Glucosamine là một aminomonosaccharide, có trọng lượng phân tử 179,17, đó là một thành phần của gần như tất cả các mô của con người, bao gồm cả cartilage. Là thành phần chủ yếu của liên kết O và liên kết N glycosaminoglycans (GAGs), tạo thành mạng lưới của tất cả các mô liên kết. Glucosamine được sản xuất trong cơ thể bằng việc bổ sung các nhóm amin vào glucose; phân tử này sau đó được acetyl hóa tạo acetyl glucosamine. Hyaluronan, keratin sulfate và heparan sulfate được cấu tạo từ một phần của các đơn vị thuộc acetyl glucosamine lặp đi lặp lại. Trong keratan sulfate và heparin sulfate, sulfat được thêm vào ở các vị trí 4 hoặc 6 của glucosamine. Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 88oC, điểm phân hủy 110oC, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform. Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamine. Yếu tố nồng độ acid và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của acid không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamine có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn. Một số phản ứng của glucosamine: -Phản ứng tráng bạc -Phản ứng với Cu(OH)2: sản phẩm có màu xanh -Phản ứng với C6H5CH=O: Phản ứng nhận biết sự có mặt của NH2. Sản phẩm dạng keo sánh màu nâu.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA LÝ TRONG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM ĐIỀU CHẾ GLUCOSAMIN TỪ VỎ TÔM Giảng viên hướng dẫn : TS Phan Ngọc Hòa TP HCM, tháng năm 2016 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa LỜI CÁM ƠN Trước hết nhóm xin cảm ơn giáo viên hướng dẫn TS Phan Ngọc Hòa hỗ trợ cho nhóm suốt trình học tập báo cáo Trong trình tìm hiểu để hoàn thành tiểu luận, nhóm không tránh khỏi sai sót, kính mong cô thông cảm hướng dẫn, nhóm xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, nhóm xin kính gởi lời chúc đến Ban giám hiệu, Ban lãnh đạo khoa Kỹ thuật Hóa học quý thầy cô nhiều sức khỏe thành công công việc GVHD: TS Phan Ngọc Hòa MỤC LỤC GVHD: TS Phan Ngọc Hòa LỜI MỞ ĐẦU Là ngành thủy sản đóng góp phần không nhỏ vào kinh tế quốc dân nước ta Tôm mặt hàng có giá trị quan trọng, trình gia công chế biến lượng phế liệu tôm thải tương đối lớn chiếm khoảng 34 – 45% tổng khối lượng tôm nguyên liệu lượng phế liệu tôm không thu gom xử lý ảnh hưởng đến môi trường gây lãng phí Khi tiến hành thủy phân chitin đến monomer thu, D-glucosamine Glucosamine chất có nhiều ứng dụng tron gy học Nó dống vai trò sinh lý, sinh hóa thể người, tham gia vào chức giải dộc gan thận, chống viêm gan, chống dị ứng chống thiếu oxy máu Glucosamine nguyên liệu chủ yếu dể tổng hợp chất nhờn sụn khớp thể khớp bị tổn thương, nguyên liệu để thể sản xuất chất cần thiết collagen, proteoglycan glucosaminoglycan để hồi phụ sụn khớp tái cung cấp chất nhờn giúp khớp linh động trở lại Ngoài ra, glucosamine có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thương đường ruột dày Ở người già, chức cấu tạo khớp có nhiều thay đổi, tế bào khớp thoái hóa, trở nên ling động Gân dây chằng phận đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên bền bỉ, co dãn, không chịu căng lực dễ bị tổng thương Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, hô nước, rạn nứt với nhiều tính thể canxi làm khớp đau Khớp co duỗi khó khăn màng hoạt dịch mỏng khô dần, nhứng nghiên cứu với nhiều thử ghiệm lâm sàng chứng minh tác dụng điều trị bệnh thoái hóa khớp glucosamine, dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1.1 N-acetyl-glucosamine Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D-(+)glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosamineide; N-acetylchitosamine Công thức phân tử: C8H15O6N Công thức cấu tạo: Phân tử lượng: Macetylglucosamine = 221.21 Điểm nóng chảy: 201 – 210oC Tan nước: 0.1g/ml Glucosamine aminomonosaccharide, có trọng lượng phân tử 179,17, thành phần gần tất mô người, bao gồm cartilage Là thành phần chủ yếu liên kết O liên kết N glycosaminoglycans (GAGs), tạo thành mạng lưới tất mô liên kết Glucosamine sản xuất thể việc bổ sung nhóm amin vào glucose; phân tử sau acetyl hóa tạo acetyl glucosamine Hyaluronan, keratin sulfate heparan sulfate cấu tạo từ phần đơn vị thuộc acetyl glucosamine lặp lặp lại Trong keratan sulfate heparin sulfate, sulfat thêm vào vị trí glucosamine Glucosamine chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 88oC, điểm phân hủy 110oC, tan nước methanol sôi, tan methanol ethanol, không tan ether chloroform Khi thủy phân chitin môi trường axit HCl đậm đặc, mối nối amid osid bị phá hủy thu glucosamine Yếu tố nồng độ acid nhiệt độ thủy phân quan trọng, nồng độ acid không thích hợp trình deacetyl Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa hóa deosid dừng lại giới hạn định, nhiệt độ không thích hợp sản phẩm cuối glucosamine bị giáng hóa thành phân tử đơn giản Một số phản ứng glucosamine: - Phản ứng tráng bạc Phản ứng với Cu(OH)2: sản phẩm có màu xanh Phản ứng với C6H5CH=O: Phản ứng nhận biết có mặt NH Sản phẩm dạng keo sánh màu nâu 1.2 Nguyên liệu 1.2.1 Vỏ tôm Vỏ tôm chia làm lớp là: lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa lớp không bị canxi hóa Lớp biểu bì: có chứa lipid cản trở tác động acid nhiệt độ thường công đoạn khử khoáng acid lớp bên Màu lớp thường vàng nhạt, có chứa polyphenoloxidase bị hóa cứng puinone-tanin Lớp biểu bì liên kết với số màng mỏng bên cản trở hòa tan, môi trường acid đậm đặc có chứa mắt xích paratin mạch thẳng Lớp màu: tính chất lớp có mặt thể hình hạt vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm túi khí không bào Một vài vùng xuất rãnh thẳng đứng có phân nhánh, đường cho canxi thẩm thấu vào Lớp canxi hóa: lớp chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải khắp, chitin trạng thái tạo phức với canxi Lớp không bị canxi hóa: vùng lớp vỏ tạo thành phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm phức chitin-protein bền vững canxi quinine Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Bảng Thành phần hoá học vỏ tôm thẻ chân trắng (theo Phạm Thị Đan Phượng Trang Sĩ Trung, năm 2012) Thành phần hoá học Hàm lượng* (%) Chitin 29.4 ± 1.4 Protein 24.3 ± 1.2 Khoáng 26.5 ± 1.9 Lipid 2.2 ± 0.5 * Tính khối lượng khô tuyệt đối, độ ẩm vỏ tôm 76 ± 1.8% Về thành phần hóa học vỏ tôm: - Protein phế liệu tôm thường tồn dạng Dạng tự tồn phần thịt tôm từ số tôm bị biến đổi vứt lẫn vào phế liệu phần đầu thịt sót lại đầu nội tạng tôm Dạng phức tạp: dạng protein không hòa tan thường liên kết với chitin, canxi cacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo thành proteincarotenoit… phần thống định tính bền vững - vỏ tôm Chitin: tồn dạng liên kết với liên kết đồng hóa trị với protein dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với hợp chất khoáng hợp chất hữu - khác gây khó khăn việc tách chiết chúng Khoáng: chủ yếu muối canxi cacbonat, hàm lượng canxi phosphat không nhiều trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan - HCl gây khó khăn cho trình khử khoáng Sắc tố vỏ tôm chủ yếu astaxanthin Astaxanthin liên kết với phân tử protein tạo thành phức carotenoprotein hấp thụ ánh sáng λmax = 628nm, tạo nên màu xanh đặc trưng Dưới tác dụng nhiệt, liên kết bị phá hủy giải phóng astaxanthin trở lại dạng tự hấp thu mạnh xạ vùng λ = 470÷510nm có - màu đỏ cam Enzyme nội tạng đầu tôm, mai ghẹ vi sinh vật thường trú vỏ tôm nguyên liệu Ngoài ra, phế liệu có thành phần khác như: nước, lipid Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa 1.2.2 Chitin Chitin polime hữu phổ biến tự nhiên sau cellulose, tách chiết lần vào năm 1811 nhà dược hóa học người Pháp Henri Braconnot từ nấm (Braconnot, 1811) Trong tự nhiên chitin tồn nhiều nguồn nguyên liệu khác bao gồm vỏ loài giáp xác, côn trùng vi sinh vật Trong loài giáp xác tôm, cua, ghẹ,… loài chân đầu mực,… vỏ tôm hùm có hàm lượng chitin cao chiếm 60-75% Từ côn trùng có vỏ loài muỗi, gián, ong mật, nhộng tằm,… Chitin tồn phổ biến giới vi sinh vật như: vi nấm, nấm mốc, nấm men, số loài tảo số loài xạ khuẩn Streptomyces Nhưng nguồn khai thác từ phế liệu thủy sản, vỏ loài giáp xác đặc biệt từ tôm cua Công thức phân tử (C8H13O5N)n Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loại nguyên liệu (ntôm thẻ = 400÷500, ntôm hùm = 700÷800, ncua = 500÷600) Chitin poly (β-(1→4)- N-acetyl-D-glucosamin), polisaccarit mạch thẳng không phân nhánh, cấu tạo monosaccharit N-acetyl-β-D-glucosamin liên kết với liên kết β-1,4-glucoside, tạo nên mạng lưới sợi có tổ chức, có cấu trúc tương tự cellulose, carbon C-2 cellulose chứa nhóm hydroxyl (–OH) chitin chứa nhóm acetyl (–COCH3) Hình Cấu trúc hóa học chitin Trong loài giáp xác, chitin thành phần cấu tạo tạo nên độ cứng vỏ tôm, chitin dạng tự mà kết hợp với protein dạng phức hợp, cacbonat canxi nhiều hợp chất hữu khác Dựa vào nguồn tách chiết chitin người ta chia thành dạng: α-chitin, β-chitin γ-chitin - α-chitin phổ biến nhất, tìm thấy nấm thành tế bào nấm men, nhuyễn thể, gân vỏ tôm hùm, cua, vỏ tôm lớp biểu bì côn trùng, có độ Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa rắn phân tử cao dạng rắn mạch chitin xếp song song - ngược chiều β-chitin gặp hơn, thường có mực, bao gồm mạch chitin song song - chiều nhau, có độ rắn thấp, tính hydrat hóa cao γ-chitin biến thể α-chitin, xếp mạch song song chiều có mạch ngược chiều 1.3 Nội dung nghiên cứu Vỏ tôm Khử khoáng Khử protein Tẩy màu Thủy phân Kết tinh Glucosamine Hình 2: Quy trình sản xuất glucosamin Quá trình sản xuất glucosamine gồm công đoạn chính: xử lý khoáng, xử lý protein tẩy màu, sau thủy phân chitin, kết tinh tạo thành glucosamine Do vậy, nguyên tắc chung trình sản xuất glucosamine phải sử dụng biện pháp công nghệ để khử bỏ tạp chất phi chitin (protein, khoáng, lipit) thủy phân chitin thu glucosamine 1.3.1 Quá trình xử lý khoáng Đối với phế liệu vỏ tôm, hàm lượng khoáng tương đối cao (chủ yếu muối calci cacbonate calci phosphate) nên thực công đoạn xử lý khoáng đầu tiên, Trang GVHD: TS Phan Ngọc Hòa công đoạn góp phần loại bỏ phần protetin bám dính vỏ giáp xác giúp giảm bớt gánh nặng cho công đoạn xử lý protein Có thể xử lý khoáng hóa chất sau: acid vô (HCl, HNO 3, H2SO4,…) hay acid hữu (acid lactic, acid acetic,…) Hiện thường sử dụng dung dịch HCl loãng nhiệt độ phòng để xử lý khoáng Phản ứng hóa học trình xử lý khoáng sau: H+ + CaCO3 → Ca2+ + CO2 ↑ + H2O Hàm lượng khoáng giảm đến 90% thời gian đầu trình xử lý khoáng (trong vòng 30 phút), sau trình diễn chậm Các yếu tố ảnh hưởng đến trình xử lý khoáng nhiệt độ, nồng độ, thời gian tỷ lệ nguyên liệu/acid Sản phẩm chitin đạt chất lượng cao hàm lượng khoáng lại 1% 1.3.2 Quá trình xử lý protein Protein liên kết với chitin vỏ tôm thành lớp xen kẽ, protein liên kết với CaCO3 tạo nên tính bền vững vỏ Các hóa chất sử dụng để xử lý protein từ nguyên liệu như: NaOH, Na 2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2,… Ngoài sử dụng chế phẩm enzyme protease hay enzyme: từ vi sinh vật sinh (Bacillus subtilis, Flavourzyme (Novozymes, Đan Mạch) chiết xuất từ Aspergillus oryzae, Lactobacillus plantarum), bromelin dịch ép vỏ dứa, papain đu đủ, Hiện NaOH sử dụng phổ biến Trong môi trường kiềm, protein bị thủy phân tạo acid amin peptide hòa tan, theo phương trình phản ứng sau: Yêu cầu chất lượng chitin công nghiệp hàm lượng protein lại sản phẩm chitin phải nhỏ 1% Trang 10 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Hoạt tính enzyme chitinase xác định dựa theo hình thành hàm lượng glucosamine trình thủy phân chitin Phương pháp dựa hình thành dẫn xuất pyrrole glucosamine đun nóng thuốc thử acetylacetone Các pyrrole phản ứng tạo màu với thuốc thử Ehrlich Hàm lượng glucosamine tỉ lệ thuận với cường độ màu dung dịch - Dụng cụ - thiết bị Pipet 1ml, 10ml Bình định mức 500ml Erlen 500ml Ống nghiệm Cuvet Cân phân tích Máy đo quang phổ UV-VIS Chuẩn bị thuốc thử Thuốc thử acetylacetone: Pha 1ml acetylacetone 50ml dung dịch Na2CO3 0.5N Thuốc thử Ehrlich: 0.8g p-Dimethylaminobenzaldehyde pha 30ml dung dịch HCl đậm đặc Xây dựng đường chuẩn Bảng 2: Xây dựng đường chuẩn Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Lượng glucosamine (µg/ml) 50 100 150 200 250 Dd glucosamine 500ppm (ml) Thuốc thử acetylacetone 1 1 1 Nước cất 1 Đun cách thủy 100oC 20 phút Làm nguội vòi nước chảy Thuốc thử Ehrlich 1 1 Trang 23 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Giữ 70oC 10 phút Làm nguội vòi nước chảy Sau đo OD bước sóng 530nm Chuẩn bị mẫu Chitin huyền phù 1%: Cân 5g chitin, thêm vào 50ml dung dịch HCl đậm đặc, khuấy phút 40oC, cho thêm 500ml nước cất để lạnh oC, khuấy thu chitin huyền phù, rửa chitin huyền phù nước cất đến đạt pH = định mức đến 500ml Hút 1ml chitin huyền phù 1% 1ml enzyme, lắc 30 oC 20 phút, sau đun sôi hỗn hợp phút (bất hoạt enzyme) Làm mẫu trắng song song cách thay enzyme nước cất Cách tiến hành Hút 3ml mẫu cho vào ống nghiệm, cho thêm 1ml thuốc thử acetylacetone 5ml nước cất Sau đun cách thủy 100oC 20 phút, làm nguội vòi nước chảy Tiếp theo cho thêm 1ml thuốc thử Ehrlich vào ống nghiệm Đun cách thủy 70oC 10 phút, làm nguội vòi nước chảy Sau tiến hành so màu bước sóng 530nm Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy hàm lượng glucosamine mẫu Từ tính hoạt độ enzyme chitinase Tính kết Một đơn vị hoạt độ enzyme chitinase tương ứng với 1µg glucosamine tạo thành thủy phân chitin thời gian phản ứng Hoạt độ enzyme chitinase = (đvhđ) Trong đó: a – hàm lượng glucosamine tạo thành tính theo đường chuẩn (µg/ml) t – thời gian phản ứng (20 phút) V – thể tích enzyme (1ml) Trang 24 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa 2.5 Xác định độ tinh theo phương pháp sắc ký HPLC Kỹ thuật HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC – hay gọi sắc ký lỏng cao áp) kỹ thuật phân tích dùng để tách chất, định tính định lượng thành phần hợp chất Kỹ thuật thực theo nguyên lý bơm áp lực lượng chất lỏng có chữa hỗn hợp mẫu qua cột nhồi chất hấp phụ dạng rắn Mỗi thành phần mẫu cần phân tích tương tác cách khác với chất hấp phụ cho tốc độ dòng khác tách thành phần khác chúng khỏi cột Sắc ký lỏng hiệu cao hình thức cải tiến sắc ký cột Thay dung môi qua cột lực hấp dẫn, chúng qua cột áp lực cao lên đến 400 lần áp suất khí Điều cho phép bạn sử dụng kích thước hạt nhỏ nhiều cho vật liệu cột diện tích bề mặt lớn nhiều cho tương tác pha phân tử chuyển qua Điều cho phép tách biệt thành phần hỗn hợp Cải tiến lớn sắc ký cột khác liên quan đến phương pháp phát chất hợp chất Những phương pháp tự động hóa cao nhạy cảm Nguyên tắc HPLC HPLC thực dựa việc bơm để đẩy lượng chất lỏng áp suất cao hỗn hợp mẫu cần phân tích qua cột nhồi đầy loại chất hấp phụ từ dẫn tới việc tách thành phần mẫu Chất hấp phụ – nhồi cột, hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ – 50 µm Các thành phần hỗn hợp mẫu tách khỏi nhờ vào mức độ tương tác khác với hạt chất hấp phụ Dòng chất lỏng áp suất cao thường hỗn hợp dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), gọi “pha động” Thành phần nhiệt độ dung môi đóng vai trò trình tách chất tương tác xảy thành phần mẫu chất hấp phụ Về chất, tương tác tương tác vật lý tương tác kị nước (phân tán), tương tác lưỡng cực tương tác ion, thông thường tổng hợp tất tương tác Trang 25 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa HPLC ưu việt so với phương pháp sắc ký lỏng cổ điển (áp suất thấp) áp suất hoạt động cao nhiều (từ 50-400 bar) kỹ thuật sắc ký cổ điển dựa lực hấp dẫn để đẩy pha động khỏi cột Do có lượng nhỏ mẫu tách phân tích HPLC, cột thông thường có đường kính khoảng 2.1 – 4.6 mm độ dài khoảng 30-250 mm Ngoài ra, cột sắc ký nhồi hạt hấp phụ có kích thước nhỏ (kích thước trung bình từ 2-50 µm) Điều cho phép HPLC khả tách hỗn hợp cách hữu hiệu trở hành kỹ thuật sắc kí phổ biến Hình 8: Mô hình chạy HPLC Một số điểm hệ thống HPLC Các cột dung môi Có hai loại sử dụng HPLC tùy thuộc vào phân cực tương đối dung môi pha tĩnh • HPLC bình thường Đây chất giống bạn đọc sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột Mặc dù mô tả "bình thường" hình thức sử dụng phổ biến HPLC Cột làm đầy với hạt silica nhỏ xíu, dung môi không phân cực hexane, ví dụ Một cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể hơn), chiều dài 150-250 mm Các hợp chất có cực hỗn hợp qua cột bị giữ cột lâu so với hợp chất không phân cực Những chất không phân cực vượt qua cột nhanh • HPLC đảo Trong trường hợp này, kích thước cột nhau, silica thay đổi để làm cho không phân cực cách gắn chuỗi hydrocacbon lên bề mặt thường 18 nguyên tử carbon Một dung môi cực sử dụng - ví dụ, Trang 26 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa hỗn hợp nước rượu methanol Điều có nghĩa phân tử phân cực qua cột cách nhanh chóng Đảo ngược giai đoạn HPLC hình thức sử dụng phổ biến HPLC Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh hợp chất hữu gắn lên chất mang rắn silica cấu thành từ silica theo hai kiểu: Pha tĩnh giữ lại chất mang rắn chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography) Pha tĩnh liên kết hóa học với chất → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Trong trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm sắc ký pha lỏng-lỏng số nguyên nhân sau: Pha tĩnh hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan pha động nên dễ bị mát pha tĩnh thời gian sử dụng gây nhiễm hợp chất phân tích Do pha tĩnh sắc ký lỏng-lỏng dễ tan pha động nên người ta ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi Vì vậy, người ta thường quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết phần lớn loại cột sử dụng sắc ký phân bố có cấu trúc dạng Bề mặt hạt silica – SiO (các hạt có đường kính 3, 10 µm) xử lý (thủy phân) cách đun nóng với HCl 0,1M hai ngày để tạo nhóm SiOH sau (thông thường có khoảng µmol SiOH/m bề mặt): Hình 9: Bề mạt silica bị phân hủy Sau bề mặt silica thủy phân cho phản ứng với organochlorosilan để tạo pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình phân cực tùy theo nhóm R gắn vào Thường khoảng 50% nhóm –OH H+ để tạo HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan Trang 27 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa hóa) kết hợp bị ảnh hưởng hiệu ứng lập thể Ngoài nhóm Cl người ta sử dụng –OCH3 Hợp chất cần phân tích qua pha tĩnh bị giữ lại lực lượng tương tác khác tùy thuộc tính chất, đặc điểm chất tan pha tĩnh Hình 10: Tạo nhánh bề mặt silica Trong SKPĐ, nhóm R hợp chất siloxan không phân cực phân cực Đó ankyl dây dài C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) gọi ODS (octadecylsilan) nhóm alkyl ngắn C2; có cyclohexyl, phenyl nhóm phenyl có độ phân cực cao nhóm alkyl Người ta nhận thấy alkyl dây dài cho kết tách ổn định loại khác nên loại sử dụng nhiều Hình 11: Cấu trúc cột ODS Pha • • • • • động sắc ký lỏng nói chung phải đạt yêu cầu sau: Hòa tan mẫu phân tích Phù hợp với đầu dò Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao Tinh khiết dùng cho sắc ký (HPLC grade) Trang 28 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết sử dụng nhiều dung môi kinh nghiệm thực tế cho thấy methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) tetrahydrofuran (THF) đạt yêu cầu Nước dung môi cho vào dung môi hữu để giảm khả rửa giải Mỗi dung môi đặc trưng số vật lý số khúc xạ (refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực (polarity index), độ rửa giải (eluent strength)… Trong độ phân cực độ rửa giải có tác động lớn lên khả phân tách mũi sắc ký Hình 12: Tính chất số pha động sắc ký lỏng Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N, hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α Khi thay đổi thành phần pha động không đem lại kết tách mũi theo yêu cầu phải thay đổi chất pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α Đôi phải thay đổi pha tĩnh Trong trình tách SKPĐ, tương tác hợp chất cần phân tích pha động phụ thuộc nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) tính baz (nhận proton) dung môi Thông thường pha động SKPĐ bao gồm hỗn hợp nước dung dịch đệm với nhiều dung môi hữu phân cực tan nước Nước Trang 29 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa dung môi phân cực nên không tương tác với nhóm alkyl không phân cực pha tĩnh, coi pha động yếu có tốc độ rửa giải chậm tất dung môi động SKPĐ Hỗn hợp nước dung môi hữu thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng áp suất cột Việc lựa chọn dung môi thành phần dung môi pha động tối ưu hóa cho hợp chất cần phân tích Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/nước trước, ACN/nước hay THF/nước Với hỗn hợp chất phân tích phức tạp có trộn lẫn dung môi hữu với nước Khi lựa chọn phải chọn hỗn hợp MeOH, ACN THF với nước có độ rửa giải tương đồng Thành phần pha động cố định suốt trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) thay đổi theo chương trình định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu tách tốt Một chu trình dòng chảy HPLC Hình 13: Một chu trình dòng chảy HPLC Tiêm • mẫu Trang 30 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Tiêm mẫu hoàn toàn tự động, bạn thể rõ làm điều thực mức độ giới thiệu Bởi áp lực liên quan, không giống sắc ký khí (nếu bạn nghiên cứu) • Thời gian lưu Thời gian thực cho hợp chất đặc biệt qua cột phát gọi thời gian lưu giữ Thời gian tính từ thời điểm mẫu bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị độ cao, cao điểm tối đa cho hợp chất Các hợp chất khác có thời gian lưu khác Đối với hợp chất đặc biệt, thời gian lưu giữ khác tùy thuộc vào: Áp lực sử dụng (bởi điều ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy dung môi) Tính chất pha tĩnh (không vật chất làm bằng, có kích thước hạt) Thành phần xác dung môi Nhiệt độ cột Điều có nghĩa điều kiện phải kiểm soát cẩn thận bạn sử dụng thời gian lưu giữ cách xác định hợp chất • Detector (đầu dò) Có số cách phát chất qua cột Một phương pháp phổ biến dễ dàng để giải thích sử dụng đầu dò tử ngoại Nhiều hợp chất hữu hấp thụ ánh sáng tia cực tím bước sóng khác Nếu bạn có chùm ánh sáng tia cực tím chiếu sáng qua dòng chất lỏng khỏi cột, đầu dò tử ngoại phía đối diện dòng, bạn đọc trực tiếp ánh sáng hấp thụ Lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộc vào số lượng hợp chất đặc biệt qua chùm tia vào thời điểm Trang 31 Hình 14: Đầu dò hệ thống HPLC GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Các dung môi sử dụng không hấp thụ ánh sáng UV Chúng có, nhiên, hợp chất khác hấp thụ mạnh mẽ phận khác quang phổ tia cực tím Methanol, ví dụ, hấp thụ bước sóng 205 nm, nước 190 nm Nếu sử dụng hỗn hợp methanol-nước dung môi, ta phải sử dụng bước sóng lớn 205 nm để tránh đọc sai từ dung môi Giải thích thông số đầu từ detector Đầu ghi lại loạt đỉnh pick- đại diện cho hợp chất hỗn hợp qua hấp thụ ánh sáng tia cực tím Miễn ta cẩn thận để kiểm soát điều kiện cột, ta sử dụng thời gian lưu để xác định hợp chất cung cấp, tất nhiên, (hoặc người khác) đo mẫu chuẩn hợp chất khác điều kiện giống hệt Tuy nhiên, ta sử dụng đỉnh pick cách đo số lượng hợp chất có Chúng ta giả sử bạn quan tâm đến hợp chất đặc biệt, X Nếu tiêm dung dịch chứa lương X tinh khiết vào máy, không ghi lại thời gian lưu giữ nó, ta định lượng X qua quan hệ độ cao đỉnh pick hình thành, sở đo mẫu chuẩn Diện tích đỉnh tỷ lệ thuận với số lượng X qua đầu dò, khu vực tính toán tự động máy tính Các vùng đo lường thể màu xanh biểu đồ Trang 32 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Hình 15: Đỉnh với diện tích lớn Nếu hòa tan X tập trung hơn, diện tích đỉnh - thời gian lưu giữ Ví dụ: Hình 11: Đỉnh với diện tích nhỏ Điều nghĩa hiệu chỉnh máy tính để phát số lượng chất - với số lượng nhỏ Nếu có hai chất khác hỗn hợp (X Y), ta nói điều số lượng tương đối chất ta sử dụng hấp thụ tia cực tím phương pháp phát Hình 12: Đỉnh chất X Y Trong sơ đồ, diện tích đỉnh cao cho Y cho X Đó có Y X, tốt Y hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng bạn sử dụng X không Có thể có số lượng lớn Y nay, hấp thụ cách yếu ớt, cung cấp cho đỉnh nhỏ Một số đại lượng phân tích sắc ký Hệ số phân bố Cân cấu tử X hệ sắc ký mô tả phương trình sau: Trang 33 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Hằng số cân K cho cân gọi tỉ lệ phân bố hay số phân bố (partition coefficient) tính sau: Với CS : nồng độ cấu tử pha tĩnh CM : nồng độ cấu tử pha động Hệ số K tùy thuộc vào chất pha tĩnh, pha động chất phân tích Thời gian lưu: tR : thời gian lưu cấu tử từ vào cột đến tách ngồi cột tO : thời gian chất lực với pha tĩnh qua cột; thời gian pha động từ đầu cột đến cuối cột gọi thời gian lưu chết tR' : thời gian lưu thật cấu tử Hình 18: Thời gian lưu cấu tử phân tích Hệ số dung lượng k’ Trang 34 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa k’ định nghĩa theo công thức sau: Với VS : thể tích pha tĩnh VM : thể tích pha động Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất nhanh, cột khả giữ chất lại Nếu k’ lớn (tR lớn): chất cột lâu, thời gian phân tích lâu, mũi có khả bị tù Khoảng k’ lý tưởng 2-5, phân tích hỗn hợp phức tạp, k’ chấp nhận khoảng rộng 1-20 Hiệu Hiệu hay số đĩa lý thuyết N cột đặc trưng cho khả tách mũi sắc ký cấu tử cột N lớn, hiệu tách cao Số đĩa lý thuyết đo sắc ký đồ Người ta chứng minh được: Hay Với W1/2 chiều rộng mũi sắc ký vị trí ½ chiều cao mũi (phút) W chiều rộng mũi sắc ký vị trí đáy mũi (phút) Độ chọn lọc Đặc trưng cho khả tách hai chất cột Độ phân giải: Trang 35 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa Đây đại lượng biểu thị rõ ba khả cột sắc ký: giải hấp, chọn lọc hiệu tách Nó xác định qua phương trình sau: Hay Với N xác định từ phương trình (2.5) (2.6) Trang 36 GVHD: TS Phan Ngọc Hòa TÀI LIỆU THAM KHẢO 1/ Phạm Thị Hà, Bài giảng phân tích công cụ, trường đại học sư phạm Đà Nẵng, 2010 2/ Sani A Ali cộng sự, 2011, High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Development and ValidationIndicating Assay for Ciprofloxacin Hydrochloride, Journal of Applied Pharmaceutical Science 01, số 8: 239-243 3/ Patrícia Mazureki Campos cộng sự, 2016, Quantification of lipoic acid from skin samples by HPLC using ultraviolet, electrochemical and evaporative light scattering detectors, Journal of Chromatography B, số 1019: 66-71 4/ Xiaoxuan Shen cộng sự, 2007, Liquid Chromatographic Analysis of Glucosamine in Commercial Dietary Supplements Using Indirect Fluorescence Detection, Journal of Chromatographic Science, số 45, 1-6 5/ Yu Shao cộng sự, 2004, A stability-indicating HPLC method for the determination of glucosamine in pharmaceutical formulations, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, số 35, 625-631 6/ Phạm Thị Đan Phượng Trang Sĩ Trung, 2012, TÍNH CHẤT CỦA CHITIN VÀ CHITOSAN TỪ VỎ TÔMTHẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) KHỬ PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC VÀ SINH HỌC, Tạp chí Khoa học Công nghệ thủy sản, số 3, 1-5 7/ Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, 03/2005, Sản xuất chế phẩm kỹ thuật - NXB Nông nghiệp 8/ Trần Thị Luyến cộng (2003), Nghiên cứu sản xuất Chitosan từ vỏ tôm sú phương pháp hóa học với công đoạn xử lý kiềm, Tạp chí KHCN Thủy sản, Đại học Thủy Sản, số 5, 18-20 Trang 37