Xác định tế bào nấm men sống/ chết và hình thái của chúng bằng kính hiển vi quang học dựa trên nguyên tắc khúc xạ ánh sáng qua hệ các thấu kính thủy tinh. Thí nghiệm kiểm tra đường sót lại trong quá trình lên men tiến hành theo hai phương pháp để có đánh giá khách quan nhất về quá trình lên men. Cách 1: kiểm tra lượng đường sót ngay sau quá trình thu nhận mẫu tại các thời điểm lên men nhất định (0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ) bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS) (Miller, 1959). Cách 2: kiểm tra lượng đường sót một cách tập trung các mẫu (lưu trữ mẫu trong thời gian dài và kiểm tra cùng lúc) tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO 17025 bằng phương pháp sắc kí lỏng áp suất cao (HPLC). Thí nghiệm kiểm tra cồn trong quá trình lên men: Tương tự như thì nghiệm kiểm tra đường sót trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành song song hai phương pháp khác nhau để kiểm tra độ cồn trong quá trình lên men. Điều cần lưu ý là cồn là một hợp chất dễ bay hơi, chính vì vậy việc kiểm tra lượng cồn sinh ra trong quá trình lên men của nấm men ngay sau khi lấy mẫu giúp hạn chế được sai số do quá trình tồn trữ gây thất thoát.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN MÔN : KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM Đề tài : KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CỦA KLUYVERMICES MARXIANUS TRONG MÔI TRƯỜNG TỰ DO VÀ CỐ ĐỊNH CÓ CHẤT ỨC CHẾ GVHD: TS.Phan Ngọc Hòa Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men có khả lên men cenllulose có ý nghĩa việc góp phần tận dụng nguồn phế liệu dồi từ cenllulose để cung cấp lượng cho người Đề tài khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế để tìm điều kiện tối ưu để tạo sản phẩm lên men tối ưu Tổng quát đề tài gồm có nội dung sau: Xác định tế bào nấm men sống/ chết hình thái chúng kính hiển vi quang học dựa nguyên tắc khúc xạ ánh sáng qua hệ thấu kính thủy tinh Thí nghiệm kiểm tra đường sót lại trình lên men tiến hành theo hai phương pháp để có đánh giá khách quan trình lên men Cách 1: kiểm tra lượng đường sót sau trình thu nhận mẫu thời điểm lên men định (0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ) phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS) (Miller, 1959) Cách 2: kiểm tra lượng đường sót cách tập trung mẫu (lưu trữ mẫu thời gian dài kiểm tra lúc) phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO 17025 phương pháp sắc kí lỏng áp suất cao (HPLC) Thí nghiệm kiểm tra cồn trình lên men: Tương tự nghiệm kiểm tra đường sót trình lên men, tiến hành song song hai phương pháp khác để kiểm tra độ cồn trình lên men Điều cần lưu ý cồn hợp chất dễ bay hơi, việc kiểm tra lượng cồn sinh tron trình lên men nấm men sau lấy mẫu giúp hạn chế sai số trình tồn trữ gây thất thoát Để hiểu rõ nguyên tắc, phương pháp tiến hành tìm hiểu báo cáo nhóm Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa I Tổng quan 1.1 Ý nghĩa đề tài Nhiên liệu sinh học quan tâm xem nguồn thay nhiên liệu hóa thạch Sử dụng nhiên liệu sinh học làm giảm hiệu ứng nhà kính, cung cấp nguồn lượng bền vững đồng thời làm tăng thu nhập cho nông dân nghèo nước phát triển Nhiên liệu sinh học bao gồm bioethanol, biomethanol, dầu thực vật, dầu diesel sinh học, khí sinh học, khí tổng hợp sinh học (biosyngas), dầu sinh học, than sinh học biohydrogen Trong đó, nhiên liệu sinh học dạng lỏng biomethanol bioethanol quan tâm nhiều Trước đây, sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ tinh bột đường có nhiều tranh luận tính bền vững Do đó, nguyên liệu giàu cellulose xem lựa chọn tiềm nguyên liệu giàu cellulose không cạnh tranh với lương thực giá thành rẻ so với loại nguyên liệu khác dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học Ngoài ra, nguyên liệu giàu cellulose nguồn nguyên liệu phù hợp cho sản xuất nhiên liệu sinh học lý sau: • Là nguồn tài nguyên tái tạo phát triển cách bền vững tương lai • Thân thiện với môi trường • Có tiềm kinh tế quan trọng giá nhiên liệu hóa thạch có xu hướng tăng (Cadenas cộng sự, 1998; Demirbas, 2008a; Demirbas, 2008b) Nguyên liệu giàu cellulose bao gồm tất dạng nguyên liệu có nguồn gốc thực vật gỗ, thân thảo, trồng chất thải động vật ăn cỏ Thực vật nguồn phổ biến nguyên liệu giàu cellulose Việc sử dụng lượng chuyển đổi từ nguyên liệu giàu cellulose cho thấy nhiều lợi ích môi trường Sinh khối chuyển thành nhiên liệu lỏng khí thông qua đường khác nhiệt hóa học sinh học Page Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Các thành phần nguyên liệu giàu cellulose bao gồm cellulose, hemicelluloses, lignin, tro hợp chất khác Cellulose hemicellulose thường chiếm hai phần ba khối lượng khô thành tế bào, chúng bị thủy phân thành đường sau lên men thành ethanol sinh học Cellulose (chiếm 30-60% tổng hàm lượng khô) polymer hữu bao gồm nhiều đơn vị glucose liên kết lại với phân tử mạch thẳng Các sợi cellulose liên kết lại với liên kết hydro tạo nên tinh thể rắn khó bị phá hủy Hemicellulose (chiếm 20-40% tổng hàm lượng khô) polymer ngắn, phân nhánh cao đường năm carbon (pentoses) sáu carbon (hexoses) Cụ thể hemicellulose chứa xylose arabinose (đường năm carbon) galactose, glucose, mannose (đường sáu carbon) Hemicellulose dễ bị thủy phân cellulose cấu trúc phân nhánh chất vô định hình Các loại đường chiếm ưu hemicelluloses mannose gỗ mềm xylose gỗ cứng chất thải nông nghiệp Hemicelluloses dễ bị phân hủy nhiệt Lignin (chiếm 15-25% tổng hàm lượng khô) polymer thơm tổng hợp từ tiền chất phenylpropanoid Các đơn vị phenylpropane lignin (chủ yếu syringyl, guaiacyl p-hydroxy phenol) liên kết với tập hợp mối liên kết để tạo thành ma trận phức tạp gồm loạt nhóm chức hydroxyl, methoxyl cacbonyl Chức chúng cung cấp độ bền kết cấu, bảo đảm vận chuyển nước dinh dưỡng cây, bảo vệ chống lại phân hủy enzyme thủy phân Lignin liên kết đồng hóa trị với xylan trường hợp gỗ cứng galactoglucomannan gỗ mềm Lignin hợp chất hữu không tan nước, bị phân hủy 251oC (525oK) tạo thành gốc tự phenoxyl gốc tự có xu hướng tạo thành kết tủa rắn thông qua ngưng tụ tái trùng hợp Sản lượng ethanol sinh học từ nguyên liệu giàu cellulose phụ thuộc vào hàm lượng cellulose, hemicellulose nồng độ đường nguyên liệu thực vật Các lignin sử dụng để sản xuất ethanol sinh học Sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu cellulose bao gồm có bước (Hình 1.1) a) phá hủy cấu trúc polysaccharides thành đường có khả lên men cách sử dụng acid enzyme, b) lên men đường thành Page Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa ethanol c) thu hồi ethanol Do lignocellulose cấu trúc khó bị phá hủy nên trình tiền xử lý bước cần thiết cho việc thu thập loại đường có khả lên men bước thủy phân Mục đích tiền xử lý phá vỡ cấu trúc lignin cấu trúc tinh thể cellulose để tăng cường khả tiếp xúc chúng với enzyme thủy phân Hình 1 Sơ đồ khái quát quy trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu cellulose (Galbe cộng sự, 2007) Tuy nhiên, trình tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose sinh nhiều hợp chất ức chế vi sinh vật lên men ethanol dẫn xuất furan, acid hữu hợp chất phenolic Trong số dẫn xuất furan, furfural 5hydroxymethyl furfural thành phần quan trọng hình thành từ phản ứng phân hủy pentose hexose Nhóm acid hữu gồm có acid acetic, formic levulinic; acid acetic chất ức chế nấm men mạnh hình thành từ chuyển hóa nhóm acetyl hemicellolse Các hợp chất phenolic có nguồn gốc từ lignin, bao gồm ferulic acid, vanillin, vanillic acid, vanillyl alcohol, 4hydroxybenzoic acid, 4-hydroxybenzaldehyde, coumaric acid, syringaldehyde, syringic acid, cinnamaldehyde, dihydroconiferyl alcohol, hydroquinone, catechol, veratrole, acetoguaiacetone, homovanillic acid Hibbert’s ketones; đó, ferulic acid chất ức chế nấm men hiệu Hiệu suất chuyển đổi cellulose thành glucose phụ thuộc vào mức độ trình tiền xử lý hóa chất học Các phương pháp nghiền loại Page Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa nguyên liệu ảnh hưởng đến khả tiếp xúc cellulose với enzyme thủy phân Chính vậy, việc nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men có khả lên men cenllulose có ý nghĩa góp phần tận dụng triệt để nguồn phế liệu dồi từ cenllulose để cung cấp nguồn lượng cho người Thông qua việc nghiên cứu đáp ứng Klyveromyces Marxianus cac điều kiện lên men có chất ức chế nhằm cun cấp thông tin khoa học cho trình sản xuất ethanol thông qua đường lên men có sử dụng chủng nấm men nêu 1.2 Phương hướng kế hoạch thực Để tiến hành thực đề tài trên, tiến hành khảo sát khả lên men sinh ethanol nấm men Klyveromyces Marxianus theo thí nghiệm sau: • Thí nghiệm 1: Khảo sát trình lên men nấm men Klyveromyces Marxianus cố định hạt alginate tự điều kiện chất ức chế • Thí nghiệm 2: Khảo sát trình lên men nấm men Klyveromyces Marxianus cố định hạt alginate tự điều kiện có mặt acid acetic (là chất ức chế đại diện cho nhóm chất acid hữu có sản phẩm giàu cenllulose tạo tạo thành từ việc chuyển hóa nhóm acetyl hemicenllulose) • Thí nghiệm 3: Khảo sát trình lên men nấm men Klyveromyces Marxianus cố định hạt alginate tự điều kiện có mặt phenolic • Thí nghiệm 4: Khảo sát trình lên men nấm men cố định hạt alginate tự điều kiện có mặt 5-hydroxymethyl furfural (5-HMF) Trong thí nghiệm nêu trên, tiếng hành trình tự nghiên cứu theo sơ đồ khối sau: Page Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Nấm men Môi trường Hassen Nuôi giống Alginate Cố định tạo hạt gel Bổ sung trực tiếp nấm men vào bình lên men CaCl2 Chất ức chế Bổ sung hạt gel vào môi trường lên men Lên men Kiểm tra mẫu Đường Số tế bào nấm men Page Cồn Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa a Lưu trữ giống Mục đích : Để đảm bảo cấp đời giống nấm men Klyveromyces Marxianus - đồng cho suốt thí nghiệm, ta cần tiến hành lưu trữ giống cấp Tiến hành Từ giống cấp ban đầu, ta tiến hành cấy lên đĩa thạch Lưu trữ giống đĩa thạch vào ống eppendorf với 1ml glycerol 20% (điểm - đông -4.8oC) Bảo quản tủ mát (5oC) Thiết bị : tủ cấy, tủ mát, máy tiệt trùng Giống cấp Nhân giống tạo giống cấp Bảo quản Lên men b Lên men Chuẩn bị môi trường lên men, nuôi giống Mục đích : chuẩn bị môi trường cho trình lên men nuôi giống trước cho lên men Tiến hành : - Cân hóa chất cần thiết ( môi trường Hasssen) Hóa chất - Môi trường nhân Môi trường lên giống men (150ml/ (300ml/bình) bình) men 5 Cao nấm (g/l) MgSO4 (g/l) 1 KH2PO4 (g/l) 2 (NH4)2SO4 (g/l) 2 Đường glucose 40 150 (g/l) Tiệt trùng 121oC/ 1atm thời gian 15 phút, làm khô 10 phút Page Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa - Giống từ ống epphendor ly tâm loại bỏ glycerol tráng lại nước - cất vô trùng, nấm men cho vào bình có môi trường nuôi giống Nấm men nuôi cấp sử dụng cho trình lên men ( số tế bào nấm men > tỷ tb/ml) Thiết bị : cân kỹ thuật, cân phân tích, máy tiệt trùng c Cố định, tạo hạt gel Mục đích : tạo môi trường bảo vệ nấm men điều kiện lên men có chất ức chế Tiến hành: Sơ đồ khối trình tạo hạt gel alginate Nước vô khuẩn Sinh khối Alginate nấm men Nước Hòa tan Pha huyền phù Tiệt trùng Phối trộn Tạo hạt Dung dịch CaCl2 Nước vô khuẩn Ngâm CaCl2 Rửa hạt Hạt gel alginate chứa nấm men Page 10 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosamper) Cột sắc kí Trong hệ thống thiết bị HPLC, cột sắc kí đóng vai trò quan trọng nên việc lựa chọn cột cần phù hợp với yêu cầu đề Việc lựa chọn cột sắc kí thường phụ thuộc vào tính chất mẫu (khối lượng phân tử, tính phân cực, …) Đầu tiên, ta cần tiến hành lựa chọn phương pháp tách phù hợp cột sắc kí Từ kích thước vật liệu cần phân tích, có loại phương pháp HPLC phù hợp (Bảng 2.1) Bảng Lựa chọn phương pháp tách theo kích thước phân tử Khối lượng phân tử Khối lượng phân tử nhỏ (5000g/mol) • Tương tác kỵ nước • Pha đảo Tan dung môi • Sắc ký rây phân tử không sử dụng hữu nước Sau ta tiến hành chọn loại vật liệu thích hợp cho cột, cần lựa chòn loại hạt • • nhồi kích cỡ hạt nhồi thích hợp chúng ảnh hưởng đến hiệu suất suất hệ thống Nếu chọn hạt nhồi kích thước lớn, thời gian chạy cột nhanh hiệu phân tách không cao hạt nhồi kích thước nhỏ Vì vậy, tùy vào yêu cầu chất lượng sản phẩm chi phí mà ta chọn lựa cho thời gian tối ưu Đầu dò Page 23 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp Tín hiệu đầu dò thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang (Đây lọai đầu dò thông dụng nhất) → lựa chọn cho trình phân tích đường - Đầu dò hùynh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn suất có huỳnh quang - Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng loại đường - Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dò phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý thông số liên quan đến kết phân tích Page 24 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa 2.3 Thí nghiệm kiểm tra cồn trình lên men Tương tự nghiệm kiểm tra đường sót trình lên men, tiến hành song song hai phương pháp khác để kiểm tra độ cồn trình lên men Điều cần lưu ý cồn hợp chất dễ bay hơi, việc kiểm tra lượng cồn sinh tron trình lên men nấm men sau lấy mẫu giúp hạn chế sai số trình tồn trữ gây thất thoát Tuy vậy, tiến hành kiểm tra lại thông qua thiết bị đại phòng thí nghiệm đạt chuẩn Quá trình kiểm tra cồn thực theo hai cách sau: 2.3.1 Mục đích Xác định hàm lượng cồn sinh trình lên men điều kiện tự cố định có chất ức chế nấm men Từ tính toán hiệu suất sinh cồn xác định điều kiện tối ưu cho lên men thu sản phẩm cồn nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phương pháp chuẩn độ a Nguyên tắc Dụng dịch Kali bicromat (K2Cr2O7) môi trường axit (H+) oxi hóa rượu (C2H5OH) tạo thành Cr3+ có màu xanh lơ sáng 3C2H5OH + 8H2SO4 + 2K2Cr2O7 -> 3CH3COOH + 11H2O + 2K2SO4 + 2Cr2(SO4)3 Sử dụng KI để khử Bicromat (K2Cr2O7) dư giả phóng iot ( I2), dung dịch có màu nâu tím 6KI + K2Cr2O7 + 7H2SO4 -> 4K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 3I2 + 7H2O Dùng Na2S2O3 chuẩn lượng I2 sinh ra, với thị hồ tinh bột 2Na2S2O3 + I2 -> 2NaI + Na2S4O6 Từ tính lượng K2Cr2O7 tham gia phản ứng với rượu thông qua lượng Na2S2O3 dùng để chuẩn mẫu thí nghiệm mẫu trắng Từ tính hàm lượng ethanol mẫu, với 1ml K 2Cr2O7 0.1N phản ứng vừa đủ với 11.5mg C2H5OH b Dụng cụ - Erlen 250ml Page 25 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Pipet 10ml Bóp cao su Núp nhám Buret 25ml ống nhỏ giọt ống đong 100ml Bình định mức 100ml Thiết bị chưng cất c Hóa chất - H2SO4 đậm đặc - K2Cr2O7 0.1N - KI 10% - Hồ tinh bột 0.5% - Na2S2O3 0.1N d Quy trình thực - Bước : Hút 10ml mẫu rượu ( bia, dịch lên men…) cho bình định mức - 100ml thêm nước vào vạch Tiến hành chưng cất gần cạn dịch - Dịch thu sau chưng cất định mức 100ml lại Bước 2: Hút 20 ml K2Cr2O7 0.1N cho vào erlen 250ml, hút tiếp 5ml H 2SO4 dd cho vào Sau hút 10ml mẫu rượu chưng cất cho vào đậy nút nhám lại, chờ 15 phút cho phản ứng xảy (dung dịch có màu cam) Nếu xuất màu xanh lơ sáng làm lại tăng lượng K 2Cr2O7 - 0.1N Bước : Thêm 10ml dung dịch KI 10%, lắc để tối 10 phút ( dung dịch có màu nâu tím), có kết tủa tinh thể iot màu nâu tím - cần tăng lượng KI Bước : Đong 100ml nước cất cho vào erlen vài giọt hồ tinh bột ( dung - dịch màu xanh đen) Bước : Chuẩn độ I2 tạo thành Na2S2O3 xuất màu xanh lơ sáng bền Lưu ý : thực mẫu trắng song song với mẫu cần phân tích Page 26 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Hình 2.5 : Màu sắc mẫu cồn bước quy trình thực e Tính toán Dựa vào lượng thể tích Na2S2O3 sử dụng, ta xác định lượng cồn mẫu : Trong V0 : thể tích Na2S2O3 chuẩn mẫu trắng (ml) V : thể tích Na2S2O3 chuẩn mẫu • Phương pháp sắc kí khí (GC) a Giới thiệu phương pháp Sắc ký khí phương pháp tách, pha động chất khí dạng hơi, pha tĩnh ống chất rắn lỏng, phủ bề mặt chất mang rắn phủ lên thành phía cột, tạo thành lớp phim mỏng Sắc kí khí chia thành hai loại - Sắc kí khí – lỏng : pha động khí, pha tĩnh chất lỏng - Sắc kí khí – rắn : pha động khí, pha tĩnh chất rắn Các phương pháp rửa giải sắc ký : - Phương pháp rửa giải - Phương pháp đẩy - Phương pháp tiền lưu b Nguyên tắc Một lượng mẫu đại diện etanol mẫu đưa vào máy sắc ký khí có trang bị cột mao quản dùng pha tĩnh polydimetylsiloxan Khí mang heli vận chuyển mẫu qua cột, mẫu qua cột hấp phụ lên pha tĩnh Các thành phần rửa giải từ cột chuyển tới detector ion hóa lửa Tín hiệu detector xử lý hệ thống thu thập liệu điện tử Các thành phần etanol metanol nhận biết cách so sánh thời gian lưu chúng với thời gian lưu chuẩn phân tích điều kiện đồng Page 27 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Nồng độ tất thành phần tính theo % khối lượng xác định theo % diện tích pic so với pic chuẩn hóa (theo TCVN 7864 – 2008) c Hóa chất Sử dụng chất mang trơ : He Chất chuẩn : Ethanol, methanol d cấu tạo thiết bị sắc kí khí - Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…) - Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích - Bộ phận tiêm mẫu: Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, sử dụng chế độ chia dòng (split) không chia dòng (splitless) - Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (Autosamper – có phận hóa - headspace) - Cột phân tích : Có loại cột cột nhồi cột mao quản Page 28 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Hình 2.7 : Bồ phận phân tích thiết bị sắc kí khí - Đầu dò + Đầu dò ion hóa lửa (FID-Flame Ioniation Detetor) + Đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector) + Đầu dò cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector) + Đầu dò quang hóa lửa (FPD-Flame Photometric Detector) + Đầu dò NPD (NPD-Nitrogen Phospho Detector) + Đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry) - Bộ phận ghi nhận tín hiệu : Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý thông số liên quan đến kết phân tích Phân tích phận thiết bị chọn để sử dụng : đầu dò ion hóa lửa điện phận nhập mẫu với chế độ dòng (split) không dòng (splitless) Split injection (chia dòng): Page 29 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Theo sơ đô trên, phần lớn mẫu thoát split vent, phần nhỏ mẫu dẫn vào cột, thông thường tỉ lệ 1% Ở đáy cổng bơm mẫu, phần nhỏ hỗn hợp vào cột, phần lớn hỗn hợp qua Split vent Để có tỉ lệ chia ổn đinh, mẫu phân tích cần phải trộn với khí mang để có hỗn hợp đồng vào cột Split Mode sử dụng để phân tích mẫu có nồng độ cao >0.1% Splitless injection (không chia dòng): Van xả đóng mẫu lúc đầu bơm mẫu, mẫu vào cột, giới hạn phát cao toàn mẫu vào cột mà không thoát split vent Splitless Mode sử dụng cho mẫu có nồng độ thấp Tốc độ dòng qua liner cân với tốc độ dòng qua cột thấp xuống tới 0.5ml/ Đầu dò ion hóa lửa điện (FID) Page 30 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Detector FID detector có độ nhạy cao Nguyên tắc làmviệc dựa biến đổi độ dẫn điện lửa hydro đặt điện trường có chất hữu cần tách chuyển qua Nhờ nhiệt độ cao lửa hydro, chất hữu từ cột tách vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy không khí để tạo thành ion trái dấu tương ứng Các ion tạo thành chuyển điện cực trái dấu nằm hai phía lửa ( hiệu điện hai điện cực khỏang 250-300V).Dòng ion giảm áp điện trở có số cao (108-1012Ω) độ giảm hiệu điện khuếch đại ghi lại máy tự ghi Số lượng ion tạo thành (chính độ nhạy detector) phụ thuộc vào yếu tố sau: - Cấu trúc hình học detector - Tỷ lệ thành phần hydro/không khí - Nhiệt độ lửa - Cấu trúc phần tử mẫu cần xác định Sơ đồ nguyên lý hoạt động detector ion hóa lửa (FID) Hình 2.8 : Sơ đồ nguyên lý hoạt động detector FID Các hợp chất hữu đốt cháy lửa hydro/ không khí tạo htanfh ion Khi mang từ cột trộn trước với hydro đốt cháy lửa buồng đốt Một điện cực hình trụ đặt cách vài mm phía lửa để thu thập ion sinh Dòng ion đo cách đặt điện Page 31 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa đầu phun lửa điện hình trụ để hạn chế đến mức tối đa tái kết hợp ion, phải đặt điện chọn lựa vào vùng bảo hòa (vùng mà tăng điện không làm tăng dòng ion) tính hiệu tạo thành khuếch đại khuếch đại điện tử qua xử lí ghi tính hiệu Đặc điểm: - Không bị ảnh hưởng vận tốc khí mang - Thời gian tín hiệu nhỏ 0,1 giây có độ nhạy gấp 1000 detector TCD - Giới hạn phát 10-12 g/s - Độ ổn định cao bị ảnh hưởng tới thay đổi nhiệt độ tốc độ dòng - Nhiệt độ làm việc tới 400oC Tuy nhiên có điểm bất lợi phải dùng thêm hệ thống khí đốt, khí mang không dùng mẫu có khí : SO 2, CO2… Ngoài cấu tử mẫu bị phân hủy lửa nên dùng trường hợp muốn cho cấu tử qua tiếp thiết bị phân tích khác Hình 2.9 : So sánh độ nhạy loại đầu dò Trong viết, nhóm tiến hành gửi mẫu qua tìm hiểu thiết bị nơi gửi mẫu, thiết bị TCVN sắc kí khí xác định cồn thường sử dụng đầu dò ion hóa lửa với chế độ tối ưu d Thiết bị sử dụng thông số thiết bị Sử dụng thiết bị sắc kí khí Shimadzu SIL 20A/AC (theo trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TPHCM) Page 32 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Hình 2.10 : Thiết bị sắc kí Shimadzu 20A Bảng 2.2 : Các thông số thiết bị sắc kí Shimaduz 20A Lò cột Kích thước : 280x 280x 175 (mm) Thể tích L 13.7 lít Vùng hoạt động nhiệt từ 4-450oC (phòng cột), -50 đếm 450oC ( có khí CO2) Tốc độ làm lạnh : từ 450oC đến 50oC khoảng phút Đầu dò FID Nhiệt độ tối đa : 470oC Phạm vi nhiệt độ : đến 450oC, bước nhảy 0.1oC Đầu tiêm Phạm vi nhiệt độ : đến 450oC, bước nhảy 0.1oC Chế độ : dòng, không dòng, điều khiển Chương trình nhiệt độ Số dốc :20 bước nhảy 0.1oC Cài đặt chương trình : -250oC đến 250oC/ phút Điều khiển dòng khí đầu dò Phạm vi : 0-1200ml/ phút ( không khí), bước nhảy 0.1 ml/phút; 0-200 ml/phút (hidro) e Thông số sử dụng (theo TCVN 7864 – 2008) Chương trình nhiệt độ cột Chiều dài cột 100m 150m Nhiệt độ ban đầu 150C 600C Thời gian trì ban đầu 12 15 Tốc độ chương trình 300C/min 300C/min Nhiệt độ cuối 2500C 2500C Thời gian trì cuối 19 23 Page 33 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa Bộ bơm mẫu Nhiệt độ 3000C Tỷ lệ chia dòng 200 :1 Lượng mẫu 0,1µl đến 0,5µl Detector Loại Ion hóa lửa Nhiệt độ 3000C Khí nhiên liệu Hydro (∼30ml/min) Khí oxy hóa Không khí (∼300ml/min) Khí bổ sung Nitơ (∼30ml/min) Khí mang Loại Heli Vận tốc tuyến tính trung bình 21 cm/s đến 24 cm/s Bàn luận phương pháp xác định cồn Để xác định hàm lượng cồn mẫu lên men, có nhiều phương pháp vật lí, hóa học hóa lý đo tỉ trọng, cồn kế, thuốc tím, Cordebard… Mỗi phương pháp có sai số định, cần chọn phương pháp với sai số mức tối thiểu, dễ thực nhạy với mẫu cần xác định Trong mẫu lên men nhóm, với điều kiện giống nấm men Kluyvermices marxianus khả lên men tạo cồn tối đa khoảng 10%, với hàm lượng cồn thấp vậy, ta cần phải chọn phương nhạy với cồn cần xác định Với phương pháp chuẩn độ, cồn chưng cất để tăng độ tinh khiết, hạn chế thành phần trình lên men ảnh hưởng đến kết quả, thao tác đơn giản, độ nhạy cao với thị màu bền khác biệt, bị ảnh hưởng nhiệt độ nhiệt độ ảnh hưởng đến thất thoát cồn mẫu Với phương pháp GC, xem phương pháp đại sử dụng nhiều kỹ thuật phân tích nay, với đặc điểm việc trội việc định danh định lượng, cách tiến hành kết thu nhanh, với TCVN quản lý chặt chẽ, phương pháp kiểm mẫu đối chứng với việc kiểm mẫu Page 34 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa phòng thí nghiệm nhóm, từ ta tiến hành so sánh đem lại khách quan cho kết nghiên cứu Page 35 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa KẾT LUẬN Thông qua đề tài nhóm thực phương pháp kiểm mẫu giúp cho nhóm đánh giá trình lên men điều kiện tự cố định có chất ức chế nấm men Từ tính toán hiệu suất sinh cồn xác định điều kiện tối ưu cho lên men thu sản phẩm cồn nghiên cứu Ngoài phát lượng đường khử glucose sót lại canh trường suốt trình lên men để từ đánh giá khả lên men nấm men Page 36 Khảo sát khả lên men Kluyvermices marxianus điều kiện tự cố định có chất ức chế GVHD : TS Phan Ngọc Hòa TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Lê Ngọc Huyền Trang, 2013, Khảo sát khả trao đổi chất nấm men Kluyveromyces Marxianus cố định chất mang bẹ dừa nước điều kiện stress 5-HMF, trang 23 – 25 Lê Thanh Mai (Chủ biên), 2005, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB Khoa học kỹ thuật Trần Quốc Hiền, 2011, Nghiên cứu trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định gel alginate, trang 51 – 74 TCVN 7864-2008 Tài liệu Tiếng Anh Agilent Technologic, 2001, HPLC for food analysis Egerton R F (2005), Physical principles of electron microscopy, Springer science+Business media, Inc, New York, page 202 Miller G L ;1959; Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar; Analytical chemistry, Vol 31, No 3, page 426 – 428 Christian Oliveira Reinehr; Eliana Badiale Furlong, 2003, Profile of the alcohols produced in fermentations with malt contaminated with trichothecenes GC-2010 Gas Chromatopraph Instruction Manual http://biology.vn/cot-sac-ky-long-hplc/ http://www.case.vn/vi-VN/87/88/131/details.case Page 37