Báo cáo tiểu luận các phương pháp phân tích trong quá trình ly trích anthocyanin từ khoai lang tím

Anthocyanin là hợp chất gồm có gốc aglycon có màu (được gọi là anthocyanidin hay anthocyanidol) kết hợp với các glucoside có gốc đường glucose, galactose… Anthocyanin hòa tan trong nước còn anthocyanidin thì không tan trong nước. Anthocyanin tham gia vào việc tạo nên đa sắc màu cho hoa quả. Đồng thời cùng với chất tạo màu khác như clorophin, carotenoid để tạo cho hoa quả có cường độ màu khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng và số đồng phân của chúng.

Mục lục

1 Tổng quan về khoai lang tím 2

2 Anthocyanin 4

2.1 Tổng quan về anthocyanin 4

2.2 Anthocyanin trong khoai lang tím 6

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màu của anthocyanin 8

3 Các phương pháp phân tích 12

3.1 Phổ cộng hường từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) 12

3.2 UV – Vis 36

3.2.1 Vi sai pH xác định tổng anthocyanin 38

3.2.2 Xác định hoạt tính chống oxi hóa của anthocyanin 40

3.3 Hệ thống LC – MS 40

3.3.1 Các loại đầu dò khối phổ 42

3.3.2 Nguồn ion hóa trong đầu dò khôi phổ 43

3.3.3 Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ 47

3.3.4 Ứng dụng của hệ thống LC/MS 48

Tài liệu tham khảo 50

1 Tổng quan về khoai lang tím

Khoai lang (danh pháp hai phần: Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với các rễ

củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, và nó là một nguồn cung cấp rau ăn củ quan trọng, được

sử dụng trong vai trò của cả rau lẫnlương thực Trong một số quốc gia khu vực nhiệt đới, khoailang được coi là một loại lương thực chủ yếu Cùng với tinh bột, củ khoai lang cũng chứanhiều xơ tiêu hóa, vitamin A, vitamin C và vitamin B6 Lưu ý tới hàm lượng xơ, cáccacbohydrat phức, protein, các vitamin A và C, sắt, canxi thì khoai lang đứng khá cao về giá trịdinh dưỡng

Bảng 1: Hàm lượng dinh dưỡng của khoai lang tươi (tính trên 100g phần ăn được)

Bảng 2: Hàm lượng dinh dưỡng của các loại khoai lang

Thành phần dinh

dưỡng

Khoai lang tím

Khoai lang đỏ

Khoai lang vàng

Khoai lang trắng

Màu sắc đậm của khoai lang tím được tạo thành từ phenolic sắc tố là anthocyanin Cũng vì lý

do đó mà khoai lang tím đang được thu hút nhiều sự chú ý từ cộng đồng Khoai lang tím hay cònduợc gọi là Ayamurasaki, là một loại khoai lang duợc dua vào sản xuất bởi viện nghiên cứu nôngnghiệp quốc gia Nhật Bản có tên là Okinawa Khoai lang tím duợc trồng thành công lần dầu tiên

ở Nhật Bản nam 1995 Trong những nam gần dây, loại khoai lang này dã duợc trồng phổ biến ởnhiều quốc gia dặc biệt là những quốc gia ở vùng khí hậu nhiệt dới Là một cây trồng chính đượctrồng trên toàn thế giới với năng suất cao, khoai lang tím rất giàu carbohydrate và chất xơ Ởnước ta khoai lang tím chủ yếu được trồng ở các tỉnh miền Tây và đã đem lại sản lượng khá lớngiúp thu nhập ổn định cho nông dân ở các tỉnh này Vĩnh Long, Đồng Tháp là những tỉnh trọngđiểm trồng khoai lang tím, riêng huyện Bình Tân có 14400 ha rau màu thì diện tích trồng khoailang tím chiếm 7800 ha, sản lượng dự kiền trên 257000 tấn cho năm 2014 Ngoài ra, khoai langtím còn có uu diểm vuợt trội do có chứa hàm luợng cao chất chống oxi hóa có tác dụng nganchặn sự phát triển của tế bào ung thu, chống lão hóa, bao gồm các hợp chất nhu: phenol,anthocyanin, carotenoid

Anthocianin trong khoai lang tím chủ yếu tồn tại trong mono- hoặc các hình thức di-acylated,nên nó thể hiện sự ổn định tốt (khả nang chịu duợc nhiệt dộ cao mà không bị mất màu cung nhu

bị biến dổi) hơn so với các sắc tố dâu tây, bắp cải đỏ, tía tô và các loại khác Đối với chế biếnthực phẩm, sự ổn định này có thể cho phép các sản phẩm màu có chất lượng phù hợp trong thờihạn sử dụng Như vậy, khoai lang tím là một nguồn nguyên liệu cung ứng anthocyanin dồi dào

2 Anthocyanin

2.1 Tổng quan về anthocyanin

Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh Tuy nhiên không chỉ có màu xanh,anthocyanin còn mang đến nhiều màu sắc như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian Cácanthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là các anthocyanidin hay aglycon

Anthocyanin là hợp chất gồm có gốc aglycon có màu (được gọi là anthocyanidin hayanthocyanidol) kết hợp với các glucoside có gốc đường glucose, galactose… Anthocyanin hòatan trong nước còn anthocyanidin thì không tan trong nước Anthocyanin tham gia vào việc tạonên đa sắc màu cho hoa quả Đồng thời cùng với chất tạo màu khác như clorophin, carotenoid

để tạo cho hoa quả có cường độ màu khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng và số đồng phân củachúng

Hình 1: Cấu trúc cơ bản của anthocyanidin của anthocyanin.

Các anthocyanidin của anthocyanin khác nhau là do các gốc R khác nhau

Bảng 3: Xác định cấu trúc của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tantốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, cácchất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhấtphụ thuộc vào pH môi trường Thông thường khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH

> 7 thì có màu xanh Ở pH = 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ,

ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, ở

pH = 7 - 8 lại về dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh

Hình 2: Anthcyanin thay đổi màu sắc theo pH.

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bướcsóng 510 - 540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin

chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh

có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh

Ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ranhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinhhọc quí như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxyhóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thànhmạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóngxạ

Những đặc tính quí báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất màu khác hìnhthành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được đã mở ra một hướng nghiên cứu ứngdụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong đời sống hàng ngày, đặc biệt trongcông nghệ chế biến thực phẩm

Anthocyanin phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có mặt trong 27 họ thực vật, thường tạo ra cácmàu đỏ, tím, xanh thẫm ở nhiều loại rau, hoa, quả như hoa dâm bụt, rễ củ cải đỏ, lá tía tô, dâutây và bắp cải tím Anthocyanin tích lũy chủ yếu ở trong tế bào biểu bì và hạ biểu bì thực vật,tập trung trong không bào hoặc các túi gọi là anthocyanoplast Nhìn chung, hàm lượnganthocyanin trong phần lớn rau quả dao động từ 0,1 đến 1,11% hàm lượng chất khô Thực vậtchứa anthocyanin cũng đồng thời chứa flavonoid

Trong rau quả hàm lượng anthocyanin liên quan đến độ đậm của màu sắc quả, quả càngđậm thì hàm lượng anthocyanin càng cao Anthocyanin trong thực vật không phải là một chấtthuần nhất mà là một hỗn hợp Tỷ lệ giữa các anthocyanin trong một loại rau quả phụ thuộc vàoloài, giống cây

2.2 Anthocyanin trong khoai lang tím

Hàm lượng của anthocyanin chiếm khoảng 14 mg/g chất khô của khoai lang tím.Anthocyanin có mặt trong khoai lang tím là thành phần chính tạo ra màu sắc khác biệt của

nó, trong đó có 12 thành phần đơn chất chính đã được xác định trong nghiên cứu của Heonwoong Kim và cộng sự và cyanidin - 3,5 - diglucoside là thành phần chủ yếu trong đó Mườihai đơn chất đó được xếp trong hai nhóm chính là cyanidin và peonidin

Bảng 4: Thành phần anthocyanin của khoai lang tím

Mười hai đơn chất được xác định trong đó đều có mang thành phần là glucose vàsophorose liên kết trong anthocyanin Mười một đơn chất trong đó trừ cyaniding sophoroside-5-glucoside đều có mối liên kết với các chất phenolic như là caffeic acid, ferulic acid, và p-hydroxybenzoic acid như được biểu diễn ở Hình 3.

Hình 3: Cấu tạo của cyanidin (R1 = H); peonidin (R1 = CH3) 3-sophoroside-5- glucoside

(a), caffeic acid (b), ferulic acid (c), and p-hydrobenzoic acid (d) 7 non-, mono-, hoặc acylated cyanidin đơn chất và 5 mono- hoặc di-acylated peonidin đơn chất lần lượt có tỷ lệ67% và 33% của tổng lượng anthocyanin trong khoai lang tím

di-Nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình gia nhiệt đến hàm lượng anthocyanin của

khoai lang tím cho thấy khi quá trình nướng không ảnh hưởng gì đến hàm lượng anthocyaninnhưng nấu dưới áp suất cao, hấp, hay sử dụng lò vi sóng đều làm giảm hàm lượng củaanthocyanin 8–16% của lượng ban đầu Đây thực tế là một sự giảm không nhiều so với hàmlượng của anthocyanin có trong khoai lang tím (1,4% khối lượng khô), khi so sánh với dâu(350 mg/kg) và bắp cải (250 mg/kg) Thông thường, anthocyanin trong khoai lang có 2 nhómchính như đã đề cập ở trên là cyanindin và peonidin, nếu dựa theo thành phần của anthocyaninthì có thể phân loại khoai lang thành hai loại là loại chứa nhiều cyanidin (tỷ lệ củapeonidin/cyanindin (pn/cy) <1) và loại chứa nhiều peonidin (tỷ lệ của peonidin/cyanindin(pn/cy) > 1) Sự khác biệt này dẫn đến những đặc tính khác nhau của màu sắc của khoai langcũng như một số tính chất của anthocyanin Với loại khoai lang chứa nhiều peonidin (pn/cy >1) thường thể hiện màu từ hồng đến đỏ ở trạng thái tươi của thịt củ khoai Như vậy, khi hàmlượng cyanidin cao thì màu của thịt củ sẽ dần chuyển sang tím và tím đậm Cyanidin có bảnchất chứa nhiều các nhóm –OH nên có đặc tính kháng oxy hóa mạnh hơn các nhóm chấtpeonidin.

Dưới tác dụng của nhiệt sẽ có sự bẻ gãy các mối liên kết trong hợp chất anthocyanin nênhàm lượng sẽ giảm theo thời gian xử lý Nhưng sự ảnh hưởng này còn phụ thuộc vào bản chấtcủa nhóm chất anthocyanin, chính là sự khác biệt của các nhóm chức liên kết chẳng hạn như,mono-acylated anthocyanin có liên kết với p-hydroxybenzoic acid cho khả năng bền cao nhấttrong nhóm chất anthocyanin của khoai lang tím nghiên cứu, kế đến là liên kết với ferulic acid

và caffeic acid Mono-acylated anthocyanins thường có độ bền nhiệt cao hơn so với các di- vànon-acylated Trong số đó, cyanidin 3-p- hydroxybenzoylsophoroside-5-glucoside có tính bềnnhất dưới tác dụng của nhiệt Đó có thể là lý do mono-acylated và cyanidin-predominatedanthocyanins trong khoai lang tím nghiên cứu có khả năng bền khi xử lý nhiệt Mặt khác cũng

có thể dưới tác dụng của nhiệt giúp giải phóng những anthocyanin ở dạng tiền chất dưới nhữngliên kết với các thành phần khác, nên có sự thay đổi trong một số thành phần anthocyanin sauquá trình xử lý nhiệt cyanidin 3-p-hydroxybenzoylsophoroside-5- và peonidin 3-p-hydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màu của anthocyanin

Ảnh hưởng của dung môi: trong dung môi protic anthocyanin thể hiện màu đỏ của ionflavylium, còn trong dung môi aprotic anthocyanin thể hiện màu vàng đặc trưng của chalcone

Điều này có thể được giải thích thông qua cơ chế sự hấp thu màu dạng monomer và dimer củaion flavylium (Ito và cộng sự, 2002) Nghiên cứu cũng cho thấy nước có vai trò quan trọngtrong quá trình dimer hóa ion flavylium từ đó ảnh hưởng nhiều đến khả năng tạo màu củaanthocyanin.

Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màu của anthocyanin: màu sắc và cưởng độ màu củaanthocyanin phụ thuộc chặt chẽ vào cân bằng giữa 3 trạng thái của anthocyanin là cationflavylium, chalcone và base quinoidal Khi pH tăng cân bằng chuyển dịch theo hướng tạo thànhcác base quinoidal theo phản ứng de- hydro hóa, còn trong môi trường acid anthocyanin tồn tạichủ yếu ở dạng ion flavylium nhờ phản ứng tách nước từ carbinol

Ảnh hưởng của gốc hydroxyl, methoxyl và vị trí liên kết đến khả năng tạo màu củaanthocyanin:

Anthocyanin bị methoxyl hóa và ít hydro hóa: bền ở pH kiềm, thể hiện màu xanh đặctrưng

Anthocyanin có nhiều nhóm –OH: không bền ở pH kiềm, thể hiện màu đỏ của cationflavylium trong điều kiện bình thường.

Acyl hóa: quá trình acyl hóa làm tăng độ bền pH do giảm khả năng hydrate hóa củaflavylium, trong trường hợp này anthocyanin thường thể hiện màu vàng

Glycoside hóa: làm tăng độ âm điện của cation flavylium, phản ứng hydrate hóa và proton hóa dễ dàng xảy ra, cân bằng chuyển dịch theo hướng tạo thành base quinoidal

de-Vị trí glycoside: quá trình glycoside hóa ở C3, C5 bền hơn so với C7

Ảnh hưởng tẩy màu của SO2 đến anthocyanin: với khả năng khử và tính ái nhân SO2 nên

có thể tác dụng và làm mất màu dung dịch anthocyanin

Ảnh hưởng của polyphenol oxidase: PPO chỉ oxy hóa anthocyanin trong môi trường có mặtcaffeic acid, chlorogenic acid hoặc gallic acid do dự tương tác của anthocyainin với các o-quinnon tạo thành từ quá trình oxy hóa sơ cấp caffeic acid, chlorogenic acid hoặc gallic acid.Sản phẩm tạo thành có màu nâu, làm giảm đáng kể giá trị cảm quan của nguyên liệu/ sản phẩm

Do đó quá trình khử các quinnon sẽ ức chế quá quá trình oxy hóa anthocyanin bởi PPO

Ảnh hưởng 2 chiều của vitamin C đến quá trình oxy hóa anthocyanin: trong môi trường cóPPO vitamin C sẽ ức chế sự oxy hóa anthocyanin, nhưng khi chỉ có mặt vitamin C của O2không những vitamin C bị oxy hóa mà còn thúc đẩy sự oxy hóa của anthocyanin

Ảnh hưởng của chất đồng tạo màu- copigment:

Phản ứng đồng tạo màu: là sự tương tác giữa các hợp chất không màu và anthocyaninlàm tăng cường độ và độ bền màu của anthocyanin Chất đồng tạo màu thường gặp vớianthocyanin là: catechin, epicatechin, procyanidin B2, caffeic acid, pcoumaric acid,chlorogenic acid, myricitrin và quercitin

Bản chất tương tác: tuân theo cơ chế chuyển điện tích của chất đồng tạo màu và cationflavylium thông qua việc ức chế ức chế phản ứng hydrate hóa và deproton hóa từ đó làmbền cation flavylium Phản ứng đồng tạo màu là xuât hiện hiệu ứng bathochrome chuyểncực đại hấp thu sang vùng có bước sóng cao hơn và hiệu ứng hyperchrome tăng cường

độ hấp thu của anthocyanin

Hình thành hệ liên kết e π-π: cũng góp phần quan trọng trong việc ổn định và tăng

cường độ màu của phức chất anthocyanin- đồng tao màu.

Quá trình đồng tạo màu tỉ lệ thuận với số gốc –OMe và số liên kết glucoside trong phân

tử anthocyanin Một điều rất đáng lưu ý là anthocyanin và tannin trong rượu và các sảnphẩm lên men cũng có thể tương tác như đồng tạo màu để ổn định màu

Tuy nhiên, quá trình đồng tạo màu lại không thể hiện được khả năng ổn định màu sắctrong môi trường có nhiệt độ cao, ánh sáng, oxy hoặc UV

Ảnh hưởng của ion kim loại: các kim loại như Al, Fe, Cu, Sn, Mo đều có khả năng tạo phứcvới vòng thơm B có 2 nhóm –OH trong phân tử anthocyanin (Boulton, 2001; Starr & Francis,1973; Hale và cộng sự, 2001) Sự tương tác này giúp ổn định độ bền của quinoidal base do đótrong các trường hợp liên kết với ion kim loại anthocyanin thường thể hiện màu xanh bền củabase quinoidal

Sự hình thành phức pyranoanthocyanin

Pyranoanthocyanin là dạng phức chất của anthocyanin và các hợp chất phân tử lượngthấp trong các sản phẩm lên men đặc trưng, trong đó 4-vinylphenol, pyruvic acid vàflavonols là những chất thường tạo phức với anthocyanin nhất

Bản chất liên kết: là sự đóng vòng nội phân tử giữa C4, -OH của C5 và chất liên kết tạothành cấu trúc 4 vòng ổn định độ bền của cation flavylium Kết quả tương tác: acid puruvic sẽ

khóa C4, ức chế quá trình tấn công ái nhân của nước hoặc các yếu tố khử khác giúp ổn địnhmàu sắc của anthocyanin.

3.1 Phổ cộng hường từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

Nguyên lý cộng hưởng từ hạt nhân

Hạt nhân của mỗi đồng vị nguyên tử được đặc trưng bởi 2 thống số: số lượng tử spin I và sốlượng tử từ m Số lượng tử spin I của một hạt nhân nhất định được xác định bằng thực nghiệm,trong đó I phụ thuộc vào số proton Z và số khối A của nguyên tử, I thường nhân các giá trị 0,1/2, 1, 3/2, 5/2,… Số lượng tử từ của hạt nhân có 2I+1 các giá trị khác nhau từ -I, -I + 1, chođến +I Có thể dễ dàng xác định I, mI của hạt nhân nguyên tử theo quy tắc sau:

Số lượng từ từ mI -I, -I+1, -I+2,…, I

Các hạt nhân của nguyên tử tích điện dương khi quay quang trục sẽ sinh ra moment quántính tương ứng là moment spin hạt nhân P và moment từ hạt nhân µ Mặt khác, khi hạt nhânnguyên tử quay quanh trục của nó sẽ làm xuất hiện một dòng điện với từ trường có moment từ

µ và hạt nhân trở thành một nam châm vĩnh cửu Moment từ hạt nhân µ tỷ lệ thuận với momentspin hạt nhân P thông qua công thức:

µ = γ P = γ 2 π h I Trong đó:γ: là hệ số từ thẩm đặc trưng cho mỗi hạt nhân nguyên tử

Khi I ≠ 0 thì P, μ ≠ 0, hạt nhân nguyên tử trở thành hạt nhân từ, đây chính là điều kiện tiênquyết để hình thành nên sự cộng hưởng từ hạt nhân

Khi đặt một hạt nhân từ vào trong từ trường có cường độ B0, các spin hạt nhân khác nhau sẽphân bố và quay theo hướng ngược chiều nhau:

Trạng thái năng lượng có thể được thể hiện thông qua công thức:

N 2

N 1=e

−∆ E

kT <1Như vậy, quá trình hạt nhân nguyên tử hấp thụ năng lượng đúng bằng năng lượng cộng

hưởng từ ∆E của chính hạt nhân đó để phân bố lại trạng thái năng lượng dưới tác dụng của từtrường ngoài B0 được gọi là hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân.

Phương pháp xác định tần số cộng hưởng từ hạt nhân

Có 2 phương pháp cơ bản để tạo ra hiên tượng cộng hưởng từ hạt nhân: sử dụng phổ kếxung liên tục và sử dụng phổ biến xung biến đổi Fourier

Phổ kiến xung liên tục: (Countinuous Wase- CW)

∆E = hυυ

∆E = -hυυ -> ghυi nhυận bằng detector

BHạt nhυân có spin I

≠ 0 ở trạng thυái

cơ bản

Tạo 2I+ 1 mức năng lượng, phυân

bố hυạt nhυân năng lượng cao và năng lượng thυấp

Thυay đổi cân bằng, tăng số lượng hυạt nhυân được kíchυ thυíchυ ở năng lượng cao

Hạt nhυân bức xạ trở về trạng thυái năng lượng thυấp hυơn

Bộ phận chứa mẫu (sample tube) thường là một ống thủy tinh nhỏ được treo lơ lửng giữa 2mặt cực của nam châm (magnet pole) Bộ phận chứa mẫu được thiết kế có thể quay xung quanhtrục để đảm bảo tất cả các phần của mẫu đều chịu tác dụng đồng nhất của từ trường Ở giữa 2cực của nam châm cũng đặt 1 cuộn dây gắn với máy phát tần số radio, cuộn dây này được cungcấp năng lượng điện dùng để thay đổi hướng các spin của proton Phổ kế xung liên tục sử dụngmáy phát dao động với tần số không đổi nhưng thay đổi cường độ từ trường (phương pháp quéttrường) hoặc cố định cường độ từ trường và thay đổi tần số quét (phương pháp quét tần) quamẫu để tạo ra cộng hưởng từ của các hạt nhân (proton) Cuộn dây (detector) được đặt vuônggóc với với máy phát dao động để ghi nhận tín hiệu cộng hưởng tử hạt nhân.

Khi sự cộng hưởng từ xảy ra, mẫu hấp thụ năng lượng dẫn đến sự tách mức và phân bố lạinăng lượng của hạt nhân, tín hiệu được thu nhận bởi cuộn detector, sau đó được khuếch đại(amplifier) và ghi lại bằng bộ ghi tín hiệu (recorder) dưới dạng phổ

Tần số cộng hưởng của từng hạt nhân được xác định bằng cách quét trong 1 dãy các tần sốcộng hưởng ở từng thời điểm nhất định Các hạt nhân với tần số cộng hưởng khác nhau đượckích thích một cách lần lượt, riêng biệt và các tín hiệu cũng được ghi độc lập các các hạt nhânkhác Peak tạo thành từ phổ kế xung liên tục là chuỗi dao động tắt dần do các hạt nhân bị kíchthích không có thời gian để phục hồi trở lại trạng thái cơ bản trước khi cường độ từ trường thayđổi để tạo thành tín hiệu mới vì vậy chúng vẫn còn dao động, làm phân rã nhanh tín hiệu và

được ghi nhận dưới dạng peak rung.

Phổ kế xung biến đổi Fourier (FID- Fourier Transformer)Với hệ gồm nhiều hạt nhân khác nhau, việc xác định lần lượt tần số cộng hưởng của từnghạt nhân riêng lẻ thường phức tạp và tốn nhiều thời gian, để khắc phụ điều này các hệ cộnghưởng từ hạt nhân hiện nay đều sử dụng phổ kế biến đổi Fourier Phổ kế biến đổi Fourier sửdụng từ trường cường độ mạnh trong thời gian ngắn để xác định đồng thời tất cả các tần sốcộng hưởng, sau đó sử dụng biến đổi Fourier để tách từng tần số nhất định

Để tạo thành cường độ từ trường đủ mạnh, phổ kiến biến đổi Fourier sử dụng nam châmsiêu dẫn được chế tạo từ một hợp kim đặc biệt và làm lạnh đến nhiệt độ sôi của Heli lỏng(4.2K) Nam châm này được đặt trong một buồng cách nhiệt chứa Heli lỏng và bình này lạiđược đặt trong 1 bình cách nhiệt khác chứa N2 lỏng đển ổn định nhiệt độ

Từ trường cường độ cao không tác dụng liên tục lên mẫu mà cách quãng dưới dạng xungngắn 1- 10μs Theo nguyên lý Heisenberg do xung tác động ngắn, dao động không đủ dài để tạothành 1 tần số cơ bản thuần nhất Do đó xung tạo thành chứa một vùng tần số xung quanh tần số

cơ bản, vùng này có năng lượng đủ lớn để có thể làm kích thích hiện tượng cộng hưởng từ củatất cả các hạt nhân trong mẫu Khi xung bị gián đoạn, các hạt nhân kích thích bắt đầu bị mấtnăng lượng và trở về trạng thái năng lượng cơ bản của chúng Khi hệ gồm nhiều hạt nhân khác

nhau, nhiều tần số khác nhau nên năng lượng bức xạ được phát ra đồng thời Tín hiệu này đượcgọi là tín hiệu phân rã cảm ứng tự do (free induction decay- FID) sẽ được ghi nhận để tạo thànhphổ công hưởng từ hạt nhân.

Do biến đổi Fourier có tính chất tuyến tính và khả nghịch nên từ hàm vị trí x(t) ban đầu ta

có thể dễ dàng suy ra hàm sóng Fourier X(jω) tương ứng và ngược lại, từ đó có thể tách từngω) tương ứng và ngược lại, từ đó có thể tách từng) tương ứng và ngược lại, từ đó có thể tách từngtần số cộng hưởng nhất định

Các hiệu ứng và thông số đặc trưng

Hiệu ứng nghịch từ và độ chuyển dịch hóa họcCác điện tử xung quang hạt nhân khi chuyển động tạo thành một từ trường riêng ngượcchiều với từ ngoài, do đó làm giảm tác động của từ trường ngoài đến hạt nhân nguyên tử Lớp

vỏ điện tử càng dày đặc thì từ trường riêng ngược chiều với từ trường ngoài càng lớn, hiệu ứngnày được thể hiện thông qua hằng số chắn Sự xuất hiện của các nhóm thế với độ âm điện khácnhau cũng ảnh hưởng nhiều đến hằng số chắn của hạt nhân, các proton nằm trong các nhóm cónguyên tử gây hiệu ứng –I (Cl, Br, I, NO2…) sẽ có hằng số chắn nhỏ, trái lại khi các nhómnguyên tử gây hiệu ứng +I (CH3, C2H5…) sẽ có hằng số chắn lớn.

Do đó khi đặt nguyên tử vào trong một từ trường ngoài B0 thì từ trường hiệu dụng tác độnglên hạt nhân nguyên tử:

BE = B0 – B’ = B0 – B0σ = B0(1-σ)Trong đó, σ là hằng số chắn đặc trưng cho từng hạt nhân nguyên tử, hằng số chắn tì lệ thuậnvới điện tích, mật độ e bao quanh hạt nhân nhưng tỉ lệ nghịch với khối lượng e

Khi đặt các hạt nhân nguyên tử vào trong một từ trường ngoài, do hiệu ứng chắn khác nhaunên phần năng lượng từ trường tác động lên từng hạt nhân là khác nhau tạo thành từng tần sốcộng hưởng đặc trưng Sự đặc trưng này được thể hiện thông qua một thông số gọi là độ chuyểndịch hóa học:

Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân nguyên tử:

Độ âm điện của nhóm thế gắn trực tiếp vào hạt nhân nguyên tử: nhóm thế có độ âm điệncàng lớn thì độ chuyển dịch hóa học của hạt nhân nguyên tử càng lớn

Hiệu ứng nghịch từ: hằng số chắn của hạt nhân càng nhỏ thì độ chuyển dịch hóa học củahạt nhân đó càng lớn

Hiệu ứng dung môi: đặc biệt là sự tương tác của các dung môi chứa proton khi xác địnhNMR 1H Dung môi không chỉ ảnh hưởng đến độ chuyển dịch hóa học mà còn ảnh hưởng đếnhình dáng của peak

Hiệu ứng cảm và cộng hưởng: ảnh hưởng đến mật độ electron do đó làm thay đổi hệ sốchắn trong từng trường hợp.

Hiệu ứng do sự quay bị giới hạn của các spin: sự quay tự do của các liên kết đơn thườngkhông bị giới hạn do đó tín hiệu trên phổ sẽ thể hiện  trung bình, tuy nhiên sự uay tự do củacác liên kết bội thường bị giới hạn do đó sẽ hình thành các giá trị  khác nhau Dựa vào tínhchất này, từ giá trị  có thể cho biết nhiều thông tin về cấu trúc của chất

Tương tác spin- spinVới độ chuyển dịch hóa học khác nhau của H trong mỗi nhóm -CH3, - CH2, -OH, phổNMR 1H của phân tử CH3CH2OH theo lý thuyết sẽ bao gồm 3 peak tín hiệu đặc trưng tuynhiên trên thực tế phổ thu được có sự bội đỉnh ở các nhóm: -CH3 có 3 đỉnh, -CH2 có 4 đỉnh và–OH có 3 đỉnh (ethanol khan tuyệt đối hoặc 1 đỉnh đối với ethanol thường).

Nguyên nhân của sự xuất hiện bội đỉnh này là do sự tương tác của các proton nằm cạnhnhau Mỗi proton mang điện tích khi chuyển động sẽ sinh ra hai từ trường phụ ngược chiềunhau tác dụng lên các proton kế cạnh làm phân tách mức năng lượng của từ trường ngoài B0 tácdụng lên proton đó, kết quả sinh ra tín hiệu bội, sự phân tách mức năng lượng thế nào tuỳ thuộcvào số lượng proton ở mỗi nhóm và số proton kế cận Số bội đỉnh của một nhóm phụ thuộc vào

số lượng proton của nhóm bên cạnh mà nó tương tác

Độ bội M = (số proton nhóm bên cạnh) + 1

Hiện tượng bội đỉnh này được gọi chung là tương tác spin – spin của các proton, được thểhiện thông qua hằng số tương tác spin- spin J (hằng số ghép cặp) Hằng số J là khoảng cáchgiữa 2 đỉnh liền kề nhau của cùng 1 nhóm, được đo bằng Hz Tương tự như độ chuyển dịch hóahọc, hằng số J cũng là một đại lượng quan trọng cung cấp nhiều thông tin về cấu trúc của chấtnghiên cứu.

Đồng thời, cường độ tín hiệu mỗi đỉnh trong nhóm cũng không ngẫu nhiên mà tuân theođịnh luật tam giác Pascal Các nhóm tín hiệu có độ bội lớn thì cường độ tín hiệu của đỉnh giữalớn hơn đỉnh ngoài rất nhiều lần vì thế đối với nhóm 6, 7 đỉnh trở lên thì phổ thực tế có thể có

số đỉnh thực ít hơn Ví dụ nhóm 7 đỉnh thường chỉ xuất hiện 5 đỉnh trong thực tế

Diện tích giới hạn bởi đường cong phổ tỷ lệ với số proton của mỗi nhóm: ví dụ, phân tửtoluen C6H5 cho hai nhóm tín hiệu ứng với nhóm phenyl (chứa 5H) và nhóm metyl (chứa 3H)thì trong phổ NMR- 1H:

S(C6H5) : S(CH3) = 5 : 3Tuy nhiên, việc xác định diện tích này khó chính xác nên người ta thường sử dụng kỹ thuậttích phân tín hiệu, vẽ các đường cong bậc thang dựa trên cơ sở chiều cao của các bậc thang trênmỗi nhóm tín hiệu cộng hưởng tỷ lệ với số proton của mỗi nhóm Tuy nhiên cầu lưu ý rằng, độcao của đường tích phân không phải lúc nào cũng cho chính xác số lượng H, mà chỉ cho sốlượng tương đối của mỗi loại H Ví dụ phổ NMR 1H của một chất có công thức phân tửC8H10O2S như sau:

Tổng diện tích đường tích phân thu được: 15.2 + 22.8 + 36.2 = 74.2 mm

Có tổng công 10H trong phân tử nên mỗi H chiếm khoảng 74.2/10 = 7.42 mm

Từ đó suy ra số lượng proton trong mỗi peak:

Số H của peak 1: 22.8/7.42 = 3.08  3H

Số H của peak 2: 15.2/7.42 = 2.05  2H

Số H của peak 3: 36.2/7.42 = 4.89  5HCác hạt nhân của cùng loại hạt nhân và có độ chuyển dịch hoá học như nhau gọi là các hạt

nhân tương đương và được ký hiệu bằng một loại chữ cái, số lượng của các hạt nhân này đượcghi bằng chữ số ở phía dưới bên phải ví dụ: A2B, A2X… Sự đánh giá các phổ phụ thuộc vào tỷ

lệ của hiệu số độ chuyển dịch hoá học và hằng số tương tác spin- spin thông qua hệ số bậc phổK:

Phổ bậc 1: K > 6 có thể áp dụng quy tắt tối đa vạch và tỉ lệ chiều cao các vạch trongcùng nhóm theo quy tắt tam giác Pascal

Phổ bậc cao: các trường hợp còn lại, thường không thể phân tích trực tiếp mà thông quacác công cụ biến đổi và tính toán thực nghiệm

Cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều

Các kỹ thuật phân tích trong phổ NMR rất đa đạng, tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu mà

có thể áp dụng, kết hợp các kỹ thuật NMR khác nhau Sự khác nhau trong khả năng phân tíchcủa NMR một chiều và NMR đa chiều có thể được thể hiện trong sơ đồ sau:

Các kỹ thuật NMR đa chiều sử dụng phương pháp biến đổi Fourier để ghép phổ NMR của