ICP-AES 4.5.1 B phun sng (nebulizer) Giỳp chuyn mu t dng lng sang dng sng B phn phun sng nu hot ng hiu qu s giỳp to cỏc ht sng cú kớch thc nh, mt cao B phn ny c ni vi dũng khớ argon ỏp lc cao Mu sau to sng s i vo spray chamber gim hin tng nhiu nh loi b c cỏc ht sng kớch thc ln Hin cú cỏc dng: - Concentric nebulizer (ng trc): cú cu to ng mao qun, kớch thc ng cng nh, nhy cng cao nhng cú th b tc nu mu cú hm lng mui cao - Meihard Concentric nebulizer: phự hp vi mu cú nng mui cao nhng khụng bn, d v, d b n mũn - Micro Concentric nebulizer: ng mao qun nh bng Teflon hoc polyimide, thõn bng polyvinylidine difluoride ớt b n mũn nhng khú ra, tn thi gian - Cross-flow nebulizer (pneumatic): hiu sut to sng kộm nhng dung hp nhng mu cú nhiu mui rt tt v cú ng mao qun lm bng sapphire 48 - Babington nebulizer: phự hp vi mu cú nht cao, nhiu mui - Ultrasonic nebulizer: cú b phn rung siờu õm to sng, nhy cao hn pneumatic nebulizer 10-20% nhng cn c lm lnh v khụng phự hp vi mu nhiu mui Cn cú mỏy bm mu 4.5.2 ốn plasma (ICP torch) õy l b phn liờn quan n s hỡnh thnh ph phỏt x nguyờn t Cu to l ng thch anh ng tõm cú tỏc dng dn khớ argon to plasma, cụ lp cun cm ng plasma ng thi dn mu vo plasma ốn plasma gm cú cỏc loi one piece , semi-demountable v demountable, cỏc loi ny khỏc s thỏo ri ng thch anh ng tõm bờn Ngn la plasma hỡnh thnh b phn torch c chia thnh vựng: - Vựng bt u phỏt x - Vựng phõn tớch - Vựng uụi plasma cú nhit thp tng hiu qu phõn tớch, cú th la chn loi torch cú kiu ngn la plasma dng radial ( xuyờn tõm) hay axial (dc truc) 49 Radial plasma: Ca s quang khụnglm nh hng mu vỡ vy tớn hiu tt khụng nh hng uụi plasma Loi torch ny thớch hp vi nn mu phc tp, cú bn rt tút Axial plasma: Ngn la di nờn tớn hiu ln, nhy cao nhiờn ca s quang vng uụi ngn la plasma, xy hin tng tỏi hp thu Plasma dc trc cú th iu chnh c chiu cao ca s quang, chu tt cỏc nn mu phc cú nng cht tan lờn n 30%, cỏc dung mụi hu c nh methanol, ethanol Dng plama ny cú th s dng cho cỏc phõn tớch thng nht vỡ gii hn phỏt hin khỏ tt mt s thit b hin i, ốn plasma c thit k thnh dng dual, ngha l cú th s dng c ch plasma dc trc ln xuyờn tõm nh h thng gng xoay 50 TI LIU THAM KHO Abayomi P Adebiyi, Rotimi E Aluko ( 2011), Functional properties of protein fractions obtained from commercial yellow field pea (Pisum sativum L ) seed protein isolate; Food Chemistry 128: 902-908 Analớa Verúnica Fernỏndez Gimenez, Ana Cristina, Susana Marớa Velurtas, Jorge Lino Fenucci (2009), In vivo and in vitro protein digestibility of formulated feeds for Artemesia longinaris (Crustacea, Penaeidae); Braz arch biol Technol 52 (6 ) Andrew F Parsons (1996), Recent developments in Kanoid Amino acid chemistry; Tetrahedron 52: 4149-4174 Anja Schwenzfeier, Peter A Wierenga, Michel H M Eppink, Harry Grupen (2014), Effect of charged polysaccharides on he techno-functional properties of fractions obtained from algae soluble protein; Food Hydrocolloids 35: 9-18 Anja Schwenzfeier, Peter Alexander Wierenga, Harry Grupen (2011), Isolation and characterization of soluble protein from the green microalgae Tetraselmis sp.; Bioresource Technology 102: 9121-9127 Anuchita Moongngarm, Sirinapa Sasanam, Watcharee Pinsiri, Puttarat Inthasoi, Sakawduen Janto, Jutharat Pengchai (2014), Functional properties of protein concentrate from black cowpea and its application; American Journal of Applied Sciences 11: 1811-1818 Augusto E Serrano Jr., Jon I L Aquino (2014), Protein concentrate of Ulva intestinalis (Chlorophyta, Ulvaceae) could replace soybean meal in the diet of Oreochromis niloticus fry; International Journal of the Bioflux Society 7: 255-262 Barbarino E & Sergio O Lourenỗo (2005), An evaluation of methods for extraction and quantification of protein from marine macro- and microalgae; Journal of Applied Phycology 17 (5): 447460 Barbarino E and Sergio O Lourenỗo (2009), Comparison of CHN analysis and Hach acid digestion to quantify total nitrogen in marine organisms; Limnol Oceanogr Methods 7, 751760 10 Benjamin Moll, Jill Deikman (1995), Enteromorpha Clathrata: a potential seawater-irrigated crop; Bioresource Technology 52: 255-260 11 Beth A Ahner, Francois M M Morel (1995), Phytochelatin production in marine algae; Limnol Oceannorg 40: 658-665 12 Boobathy S., P Soundarapandian, M Prithivraj, V Gunasundari (2010), Biochemical characterization od protein isolated from seaweed, Gracilaria edulis, Current Reasearch Journal of Biological Sciences 2: 35-37 13 Boonchum W., Peerapornpisal Y., Kanjanapothi D., Pekkoh J., Pumas C., Jamjai U., Amornlerdpison D., Noiraksar P., Vacharapiyasophon P., Antioxidant Activity of some Seaweed from the Gulf of Thailand, Int J Agric Biol 13 (1): 95-99 14 Catherine Rouxel, Eric Bonnabeze, Andre Daniel, Marc Jerome, Monique Etienne, Joel Fleurence (2001), Identification by SDS PAGE of green seaweeds (Ulva and Enteromorpha) used in the food industry; Journal of Applied Phycology 13: 215219 15 Ching Yung Ma and Venktest R Harwalkar (1984), Chemical characterization and functionalityassessment of oat protin fraction; J Agric Food Chem 32 (1): 145-149 16 Chuan Sheih, Tony J Fang, Tung-Kung Wu (2009), Isolation and characterization of a novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste; Food Chemistry 115: 279-284 51 17 Chung M W Y., B Lei, E C Y Li-Chan (2005), Isolation and structuralcharacterization of the major protein fraction from Norman flaxseed (Linum usitatissinum L.), Food Chemistry 90: 271-279 18 Contreras L., Andrộs Ritter, Geraldine Dennett, Freddy Boehmwald, Nathalie Guitton, Charles Pineau, Alejandra Moenne, Philippe Potin, Juan A Correa (2008), Two-dimensional gel electrophoresis analysis of brown algal protein extracts; J Phycol 44: 13151321 19 Cynthia Fabian and Yi-Hsu Ju (2011), A review on rice bran protein: its properties and extraction methods; Critical Reviews in Food Science and Nutrition 51: 816827 20 DiaelDin M Ragab, Elfadil E Babiker, abdulahi H Eltinay (2004), Fractionation, solubility and functional properties of cowpea (Vigna unguiculata) proteins as affected by pH and/or salt concentration; Food Chemistry 84:207-212 21 Elisabete Barbarino, Sergio O Lourenco (2005), An evaluation of methods for extraction and qualification of protein from marine macro- and microalgae, Journal of Applied Phycology 17: 447-460 22 Faiz Ahmad Ansari, Amritanshu Shriwastav, Sanjay Kumar Gupta, Ismail Rawat, Abhishek Guldhe, Faizal Bux (2015), Lipid extracted algae as a source of protein and reduced sugar: a step closer to the biorefinery; Bioresource Technology 179: 559-564 23 Fatoumata Tounkara, Tidjiani Amza, Camel Lagnika, Gou-Wei Le, Yong Hui Shi (2013), Extraction, characterization, nutritional and functional properties of Roselle (Hisbiscus sabddariffa Linn) seed proteins; Songklanakarin J Sci Technol 35 (2): 159-166 24 Feng Dawei, Liu Haiyan, Li Fuchao, Jiang Peng, Qin Song (2011), Optimization of dilute acid hydrolysis of Enteromorpha; Chinese Journal of Oceanology and Limmology 29: 1243-1248 25 Fleurence J (1999), Seaweed proteins: biochemical, nutritional aspects and potential uses, Trends in Food Science & Technology 10 (1): 25-28 26 Ganesan K., K Suresh Kumar, P.V Subba Rao, Y Tsukui, N Bhaskar, M Hosokawa, K Miyashita (2014), Studies on chemical composition of three species of Enteromorpha; Biomedicine and Preventive Nutrition 4: 365-369 27 Girdhari M Sharma, Mengna Su, Aditya U Joshi, Kenneth H Roux, Shridhar K Sathe (2010), Functional properties of select edible oilseed proteins, J Agric Food Chem 58: 5457- 5464 28 Herminia Dominguez (2013), Functional Ingredients from algae for food an Nutraceuticals, Woodhead Publishing 29 Hromadkov Z and A Ebringerov (2003), Ultrasonic extraction of plant materials investigation of hemicellulose release from buckwheat hulls, Ultrasonics Sonochemistry 10: 127133 30 Jiao Lv, Yuan Zhao, Jianzhong, Jie Ouyang, Fengjun Wang (2015), Effects of environmental factors on functional properties of Chinese chestnut (Castanea Mollissima) protein isolate; Eur Food Res Technol 240: 463-469 31 Jum-Ji Kim, Yu-Mi Jeon, Jae-Hoon Noh, Mi-Young Lee (2011), Isolation and characterization of a new phycoerythrin from the cyanobacterium Synechococcus sp.; J Appl Phycol 23: 137-142 32 Kalpa Samarakoon, You-Jin Jeon (2012), Bio-functionalities of proteins derived from marine algae- A review; Food Research International 48: 948-960 52 33 Lawal O.S., K.O Adebowale, B M Ogunsanwo, O A Sosanwo, S A Bankole (2005), On the functional properties of globulin and albumin protein fractions and flours of African locust bean (Parkia biglobossa); Food Chemistry 92: 681-691 34 Li Day (2013), Protein from plants- potential resources for human nutrition an food security; Trend in Food Science and Technology 32: 25-42 35 Liao W.-R., J Y Lin, W Y Shieh, w L Jeng, R Huang (2003), Antibiotic activity of lectins from marine algae against marine vibrios; J Ind Microbiol Biotechnol 20: 433-439 36 Lim, H T, Teo, S S (2015) Comparison of protein extraction protocols for Proteomic analysis of red algae, Eucheuma cottonii; Pertanika J Trop Agric Sci 38: 279-293 37 Louise A Lewis, Richard M McCourt (2004), Green algae and the origin of land plants, American Journal of Botany 91: 1535-1556 38 Mamatha B S., K K Namitha, Amudha Senthil, J Smitha, G A Ravishankar (2007), Studies on use of Enteromorpha in slack food; Food Chemistry 101: 17071713 39 Marcel Jaspars, Florence Folmer (2013), Seaweed for health; University of Aberdeen 40 Mason Timothy J (2007), Developments in ultrasoundNon-medical, Progress in Biophysics and Molecular Biology 93 (13): 166175 41 Mendes-Pinto M.M., M.F.J Raposo, J Bowen, A.J Young & R Morais (2001), Evaluation of different cell disruption processes on encysted cells of Haematococcus pluvialis: effects on astaxanthin recovery and implications for bio-availability; Journal of applied phycology 13(1): 19-24 42 Mundi S., R E Aluko (2012), Physiochemical and functional properties of kidney bean albumin and globulin protein fractions; Food Research International 48: 299306 43 Ortiz J., N Romero, P Roberta, J Araya, J Lopez-Hernỏndez, C Bozzo, E Navarrete, A Osorio, A Rios (2006), Dietary fiber, amino acid, fatty acid and tocopherol contents of the edible seaweeds Ulva lactuca and Durvillaea antarctica; Food Chemistry 99: 98-104 44 Plaza M., Alejandro Cifuentes, Elena Ibỏủez (2008), In the search of new functional food ingredients from algae; Trends in Food Science & Technology 19 (1): 31-39 45 Qianchun Deng, Lan Wang, Fang Wei, Bijun Xie, FengHong Huang, Wen Huang, John Shi, Qingde Huang, Binqiang Tian, Sophia Xue (2011), Functional properties of protein isolates, globulin and albumin extracted from Gingko biloba seeds; Food Chemistry 124: 1458- 1465 46 R Toews, N Wang (2013), Physicochemical and functional properties of protein concentrate from pulses; Food Research International 52: 445-451 47 Rapeeporn Ruangchuay, Sofhanee Dahamat, Anong Chirapat, Masahiro, Notoya (2012), Effects of culture conditions on the growth and reproduction of Gut Weed, Ulva intestinalis Linnaeus (Ulvales, Chlorophyta), Songklanakarin J Sci Technol 34: 501507 48 Ronny Horax, Navam Hettiarachchy, A Kannan, Pengyin Chen (2011), Protein extraction optimization, characterization and functionalities of protein isolate from bitter melon (Momordica charantia) seed; Food Chemistry 124: 545-550 49 Rossano R., N Ungaro, A DAmbrosio, G M Liuzzi, P Riccio (2003), Extracting and purifying R-Phycoerythrin from Mediterranean red algae; Journal of biotechnology 101: 289- 293 53 50 Sathe S K., D K Salunkhe (1981), Functional properties of the great northern bean (Phaseolus vulgaris L.) proteins: Emulsion, Foaming, viscosity and Gelation properties, Journal of food science 46: 71-81 Functional properties 51 Se-kwon Kim and Katarzyna Chojnacka (2014), Marine Algae Extracts, Processes, products, and application, Volume 2, Wiley-VCH 52 Sergio Gonzalez-Perez, Johan M Vereijken, Gerrit A Van Koningsveld, Harry Gruppen, Alphong G J Voragen (2005), Physiochemical properties of 2S albumins and the corresponding protein isolate from sunflower (Helianthus annuus); Journal of Food Science 70: 98-103 53 Sheih C., Wu T K., Fang Tony J (2009), Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems; Bioresource Technology 100: 34193425 54 Suresh Kumar K., K Ganesan, Kandasamy Selvaraj, P V Subba Rao (2014), Studies on the functional properties of protein concentrate of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty- an edible seaweed; Food Chemistry 153: 353-360 55 Sze-Tao K W C., S.K Sathe (2000), Functional properties and in vitro digestibility of almond (Prunus dulcis L.) protein isolate; Food Chemistry 69: 153-160 56 Thutiyaporn Chittapalo, Athapol Noomhorm (2009), Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates; Intternatioal Journal of Food Science and Technology 44: 1843-1849 57 Tore Lindholm, Petra Ohman, Katriina Kurki-Helasmo, Brendan Kincaid, Jussi Meriluoto (1999), Toxic algae and fish mortality in brackish water lake in Aland, SW Filand; Hydrobiologia 397: 109-120 58 Wang M., N S Hettiarachchy, M Qi, W Burks, T Siebenmorgen (1999), Preparation and functional properties of rice bran protein isolate; J Agric Food Chem 411-416 59 Were L , N S Hettiarachchy, U Kalapathy (1997), Modified soybean proteins with improved foaming and water hydration properties; Journal of Food Science 62 (4): 821-824 60 Wisal H Idris, Elfadilm, E Babiker, Abdullahi H, El Tinay (2003); Fractionation, solubility and functional properties wheat bran proteins as influenced by pH and/or salt concentration; Nahrung/Food 47: 425-429 61 Zbakh H., Houda Chiheb, Hassan Bouziane, Virginia Motilva Sỏnchez and Hassane Riadi (2012), Antibacterial activity of benthic marine algae extracts from the Mediteranean coast of Morocco; Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences (1): 219-228 54