Anthocyanin là hợp chất gồm có gốc aglycon có màu (được gọi là anthocyanidin hay anthocyanidol) kết hợp với các glucoside có gốc đường glucose, galactose… Anthocyanin hòa tan trong nước còn anthocyanidin thì không tan trong nước. Anthocyanin tham gia vào việc tạo nên đa sắc màu cho hoa quả. Đồng thời cùng với chất tạo màu khác như clorophin, carotenoid để tạo cho hoa quả có cường độ màu khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng và số đồng phân của chúng.
Mục lục Tổng quan khoai lang tím Khoai lang (danh pháp hai phần: Ipomoea batatas) loài nông nghiệp với rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, nguồn cung cấp rau ăn củ quan trọng, sử dụng vai trò rau lẫnlương thực Trong số quốc gia khu vực nhiệt đới, khoai lang coi loại lương thực chủ yếu Cùng với tinh bột, củ khoai lang chứa nhiều xơ tiêu hóa, vitamin A, vitamin C vitamin B6 Lưu ý tới hàm lượng xơ, cacbohydrat phức, protein, vitamin A C, sắt, canxi khoai lang đứng cao giá trị dinh dưỡng Bảng 1: Hàm lượng dinh dưỡng khoai lang tươi (tính 100g phần ăn được) Độ ẩm (%) Năng lượng (kcal) Protein (g) Lipid (g) Total carbonhydrate (g) Chất xơ (g) Ca (mg) P (mg) Fe (mg) 70 111 1,5 0,3 26,1 3.9 32 39 0,7 Khoai lang gồm có nhiều loại khác nhau, màu sắc thay đổi từ vỏ khoai đến thịt củ khoai từ màu trắng sữa đến màu vàng, cam, hồng màu tím Từ dẫn tới thành phần dinh dưỡng hóa học khác loại khoai lang Bảng 2: Hàm lượng dinh dưỡng loại khoai lang Thành phần dinh Khoai lang Khoai lang Khoai lang Khoai lang dưỡng Tinh bột (%) Protein (%) Chất béo (%) Chất xơ (%) Anthocyanin (mg/g tím 68,6 6,41 0,72 2,35 đỏ 60,1 6,32 0,76 2,21 vàng 70,2 4,86 0,64 1,90 trắng 71,4 6,53 0,56 1,85 6,23 2,56 1,32 - 54,3 25,7 17,8 9,6 81,2 50,4 43,4 55,2 dw) Tổng phenolic (mg/g dw) Total Antioxidant Capacity (mg/g dw) Màu sắc đậm khoai lang tím tạo thành từ phenolic sắc tố anthocyanin Cũng lý mà khoai lang tím thu hút nhiều ý từ cộng đồng Khoai lang tím hay duợc gọi Ayamurasaki, loại khoai lang duợc dua vào sản xuất viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Nhật Bản có tên Okinawa Khoai lang tím duợc trồng thành công lần dầu tiên Nhật Bản nam 1995 Trong nam gần dây, loại khoai lang dã duợc trồng phổ biến nhiều quốc gia dặc biệt quốc gia vùng khí hậu nhiệt dới Là trồng trồng toàn giới với suất cao, khoai lang tím giàu carbohydrate chất xơ Ở nước ta khoai lang tím chủ yếu trồng tỉnh miền Tây đem lại sản lượng lớn giúp thu nhập ổn định cho nông dân tỉnh Vĩnh Long, Đồng Tháp tỉnh trọng điểm trồng khoai lang tím, riêng huyện Bình Tân có 14400 rau màu diện tích trồng khoai lang tím chiếm 7800 ha, sản lượng dự kiền 257000 cho năm 2014 Ngoài ra, khoai lang tím có uu diểm vuợt trội có chứa hàm luợng cao chất chống oxi hóa có tác dụng ngan chặn phát triển tế bào ung thu, chống lão hóa, bao gồm hợp chất nhu: phenol, anthocyanin, carotenoid Anthocianin khoai lang tím chủ yếu tồn mono- hình thức di-acylated, nên thể ổn định tốt (khả nang chịu duợc nhiệt dộ cao mà không bị màu cung nhu bị biến dổi) so với sắc tố dâu tây, bắp cải đỏ, tía tô loại khác Đối với chế biến thực phẩm, ổn định cho phép sản phẩm màu có chất lượng phù hợp thời hạn sử dụng Như vậy, khoai lang tím nguồn nguyên liệu cung ứng anthocyanin dồi Anthocyanin 2.1 Tổng quan anthocyanin Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, anthocyanin kết hợp Anthos – nghĩa hoa Kysanesos – nghĩa màu xanh Tuy nhiên màu xanh, anthocyanin mang đến nhiều màu sắc hồng, đỏ, cam gam màu trung gian Các anthocyanin hết nhóm đường gọi anthocyanidin hay aglycon Anthocyanin hợp chất gồm có gốc aglycon có màu (được gọi anthocyanidin hay anthocyanidol) kết hợp với glucoside có gốc đường glucose, galactose… Anthocyanin hòa tan nước anthocyanidin không tan nước Anthocyanin tham gia vào việc tạo nên đa sắc màu cho hoa Đồng thời với chất tạo màu khác clorophin, carotenoid để tạo cho hoa có cường độ màu khác tùy thuộc vào hàm lượng số đồng phân chúng Hình 1: Cấu trúc anthocyanidin anthocyanin Các anthocyanidin anthocyanin khác gốc R khác Bảng 3: Xác định cấu trúc anthocyanin Anthocyanin tinh khiết dạng tinh thể vô định hình hợp chất phân cực nên tan tốt dung môi phân cực Màu sắc anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào pH, chất màu có mặt nhiều yếu tố khác, nhiên màu sắc anthocyanin thay đổi mạnh phụ thuộc vào pH môi trường Thông thường pH < anthocyanin có màu đỏ, pH > có màu xanh Ở pH = anthocyanin thường dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, pH = - chúng chuyển dạng bazơ cacbinol hay bazơ chalcon không màu, pH = - lại dạng bazơ quinoidal anhydro màu xanh Hình 2: Anthcyanin thay đổi màu sắc theo pH Anthocyanin có bước sóng hấp thụ miền nhìn thấy, khả hấp thụ cực đại bước sóng 510 - 540nm Độ hấp thụ yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin lớn độ hấp thụ mạnh Ngoài tác dụng chất màu thiên nhiên sử dụng an toàn thực phẩm, tạo nhiều màu sắc hấp dẫn cho sản phẩm, anthocyanin hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả chống oxy hóa cao nên sử dụng để chống lão hóa, chống oxy hóa sản phẩm thực phẩm, hạn chế suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế phát triển tế bào ung thư; tác dụng chống tia phóng xạ Những đặc tính quí báu anthocyanin mà chất màu hóa học, chất màu khác hình thành trình gia công kỹ thuật mở hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào đời sống hàng ngày, đặc biệt công nghệ chế biến thực phẩm Anthocyanin phân bố rộng rãi tự nhiên, có mặt 27 họ thực vật, thường tạo màu đỏ, tím, xanh thẫm nhiều loại rau, hoa, hoa dâm bụt, rễ củ cải đỏ, tía tô, dâu tây bắp cải tím Anthocyanin tích lũy chủ yếu tế bào biểu bì hạ biểu bì thực vật, tập trung không bào túi gọi anthocyanoplast Nhìn chung, hàm lượng anthocyanin phần lớn rau dao động từ 0,1 đến 1,11% hàm lượng chất khô Thực vật chứa anthocyanin đồng thời chứa flavonoid Trong rau hàm lượng anthocyanin liên quan đến độ đậm màu sắc quả, đậm hàm lượng anthocyanin cao Anthocyanin thực vật chất mà hỗn hợp Tỷ lệ anthocyanin loại rau phụ thuộc vào loài, giống 2.2 Anthocyanin khoai lang tím Hàm lượng anthocyanin chiếm khoảng 14 mg/g chất khô khoai lang tím Anthocyanin có mặt khoai lang tím thành phần tạo màu sắc khác biệt nó, có 12 thành phần đơn chất xác định nghiên cứu Heon woong Kim cộng cyanidin - 3,5 - diglucoside thành phần chủ yếu Mười hai đơn chất xếp hai nhóm cyanidin peonidin Bảng 4: Thành phần anthocyanin khoai lang tím Mười hai đơn chất xác định có mang thành phần glucose sophorose liên kết anthocyanin Mười đơn chất trừ cyaniding sophoroside5-glucoside có mối liên kết với chất phenolic caffeic acid, ferulic acid, phydroxybenzoic acid biểu diễn Hình Hình 3: Cấu tạo cyanidin (R1 = H); peonidin (R1 = CH3) 3-sophoroside-5- glucoside (a), caffeic acid (b), ferulic acid (c), and p-hydrobenzoic acid (d) non-, mono-, diacylated cyanidin đơn chất mono- di-acylated peonidin đơn chất có tỷ lệ 67% 33% tổng lượng anthocyanin khoai lang tím Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng trình gia nhiệt đến hàm lượng anthocyanin khoai lang tím cho thấy trình nướng không ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin nấu áp suất cao, hấp, hay sử dụng lò vi sóng làm giảm hàm lượng anthocyanin 8–16% lượng ban đầu Đây thực tế giảm không nhiều so với hàm lượng anthocyanin có khoai lang tím (1,4% khối lượng khô), so sánh với dâu (350 mg/kg) bắp cải (250 mg/kg) Thông thường, anthocyanin khoai lang có nhóm đề cập cyanindin peonidin, dựa theo thành phần anthocyanin phân loại khoai lang thành hai loại loại chứa nhiều cyanidin (tỷ lệ peonidin/cyanindin (pn/cy) 1) Sự khác biệt dẫn đến đặc tính khác màu sắc khoai lang số tính chất anthocyanin Với loại khoai lang chứa nhiều peonidin (pn/cy > 1) thường thể màu từ hồng đến đỏ trạng thái tươi thịt củ khoai Như vậy, hàm lượng cyanidin cao màu thịt củ dần chuyển sang tím tím đậm Cyanidin có chất chứa nhiều nhóm –OH nên có đặc tính kháng oxy hóa mạnh nhóm chất peonidin Dưới tác dụng nhiệt có bẻ gãy mối liên kết hợp chất anthocyanin nên hàm lượng giảm theo thời gian xử lý Nhưng ảnh hưởng phụ thuộc vào chất nhóm chất anthocyanin, khác biệt nhóm chức liên kết chẳng hạn như, mono-acylated anthocyanin có liên kết với p-hydroxybenzoic acid cho khả bền cao nhóm chất anthocyanin khoai lang tím nghiên cứu, liên kết với ferulic acid caffeic acid Mono-acylated anthocyanins thường có độ bền nhiệt cao so với di- non-acylated Trong số đó, cyanidin 3-p- hydroxybenzoylsophoroside-5-glucoside có tính bền tác dụng nhiệt Đó lý mono-acylated cyanidin-predominated anthocyanins khoai lang tím nghiên cứu có khả bền xử lý nhiệt Mặt khác tác dụng nhiệt giúp giải phóng anthocyanin dạng tiền chất liên kết với thành phần khác, nên có thay đổi số thành phần anthocyanin sau trình xử lý nhiệt cyanidin 3-p-hydroxybenzoylsophoroside-5- peonidin 3-phydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo màu anthocyanin Ảnh hưởng dung môi: dung môi protic anthocyanin thể màu đỏ ion flavylium, dung môi aprotic anthocyanin thể màu vàng đặc trưng chalcone Điều giải thích thông qua chế hấp thu màu dạng monomer dimer ion flavylium (Ito cộng sự, 2002) Nghiên cứu cho thấy nước có vai trò quan trọng trình dimer hóa ion flavylium từ ảnh hưởng nhiều đến khả tạo màu anthocyanin Ảnh hưởng pH đến khả tạo màu anthocyanin: màu sắc cưởng độ màu anthocyanin phụ thuộc chặt chẽ vào cân trạng thái anthocyanin cation flavylium, chalcone base quinoidal Khi pH tăng cân chuyển dịch theo hướng tạo thành base quinoidal theo phản ứng de- hydro hóa, môi trường acid anthocyanin tồn chủ yếu dạng ion flavylium nhờ phản ứng tách nước từ carbinol Ảnh hưởng gốc hydroxyl, methoxyl vị trí liên kết đến khả tạo màu anthocyanin: Anthocyanin bị methoxyl hóa hydro hóa: bền pH kiềm, thể màu xanh đặc trưng Anthocyanin có nhiều nhóm –OH: không bền pH kiềm, thể màu đỏ cation flavylium điều kiện bình thường Acyl hóa: trình acyl hóa làm tăng độ bền pH giảm khả hydrate hóa flavylium, trường hợp anthocyanin thường thể màu vàng Glycoside hóa: làm tăng độ âm điện cation flavylium, phản ứng hydrate hóa deproton hóa dễ dàng xảy ra, cân chuyển dịch theo hướng tạo thành base quinoidal Vị trí glycoside: trình glycoside hóa C3, C5 bền so với C7 Ảnh hưởng tẩy màu SO2 đến anthocyanin: với khả khử tính nhân SO2 nên tác dụng làm màu dung dịch anthocyanin Ảnh hưởng polyphenol oxidase: PPO oxy hóa anthocyanin môi trường có mặt caffeic acid, chlorogenic acid gallic acid dự tương tác anthocyainin với oquinnon tạo thành từ trình oxy hóa sơ cấp caffeic acid, chlorogenic acid gallic acid Sản phẩm tạo thành có màu nâu, làm giảm đáng kể giá trị cảm quan nguyên liệu/ sản phẩm Do trình khử quinnon ức chế quá trình oxy hóa anthocyanin PPO Ảnh hưởng chiều vitamin C đến trình oxy hóa anthocyanin: môi trường có PPO vitamin C ức chế oxy hóa anthocyanin, có mặt vitamin C O2 vitamin C bị oxy hóa mà thúc đẩy oxy hóa anthocyanin Ảnh hưởng chất đồng tạo màu- copigment: Phản ứng đồng tạo màu: tương tác hợp chất không màu anthocyanin làm tăng cường độ độ bền màu anthocyanin Chất đồng tạo màu thường gặp với anthocyanin là: catechin, epicatechin, procyanidin B2, caffeic acid, pcoumaric acid, chlorogenic acid, myricitrin quercitin Bản chất tương tác: tuân theo chế chuyển điện tích chất đồng tạo màu cation flavylium thông qua việc ức chế ức chế phản ứng hydrate hóa deproton hóa từ làm bền cation flavylium Phản ứng đồng tạo màu xuât hiệu ứng bathochrome chuyển cực đại hấp thu sang vùng có bước sóng cao hiệu ứng hyperchrome tăng cường độ hấp thu anthocyanin Hình thành hệ liên kết e π-π: góp phần quan trọng việc ổn định tăng cường độ màu phức chất anthocyanin- đồng tao màu Quá trình đồng tạo màu tỉ lệ thuận với số gốc –OMe số liên kết glucoside phân tử anthocyanin Một điều đáng lưu ý anthocyanin tannin rượu sản phẩm lên men tương tác đồng tạo màu để ổn định màu Tuy nhiên, trình đồng tạo màu lại khả ổn định màu sắc môi trường có nhiệt độ cao, ánh sáng, oxy UV Ảnh hưởng ion kim loại: kim loại Al, Fe, Cu, Sn, Mo có khả tạo phức với vòng thơm B có nhóm –OH phân tử anthocyanin (Boulton, 2001; Starr & Francis, 1973; Hale cộng sự, 2001) Sự tương tác giúp ổn định độ bền quinoidal base trường hợp liên kết với ion kim loại anthocyanin thường thể màu xanh bền base quinoidal Sự hình thành phức pyranoanthocyanin Pyranoanthocyanin dạng phức chất anthocyanin hợp chất phân tử lượng thấp sản phẩm lên men đặc trưng, 4-vinylphenol, pyruvic acid flavonols chất thường tạo phức với anthocyanin Bản chất liên kết: đóng vòng nội phân tử C4, -OH C5 chất liên kết tạo 10 ε (L.mol-1.cm-1) gọi hệ số tắt phân tử Tại bước sóng, chất có hệ số hấp thu phân tử khác ε xác định thực nghiệm - Ưu điểm Phạm vi ứng dụng rộng Có độ nhạy cao, xác định chất có hàm lượng nhỏ (dạng vết) Thao tác tương đối đơn giản, tiến hành nhanh chóng Có thể tiến hành định lượng chất có mặt chất khác cách sử dụng mẫu đối - chứng dung dịch chuẩn Nhược điểm Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền, dễ hỏng Hệ thống quang đòi hỏi độ ổn định cao nên tiến hành phân tích trường Các thiết bị quang cần bảo quản điều kiện nghiêm ngặt: tránh ẩm, nhiệt độ ổn định… Thiết bị Máy quang phổ chùm tia phải đo lần : lần với mẫu chuẩn (chỉ chứa dung môi) lần với mẫu cần đo Kết lần đo hai không đổi Kết phân tích độ xác cao 37 Máy quang phổ chùm tia ánh sáng tách làm chùm : qua mẫu chuẩn qua mẫu cần đo Sau đó, chùm ánh sáng vào máy thu để so sánh cường độ ánh sáng Kết phân tích có độ xác cao tính độ hấp thu A 3.2.1 Vi sai pH xác định tổng anthocyanin Dựa nguyên tắc : anthocyanin thay đổi màu theo pH Tại pH=1.0 anthocyanin tồn dạng oxonium flavium có độ hấp thu cực đại, pH 4,5 chúng lại dạng carbinol không màu Đo mật độ quang mẫu pH=1,0 pH= 4,5 bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ bước sóng 700nm Dựa công thức định luật Lambert-Beer : lg lg Trong đó: I0 = ε l.C I (1) I0 I đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần di qua dung dịch I : cường độ ánh sáng sau di qua dung dịch I0 : cường độ ánh sáng di vào dung dịch C : nồng độ chất nghiên cứu (mol/l) l : chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng qua hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1 Hàm lượng sắc tố anthocyanin đơn tử theo công thức : 38 a= A.M HSPL.V ε l (2) Trong đó: A mật độ quang, A= (Aλmax,pH=1.0 – A700nm,pH=1.0) - (Aλmax,pH=4.5 – A700nm,pH=4.5) Aλmax, A700nm : độ hấp thu bước sóng cực đại 700nm pH 1,0 4,5 a : lượng anthocyanin (mg/l) M : khối lượng phân tử anthocyanin (g/mol) HSPL : hệ số pha loãng V : thể tích dịch chiết (l) l : chiều dày cuvet (cm) ε : hệ số hấp thụ phân tử (mol-1cm-1) Từ tính phần trăm hàm lượng anthocyanin toàn phần %anthocyanin = a ×100% −2 m.(100 − w).10 (3) Trong đó: a lượng anthocyanin tính theo công thức (2) m : khối lượng nguyên liệu ban đầu (g) w : độ ẩm nguyên liệu (%) Xác định bước sóng cực đại Các chất không hấp thụ xạ mà có hấp thụ ánh sáng chọn lọc Miền xạ điện từ mà chất nghiên cứu hấp thụ mạnh ứng với lượng bước chuyển diện từ Để tìm lượng bước chuyển điện từ ta nghiên cứu phụ thuộc mật độ quang dung dịch theo bước sóng λ, tức đo A dung dịch cần nghiên cứu_anthocyanin, với tia xạ diện từ có bước sóng λ khác nhau, sau dó lập đồ thụ A-λ, đồ thị hâp thụ Đồ thị có dang đường cong Gauss Cực đại Amax ứng với λmax, gọi cực đại hấp thụ Khi đo A λmax cho ta kết phân tích có độ nhạy độ xác tốt Bởi tiến hành phân tích phương pháp đo quang phổ ta chọn mật độ quang λ= λ max phổ hấp thụ Bước thực Lấy 5ml dung dịch mẫu pha loang với đệm pH=1,0 bình định mức 25 ml, quét phổ hấp thụ vùng khả kiến (λ = 450-720nm) má quang phổ UV-VIS Và qua số nghiên cứu, ta thấy phổ hấp thụ dịch chiết khoai lang tím nằm khoảng bước sóng 510-540 nm, cho thấy dịch chiết khoai lang tím giàu anthocyanin Và bước sóng hấp thụ cực đại anthocyanins khoai lang tím xác định 524 nm 3.2.2 Xác định hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin DPPH gốc tự bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cự đại hấp thụ 517 nm Các chất có khả kháng oxi hóa trung hòa gốc DPPH cách cho hydrogen, làm giảm độ 39 hấp thụ bước sóng cực đại màu dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ tìm sang vàng nhạt Hoạt tính loại bỏ gốc DPPH tự xác định phương pháp Shimada (1992) Dung dịch DPPH chuẩn bị nồng độ 0,1mM ethanol 100% LẤy 1ml dung dịch mẫu (được chuẩn bị nồng độ khác từ 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 mg/ml) cho vào ml dung dịch DPPH Hỗn hợp ủ 25ºC 30 phút Độ hấp thu đo bước sóng λ=517nm máy so màu UV-VIS Tính toán % gốc DPPH tự loại sau : Hoạt tính loại bỏ gốc tự do= [1-(A1-A2)/A0] x 100% Trong : A0 độ hấp thụ dung dịch mẫu A1 độ hấp thụ dung dịch chứa mẫu A2 độ hấp thụ dung dịch không chứa DPPH Kết báo cáo giá trị IC50 nồng độ dịch chiết khử 50% gốc tự DPPH điều kiện xác định Giá trị IC50 thấp hoạt tính khử gốc tự DPPH cao 3.3 Hệ thống LC – MS (Liquid chromatography – Mass spectrometry system) Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS) phương pháp nghiên cứu chất cách đo, phân tích xác khối lượng phân tử chất dựa chuyển động ion nguyên tử hay ion phân tử điện trường từ trường định Tỉ số khối lượng điện tích (m/z) có ảnh hưởng lớn chuyển động ion Nếu biết điện tích ion ta dễ dàng xác định khối lượng ion Trong nghiên cứu khối phổ chất nào, trước tiên phải chuyển sang trạng thái bay hơi, sau ion hoá phương pháp thích hợp Các ion tạo thành đưa vào nghiên cứu phân tích khối máy khối phổ Tùy theo loại điện tích ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin ion nghiên cứu nên dùng phổ biến Tuy nhiên, phát triển kỹ thuật cho phép tích hợp hai kiểu quét thành nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho nhà nghiên cứu, nhiên thường độ nhạy không cao kiểu quét riêng lẻ Trong nhiều năm, nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) phải đối mặt với nhiều khó khăn việc tìm cách giải tương thích hệ thống sắc ký lỏng đầu dò khối phổ Nguyên nhân trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, chất khảo sát phải trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; hệ thống LC lại hoạt động áp suất cao với lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, chất phân tích thể lỏng 40 Để khắc phục khó khăn trên, cần phải có kỹ thuật trung gian gọi giao diện Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… nghiên cứu ứng dụng, cuối thập nhiên 80, có đột phá thật với kỹ thuật ion hóa áp suất khí (Atmospheric Pressure Ionization – API) Ưu điểm bật API khả hình thành ion áp suất khí buồng ion hóa Điều khác biệt với kiểu ion hóa sử dụng trước cho LC/MS bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay tia nhiệt (thermospray – TS) đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi API ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc hợp chất cần phân tích nhờ thu khối phổ ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta điều khiển trình phá vỡ ion phân tử để tạo ion tùy theo yêu cầu phân tích Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API LC/MS: • Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI) • Ion hóa hóa học áp suất khí (atmospheric pressure chemical ionization – APCI) • Ion hóa photon áp suất khí (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI) Trong đó, hai kỹ thuật APCI ESI, đặc biệt ESI sử dụng nhiều 41 Hình 4: Ứng dụng hệ thống LC/MS 3.3.1 Các loại đầu dò khối phổ Hiện nay, có bốn kiểu đầu dò khối phổ sử dụng bao gồm: • Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap, IT) • Đầu dò khối phổ cộng hưởng cyclotron sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS) • Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time-of-Flight, TOF) • Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole) Chúng khác thiết kế thao tác, với ưu nhược điểm riêng Đối với loại bẫy ion, ion trước hết bắt “mắc bẫy” khoảng thời gian định phân tích MS MS/MS Loại máy sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, chúng có độ xác không cao có số lượng hạn chế ion tích lũy vào tâm điểm trước tích điện không gian, phản ánh sai lệch phân bố phép đo Người ta tiến hành cải tiến kỹ thuật phát triển bẫy ion “tuyến tính” “hai chiều” ion tập hợp thể tích hình ống lớn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải độ xác FT-MS chất loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt ion độ chân không sâu từ trường cao Do cải tiến kết hợp hai loại máy nên FT-MS có độ nhạy, độ xác phân giải cao Tuy nhiên, vận hành phức tạp giá thành cao nên chúng sử dụng phân tích dư lượng Đối với đầu dò khối phổ thời gian bay, tất ion đơn điện tích chịu sai biệt V đạt lượng chuyển hóa eV (electron volt) Vì vậy, ion có khối lượng lớn có vận tốc nhỏ nên nhiều thời gian để bay qua quãng đường dài ống từ trường (field-free flight tube) Các ion, sau tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi chúng tách riêng tùy theo giá trị m/z chúng, tập trung phận thu nhận tín hiệu Do thời gian đến đích ion cách ngắn, 10-7 giây, nên máy cần có hệ thống điện tử cực nhạy để phân biệt ion 42 Đầu dò tứ cực (một ba tứ cực) có độ nhạy cao phân tích định lượng chất biết, tạo nhiều phân mảnh chế độ MS/MS, làm kiểu đo phân tử trung hòa (neutral loss), thích hợp cho phân tích vi lượng chất biết trước cấu trúc Tuy nhiên, đầu dò tứ cực khó giải thích chế phân mảnh MS/MS Tùy theo mục đích, nhà nghiên cứu chọn kỹ thuật ứng với máy khối phổ thích hợp Ngoài ra, để phát huy ưu điểm khắc phục hạn chế loại đầu dò, người ta ghép nối kết hợp kỹ thuật với nhau, ví dụ hệ thống kết hợp bẫy ion tứ cực API QTRAP4000 hay QTRAP5500 hãng Appliedbiosystems, đó, tứ cực thứ ba hệ ba tứ cực thay bẫy ion 3.3.2 Nguồn ion hóa đầu dò khôi phổ Ion hóa tia điện (ESI) ESI kỹ thuật ion hóa ứng dụng cho hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn ESI có khả tạo thành ion đa điện tích (dương âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), xem kỹ thuật ion hóa êm dịu APCI, thích hợp cho phân tích hợp chất sinh học protein, peptide, nucleotide… polyme công nghiệp polyethylen glycol Trong ESI, ion hình thành sau: 43 Hình 5: Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Được bắt nguồn từ hệ thống sắc ký lỏng, đầu ống dẫn mao quản, ảnh hưởng điện cao hỗ trợ khí mang, mẫu phun thành hạt sương nhỏ mang tích điện bề mặt Khí xung quanh giọt tạo nhiệt làm bay dung môi khỏi giọt sương, đó, mật độ điện tích bề mặt hạt sương gia tăng Mật độ điện tích tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ hạt sương phân chia thành hạt nhỏ lực đẩy lúc lớn sức căng bề mặt Quá trình lặp lại nhiều lần để hình thành hạt nhỏ Từ hạt nhỏ mang điện tích cao này, ion phân tích chuyển thành thể khí lực đẩy tĩnh điện sau vào phân tích khối Trong kỹ thuật ESI, phân tử thiết phải biến thành chất điện ly, tan dung dịch dùng để phun sương Điều phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa chất điện ly pH dung dịch Các dung môi phù hợp để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol,… Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) APCI kỹ thuật ion hóa thường sử dụng để phân tích hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay Trong APCI, ion đươc hình thành sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan pha động, sau khỏi cột sắc ký, cho ngang qua ống mao quản đốt nóng Khi khỏi ống, nhờ khí N¬2, dung dịch phun thành dạng sương từ đầu nguồn APCI Các giọt sương nhỏ dòng khí dẫn đến ống thạch anh đun nóng, gọi buồng dung môi hóa khí Hợp chất theo luồng khí nóng khỏi ống để đến vùng có áp suất khí quyển, nơi xảy ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điện corona, có trao đổi proton để biến thành ion dương (M + H)+ trao đổi electron proton để biến thành ion âm (M – H)- Sau đó, ion đưa vào phân tích khối 44 Hì nh 6: Sơ đồ tạo ion dương nguồn APCI Ion hóa bằng photon áp suất khí (APPI) Thông thường, hợp chất phân tích thường ion hóa nguồn ESI APCI, nhiên, có số chất không ion hóa tốt hai kỹ thuật này, ví dụ polyaromatic hydrocarbons (PAHs), người ta sử dụng nguồn APPI Kết hợp ưu điểm dòng khí phun thẳng góc với dòng ion, đèn krypton nguồn phát photon có lượng cao đủ để ion hóa nhiều hợp chất hóa học khác 45 Hình 7: Sơ đồ tạo ion dương nguồn APPI Ngoài ba nguồn ion hóa trên, có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization) vận hành, thao tác hai chế độ ion hóa ESI APCI 3.3.3 Scan Một số kỹ thuật ghi phổ đầu dò khối phổ Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò nhận tất mảnh ion khối phổ toàn ion tất chất suốt trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường lựa chọn để khảo sát ion mẹ Selected Ion Monitoring (SIM) 46 Trong chế độ SIM, đầu dò MS ghi nhận tín hiệu số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM cho tín hiệu ion lựa chọn trước đó, dùng để nhận danh hay so sánh với thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường lựa chọn để khảo sát lượng phân mảnh biết ion mẹ Hình 8: liệu thu từ Scan SIM 3.3.4 Ứng dụng hệ thống LC/MS Xác định khối lượng phân tử Hệ thống LC/MS xác định cấu trúc phân tử khối lượng phân tử Những thông tin cho thấy khác biệt phân tử có khối lượng tương tự 47 Hình 9: Sắc ký đồ chuỗi polypeptide tương tự Xác định cấu trúc anthocyanin từ khoai lang tím Từ sắc ký đồ sắc ký lỏng cao áp kết hợp với đầu dò PDA khối phổ xác định 15 hợp chất anthocyanin có khoai lang tím hàm lượng chúng 48 Hình 10: Cấu trúc anthocyanin khoai lang tím xác định hệ thống LC/MS 49 Tài liệu tham khảo [1] Lê Huỳnh Xuân Nhi; Nguyễn Anh Vũ Nghiên cứu quy trình lên men rượu từ khoai lang tím, 2015 [2] Huỳnh Thị Kim Cúc; Phạm Châu Hỳnh; Nguyễn Thị Lan; Trần Khôi Uyên Xác định hàm lượng anthocyanin số nguyên liệu rau phương pháp pH vi sai [3] Basics of LC/MS Agilent Technologies, 2001 [4] Heon Woong Kim Cộng Anthocyanin changes in the Korean purple-fleshed sweet potato, shinzami, as affected by steaming and baking Food Chemistry 130, pp 966 – 972 2012 [5] Araceli Castañeda-Ovando, Ma de Lourdes Pacheco-Hernández, Ma Elena Páez-Hernández, José A Rodríguez, Carlos Andrés Galán-Vidal Chemical studies of anthocyanins: A review Food Chemistry 113, pp 859– 871, 2009 [6] Palmira Ferreira da Silva, Joa˜o C Lima, Adilson A Freitas, Karina Shimizu, Antonio L Mac¸anita, and Frank H Quina Charge-Transfer Complexation as a General Phenomenon in the Copigmentation of Anthocyanins J Phys Chem 109, pp.7329-7338, 2005 50 51