Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi

Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện TS LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN THỊ MINH TÚ KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006



AMPLIFICATION MOLECULAR ENGINEERING TO IDENTY CITRUS CANKER BACTERIA

GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor Student

Dr LE DINH DON TRAN THI MINH TU TERM: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

- Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua

- TS Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- TS Bùi Minh Trí và anh Nguyễn Văn Lẫm và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài

- Toàn thể lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con được như ngày hôm nay, cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Chân thành cảm ơn

Tp HCM, tháng 08 năm 2006

Sinh viên

Trần Thị Minh Tú

TÓM TẮT

TRẦN THỊ MINH TÚ, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƯỞI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ”

Giáo viên hướng dẫn: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là vi khuẩn Xanthomonas spp Đây là vi

khẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật nông học, phương pháp sinh

học phân tử nhằm định danh dòng Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây bưởi mục

tiêu hiểu rõ bản chất sinh học của dòng gây bệnh, để dễ dàng cho việc đưa ra các biện pháp phòng trừ bệnh do vi khuẩn này gây ra Đề tài được thực hiện tại phòng thực tập Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, từ 06/02/06 đến 06/08/06

Nội dung nghiên cứu:

1 Phân lập, nuôi cấy, xác định gram, quan sát hình thái trên môi trường PGA, YDC 2 Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn

phân lập được

3 Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trưng để nhận Xanthomonas sp

4 Tiến hành nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số

5 Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332

6 Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv citri

Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb

5 Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên

biệt XACR và XACF

MỤC LỤC

TRANG

Trang bìa Trang tựa

Lời cảm ơn iii

2.1 Sơ lược về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nước 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây bưởi 3

2.1.2 Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nước 3

2.1.3 Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam 4

2.1.4 Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới 4

2.2 Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) 5

2.2.1 Triệu chứng bệnh 5

2.2.2 Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X a pv citri) 7

2.3 Sơ lược vùng rDNA-ITS 8

2.3.1 Giới thiệu vùng rDNA 8

2.3.2 Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp 9

2.4 Sơ lược về hrpW gen 9

2.5 Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 11

2.5.1 Trên Thế Giới 11

2.5.2 Tại Việt Nam 12

2.6 Quy trình định danh Xanthomona sp 12

2.6.1 Quy trình định danh Xanthomonas sp theo phương pháp nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa 12

2.6.2 Quy trình định danh theo phương pháp phân tử 13

2.7 Phương pháp PCR 13

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Nội dung nghiên cứu 16

3.3 Vật liệu nghiên cứu 16

3.4 Phương pháp tiến hành 17

3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trường PGA và YDC, xác định Gram âm hay Gram dương các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi 17

3.4.2 Chủng bệnh nhân tạo 18

3.4.3 Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn 18

3.4.4 Phương pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 20

3.4.5 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen 21

3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22

3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi XACF và XACR 23

3.5.6 Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR 23

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bưởi da láng và bưởi đường cam 25

4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trường PGA và YDC 25

4.2 Chủng bệnh bệnh nhân tạo 26

4.3 Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh 28

4.4 Ly trích DNA tổng số 28

4.5 Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS 29

4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét trên lá bưởi Da Láng 6

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét trên trái bưởi Da Láng 6

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét trên cành bưởi Da Láng 7

Hình 2.4 Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS trên Xanthomonas ssp 10

Hình 2.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan giữa các dòng Xanthomonas ssp dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS 10

Hình 3.1(a) Tấm sắc ký vừa nhỏ dung dịch sắc tố 19

Hình 3.1(b) Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm 19

Hình 4.1 Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PGA nhiệt độ 28oC 25

Hình 4.2 Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường YDC ở nhiệt độ 28oC 26

Hình 4.3 Các triệu chứng bệnh sau khi chủng bốn dòng phân lập được trên lá non bưởi Da Láng quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đai 4x10 lần 27

Hình 4.4 Kết quả sắc ký trước 28

Hình 4.5 DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.2.4.4 29

Hình 4.6 Kết quả diện di sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 29

Hình 4.7 Sơ đồ các bước cơ bản định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi theo phương pháp sinh học phân tử 31

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Môi trường phân lập một số loài X campestis 14

Bảng 2.2 Đặc tính sinh hóa Xanthomonas sp 14

Bảng 3.3.Thành phần dung dịch đệm TE 20

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồiXan1330 và Xan332 22

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan332 22

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi XACF và XACR 23

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng với cặp mồi XACF và XACR 23

Bảng 4.2 Hình thái vi khuẩn được phân lập từ bưởi Da Láng và bưởi Đường Cam 25

Bảng 4.3 Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 27

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ITS : Internal Transcribed Spacer – vùng dịch mã trong nhân DNA : Deoxyribonucleotide Acid

rDNA : ribosome DNA

PCR : Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi Polymerase PGA : Potato Glucose Agar

STT : Số thứ tự ng : nano gram

µM : micro mol TE : Tris EDTA

µg : micro gram µl : micro lit

TAE : Tris Acetic EDTA bp : base pair

dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate ISGs : intraspecific groups

SDS : sodium dodecyl sulfate

EDTA : ethylenediamine – tetraacetic acid IGS : intergenic spacer

Phần 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho nhiều loại cây nhiệt đới phát triển Đặc biệt các loại cây ăn quả rất đa dạng và phong phú về

chủng loại Trong đó bưởi (Citrus grandis L Rutaceae) là loại cây ăn quả thuộc nhóm

cây có múi được trồng phổ biến và lâu đời tại các vùng đông Nam Bộ với các vùng trồng bưởi lâu đời và nổi tiếng như Vĩnh Cửu (Đồng Nai), Tân Uyên (Bình Dương) Cây bưởi có tuổi thọ lâu hơn các loại cây có múi khác, thời gian bảo quản cũng lâu hơn Bưởi còn là loại quả giàu vitamin được thị trường trong nước cũng như ngoài nước ưa chuộng về hương vị cũng như dinh dưỡng nên người trồng bưởi có thu nhập cao và ổn định hơn so với các loại cây nông nghiệp khác Vì vậy, cây bưởi đã góp phần cải thiện và nâng cao đời sống của người dân

Tuy nhiên cho đến nay diện tích trồng bưởi không tăng Mặt khác, giống bưởi năng suất và phẩm chất rất tốt là cây Bưởi Đường Da Láng lại giảm rõ rệt Nguyên

nhân chính là do bị nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp gây nên

Vi khuẩn không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng quả nhưng gây nên những vết sần sùi trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trường Ngoài ra, vi khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của

cây Không chỉ gây hại trên cây bưởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp gây hại hầu hết

các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng

Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử” Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phương pháp phòng và trị

bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bưởi Đường Da Láng mang lại hiệu quả kinh tế cao

- Tính toán, thiết lập được phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm

1.4 Giới hạn của đề tài

- Chỉ xác định được chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi Da Láng,

bưởi Đường Cam là Xanthomonas sp

- Chưa giải được trình tự sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS, chưa thực

hiện được phản ứng PCR trên hrpW để định danh chính xác chủng vi khuẩn

gây bệnh ở mức độ loài

Phần 2 TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nước 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây bưởi

Cây có múi hiện đang trồng ở nhiều nước trên thế giới đều có nguồn gốc từ các nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á Đường ranh giới của vùng xuất xứ cây ăn quả có múi nằm ở dãy chân núi Himalaya, phía đông Ấn Độ qua miền nam Trung Quốc, về phía nam đường ranh giới vùng đi qua Australia (theo Taraka, 1971)

Lịch sử trồng cây có múi ở nước ta xuất hiện từ rất lâu đời cách đây 3000-4000 năm (Đường Hồng Dật) Ngày nay, cây có múi được trồng trên khắp đất nước ta từ Lào Cai đến Cà Mau, từ Quảng Ninh đến Lai Châu Đặt biệt là bưởi với nhiều giống được trồng ở nước ta: bưởi Da Láng, bưởi Năm Roi, bưởi Lông Cổ Cò, bưởi Đường Cam, bưởi Da Xanh, bưởi Lông Hồng.Các vùng trồng bưởi nổi tiếng ở nước ta như Đồng Nai và các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long

2.1.2 Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nước

Cây ăn quả có múi như cam, quýt, bưởi là một trong những loại quả cao cấp được nhiều người ưa chuộng và được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới Giá trị dinh dưỡng cây ăn quả có múi rất cao Trong thành phần thịt quả có chứa 6-12% đường, chủ yếu là sacaroza Hàm lượng vitamin C trong quả là 40-90% mg/100g tươi Các loại axit hữu cơ chứa trong thịt quả là 0,4-1,2%, trong đó có nhiều axit có hoạt tính sinh học cao Trong quả còn chứa các chất khoáng và dầu thơm Tinh dầu được cất từ vỏ quả, lá, hoa được dùng trong công nghiệp thực phẩm Đặc biệt là chanh yên, một tấn quả có thể đạt được 67 lít tinh dầu, tinh dầu ca quýt có giá trị khá cao trên thị trường quốc tế

Ở nhiều nước trên thế giới, từ những thời xa xưa, người ta đã biết dùng các

thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh Ở thế kỷ thứ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc,

Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da

Ở nước ta người dân đã dùng cây, lá, hoa, quả các loại cây ăn có múi để phòng và chữa bệnh từ thời xa xưa Lê Quý Đôn vết trong sách “ Vân đài loại ngữ” “Quýt

4

vàng là thượng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩn, vỏ quýt có tính khoan trung hạ khí”, vỏ quýt có tên dược liệu là “ trần bì” được sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cổ truyền

Giá trị kinh tế, cây ăn quả có múi là cây lâu năm chóng cho thu hoạch, cây cam quýt có thể sống và chóng cho thu hoạch quả trong vòng 25-30 năm vẫn cho năng suất cao, đạt từ 100-250 kg quả/1cây trong một vụ.(Đường Hồng Dật, 2000)

2.1.3 Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam

Theo thống kê của ngành nông nghiệp thì đến năm 1993 diện tích trồng cam quýt ở nước ta là 27.640 ha, tăng hơn năm 1989 năm là trên 10.000 ha (năm 1989-17.205ha) Những năm gần đây diện tích trồng cam quýt ở một số nơi, nhất là ở một số tỉnh ĐBSCL tăng nhiều, trong khi một số tỉnh miền trung như Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, diện tích trồng cam quýt bị giảm xuống, năm 1999 cả nước có vào khoảng trên dưới 30.000 ha

Sản lượng cam quýt ở nước ta năm 1993 được thống kê là 163.778 tấn, tăng khoảng 63.000 tấn so với năm 1989 (100.998 tấn) Năm 1999 ước tính sản lượng cây có múi trong cả nước là 300.000 tấn

Điều kiện đất đai và khí hậu nước ta phù hợp cho phát triển cây ăn quả có múi Tuy nhiên, quá trình tăng chậm và quá trình phát triển cây ăn quả có múi diễn biến thất thường ở từng vùng sản xuất Ở một số vùng trồng cam nổi tiếng trước đây như vùng cam Bố Hạ (Bắc Giang), vùng cam Xã Đoài (Nghệ An), không những diện tích không tăng lên mà còn giảm xuống (theo Đường Hồng Dật, 2000)

Năm 1995, diện tích trồng cây ăn quả trong cả nước là 346.400 ha trong đó ĐBSCL 175.000 ha (50,7%), trung du miền núi Bắc Bộ 47.600 ha (13,7%), ĐBSH 33.800 ha (9,8%), miền Đông Nam Bộ 32.700 ha (9,5%), khu IV cũ 27.400 (7,9%), duyên hải miền Trung 20.600 ha (6,9%), Tây Nguyên 8.600 ha (2,5%)

Theo Tổng cục thống kê năm 1996, vùng ĐBSCL đứng đầu về sản lượng cũng đứng hàng đầu chiếm tỷ trọng 49, 05% (Trần Thế Tục, 1998)

2.1.4 Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới

Trong những năm nửa sau thế kỷ XX, sản xuất cam quýt trên thế giới tăng nhanh Theo tài liệu của Tổ chức lương thực và nông nghiệp của Liên hợp quốc (FAO)

trong vòng 20 năm (từ năm 1975 đến năm 1995), sản lượng cam quýt trên thế giới tăng từ 22 triệu tấn lên đến 48 triệu tấn, tăng cao nhất là cam, quýt đỏ rồi đến chanh yên, bưởi chùm và chanh Trong vòng 15 năm tính từ năm 1970 đến năm 1984, sản lượng cam tăng bình quân là 51%, quýt 7,5%, chanh 4,7%, bưởi chùm là 4,3%/ năm Tổng sản lượng cam quýt trên thế giới trong những thập niên 90 của thế kỷ XX bình quân hàng năm là 60-70 triệu tấn với tổng diện tích là 2,5 triệu ha, tập trung ở các nước có khí hậu á nhiệt đới và một phần nhiệt đới ở các vĩ độ cao hơn 20-22oC bắc và nam bán cầu

Hiện nay có 75 nước trồng cam quýt trên thế giới được chia thành 4 khu vực : Châu Mỹ, các nước Địa Trung Hải, các nước Châu Phi và các nước Châu Á Những nước trồng nhiều cam quýt nhất là Mỹ 9,6 triệu tấn /năm, Braxin 7,2 triệu tấn/ năm, Tây Ban Nha 1,7 triệu tấn / năm

Nhật Bản cung cấp10% sản lượng cam quýt trên thế giới với 2,7 triệu tấn vào những năm 20 của thế kỷ XX, trong đó chủ yếu là quýt Unshiu, loại quýt này chiếm 49,2% tổng sản lượng quả cam quýt của Nhật (Đường Hồng Dật, 2000)

Thống kê năm 1967 của FAO cho biết tổng sản lượng về trái có múi là 28.902.000 tấn, trong đó cam và quýt chiếm 23.434.000 tấn tức 81% và bưởi (cộng với bưởi chùm ) chỉ có 2.286.000 tấn tức 7,9% chưa bằng 1/10 cam, quýt Dẫn chứng là

Mỹ chỉ sản xuất bưởi chùm (Citrus paradis ), không sản xuất bưởi (Citrus grandis) đã

chiếm tới 1.161.000 tấn tức 70,7% tổng số bưởi và bưởi chùm Trong khi cả châu Á trong đó có hai nước lớn nhất là Ấn Độ và Philippin, trong cả bưởi và bưởi chùm chỉ sản xuất 59.000 tấn tức 2,6% Hiện nay, sản lượng trái có múi cả thế giới đã vượt quá 50 triệu tấn, gần gấp đôi năm 1967, song tỷ lệ trên đây không thay đổi nhiều và phần của bưởi còn thấp hơn nữa.(Vũ Công Hậu, 1996)

2.2 Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson)

2.2.1 Triệu chứng bệnh

Bệnh loét hại cam quýt ở tất cả các bộ phận của cây trên mặt đất, làm rụng lá, quả, cây cằn cọc chóng bị tàn Ở vườn ươm, khi bị bệnh nặng cây con dễ chết Quả bị bệnh có phẩm chất kém không thể xuất khẩu và cất trữ được Nhiều nước trồng cam, quýt trên thế giới đã cấm nhập những cây, mắt ghép, quả bị bệnh Bệnh phá hoại ở

6

nhiều nước và đã phát triển thành dịch ở khắp vùng châu Á nhiệt đới-Thái Bình Dương Bệnh còn thấy ở các nước châu Mỹ, châu Phi Ở nước ta bệnh hầu như phá hại ở tất cả các vùng trồng cam quýt, gây thiệt hại đáng kể làm ảnh hưởng tới nguồn hàng xuất khẩu và tiêu dùng trong nước

Bệnh thường bắt đầu xuất hiện ở lá non Ban đầu vết bệnh là những chấm nhỏ có đường kính dưới 1mm màu trắng vàng thường thấy ở mặt dưới lá Sau đó vết bệnh mở rộng hơn phá vỡ biểu bì mặt dưới lá Xung quanh vết bệnh có vầng tròn dạng giọt dầu màu nâu hoặc xanh tối Sau 2-3 tuần vết bệnh phát triển thành loét hình tròn màu nâu xám Khi vết loét già hóa gỗ rắn lại hình dạng vẫn còn hoặc không định hình Trên cây bưởi vết bệnh khoảng 8mm

Ở quả vết bệnh cũng tương tự như ở lá.Vết bệnh rắn xù xì màu nâu ở giữa lõm, mép ngoài nổi gờ lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt Toàn thể chiều dày của vỏ quả có thể bị loét nhưng không bao giờ vết loét ăn sâu vào ruột quả, bệnh nặng có thể làm cho quả biến dạng ít nhiều

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét trên lá bưởi Da Láng

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét trên trái bưởi Da Láng

Ở cành vết bệnh cũng tương tự như ở lá nhưng sùi lên tương đối rõ ràng, ở giữa vết bệnh không lõm xuống hoặc lõm xuống không rõ rệt Vết bệnh còn xuất hiện ở gai cũng giống như ở cành cây

2.2.2 Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X a pv citri)

Vi khuẩn có hình gậy ngắn, kích thước khoảng 1,5-2 x 0,5-0,75µm, hai đầu tròn có một lông roi ở đầu, có thể nối liền thành chuỗi, có vỏ nhờn nhuộm gram âm, háo khí Độ dài genome khoảng 5 Mbp Sinh trưởng dễ dàng trên môi trường agar –glucose –peptone, khuẩn lạc hình tròn, sáng, bóng, màu vàng sáp

Đặc trưng để phân biệt vi khuẩn Xanthomonas sp với loại vi khuẩn màu vàng khác

là nó có thể sinh trưởng thành khuẩn lạc màu vàng sáp trên miếng lát cắt củ khoai tây Phạm vi nhiệt độ phát triển là 5-35oC, thích hợp 20-30oC Ở nhiệt độ 52oC trong10 phút vi khuẩn chết Vi khuẩn phát triển và hoạt động trong phạm vi pH 6,1-8,8, thích hợp ở pH 6,6 Vi khuẩn có khả năng chịu hạn ở nhiệt cao, trong điều kiện phòng thí nghiệm có thể tồn tại 130 ngày Bệnh loét cam, bưởi là bệnh hại có tính nhiệt đới, vi khuẩn gây bệnh phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ướt, sức chống hạn và lạnh cao Vi khuẩn tồn tại trong vết lá, cành bệnh từ năm này qua năm khác

Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam có thể tồn tại qua đông trong đất, nhưng Pltier và Frederich lại cho rằng vi khuẩn không thể tồn tại qua đông ở trong đất hoặc trong lá rụng Lee (1920) và Fulton (1925) cho rằng vi khuẩn bệnh loét cam không đấu tranh được với tập đoàn vi khuẩn khác nên dễ dàng chết trong đất Loucks

Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét trên cành bưởi Da Láng

8

(1930) đã chứng minh rằng vi khuẩn ở trong đất không vô trùng chỉ sống được 6-13 ngày nhưng trong đất vô trùng có thể tồn tại được 150 ngày Theo Rao và Hingorant ở đất vô trùng, vi khuẩn sống được 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống được 17 ngày Cũng từ hai tác giả trên thời gian sống của vi khuẩn ở những lá cây chết rụng xuống đất khoảng 6 tháng (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Vào mùa mưa trời ẩm ướt vi khuẩn từ trong vết bệnh cũ hoạt động, truyền lan đi trong mưa, gió hoặc côn trùng, chim Vi khuẩn cũng có thể truyền dễ dàng qua quần áo, nông cụ Vi khuẩn rơi trên quả, lá, cành sẽ xâm nhập qua vết thương, khí khổng

Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh: bệnh phát sinh do 3 yếu tố cơ bản tác động lẫn nhau quyết định là “cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh-điều kiện ngoại cảnh môi trường” (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau:

- Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ

châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh

- Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ,

gây bệnh chủ yếu trên chanh nhỏ, cam chua, bưởi

- Loại C, cũng do Xanthomonasdis axonopodis pv aurantifolii nhưng gây bệnh

trên chanh nhỏ và cam chua

- Loại A* được phát hiện ở Oman, Saudi Arabia, Iran và Idian chỉ gây bệnh trên chanh (http://en.wikipedia.org/wiki/Citrus_canker)

2.3 Sơ lược vùng rDNA-ITS 2.3.1 Giới thiệu vùng rDNA

Những gen mã hóa rRNA được tìm thấy trong vùng rDNA Sản phẩm của những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom có chức năng tổng hợp protein Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào) Trình tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn Gene rDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và

prion) Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau được đánh dấu giống nhau Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp xếp chính xác, làm cho những khác biệt dễ dàng để đánh giá Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gene rDNA từ bất cứ loài vi khuẩn nào Trình tự của rDNA 16S đã được xác định cho nhiều loài Sự thật, không có bất kỳ gen nào khác đặc trưng cho nhiều loài như vậy

Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi Những universal primer được thiết kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ (600 – 700 bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30000 bản trong mỗi tế bào (Dubouzet and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA Điều này làm cho vùng ITS trở thành một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng như các nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993; Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999) (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005)

2.3.2 Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp

Phân tích mối quan hệ loài dựa trên vùng 16s-23s rDNA bằng cách thiết kế

cặp primer Xan1330 và Xan332 dựa trên vùng gen 16s-23s rDNA ở Xanthomonas

bệnh nên người ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh,

10

chính xác loài gây bệnh Phương pháp phát hiện nhanh bằng primer chuyên biệt này nhanh, chính xác hơn các phương pháp nuôi cấy

Hình 2.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan giữa các dòng

Xanthomonas sp dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS (Edmilson R

Gonealves và ctv, 2002)

Hình 2.4 Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS của Xanthomonas sp

Trình tự primer Xan1330 và Xan332 được thiết kế trên vùng 16s-23s (Edmilson R Gonealves và ctv, 2002)

Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’ Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’

Người ta dựa vào trình tự hrpW gen của X a pv citri (Genbank Accession No

AE008923) thiết kế cặp primer XACR, XACF chuyên biệt phát hiện nhanh chính nó Sản phẩm PCR thu được là đoạn có kích thước 561 bp (Dong Suk Park và ctv, 2006)

XACR 5’CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’ XACF 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’

2.5 Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam 2.5.1 Trên Thế Giới

Năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di

truyền giữa 17 loài Xanthomonas sp bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự

sản phẩm PCR.Phản ứng được thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 được thiết kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS

Năm 2003, C J Vernière và ctv đã nghiên cứu sự phát triển và biểu hiện triệu

chứng bệnh của X a pv citri trên cây có múi C J Vernière và cộng sự đã kết luận

rằng để giảm bệnh loét nhà nông phải hạn chế tạo vết thương cho cây, sự tăng trưởng

quá nhiều chồi non và sự tăng trưởng của quần thể X a pv citri Hệ thống chắn gió là

biện pháp hạn chế sự lan tràn bệnh hiệu quả nhất Các tác nhân sinh học khác như ấu trùng của côn trùng chít hút cũng là phương tiện truyền bệnh nguy hiểm Khả năng nhiễm bệnh của ký chủ có liên quan đến giai đoạn phát triển của cây

Năm 2003, Jung-Gun- Kim và ctv, đã mô tả đặc tính của vùng gây bệnh hrp của

X a pv glycines Vùng này gồm vùng hrp gen, vùng hcr gen và vùng hca gen.Trong đó vùng hrp và hcr mã hóa cho loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn X a pv glycine Đặc tính của vùng hrp gen này là chứa

nhiều gen độc, thành phần G+C thấp

Năm 2006, Dong Suk Park và ctv, đã thực hiện thành công phương pháp PCR

với mồi chuyên biệt trên hrpW gen để phát hiện nhanh và chính xác X a pv.citri, là

loài gây bệnh loét trên cây có múi tại châu Á

2.5.2 Tại Việt Nam

Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Cúc -Phạm Thị Hoàng Oanh, trường Đại Học Cần Thơ, có nghiên cứu về dịch hại trên cam, quít, chanh, bưởi Nghiên cứu này tập hợp

12

hầu hết các thông tin về dịch hại phổ biến tại Việt Nam Trong nghiên cứu này, tổng cộng có trên 30 loài côn trùng và 15 loại bệnh phổ biến trên nhóm cam, quít, chanh, bưởi đã được trình bày và mô tả qua các phần như đặc điểm hình thái, sinh học, sinh thái, sự gây hại, triệu chứng và các biện pháp đối phó

Năm 2005, Vi Thị Thanh Hường, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu các tác nhân và biện pháp phòng trừ biện pháp phòng trừ bệnh loét trên bưởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu - tỉnh Đồng Nai Tác giả đã phân lập được một số dòng vi khuẩn gây bệnh nhưng chưa định danh được Đồng thời, tác giả cũng xác định một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh loét

2.6 Quy trình định danh Xanthomona sp

2.6.1 Quy trình định danh Xanthomonas sp theo phương pháp nuôi cấy, thực

hiện phản ứng sinh hóa

1 Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập dòng gây bệnh (Bảng 2.1) 2 Xác định dựa vào sắc tố vàng Xanthomonadin

(Phương pháp thực hiện sẽ nêu ở phần 3.4.3 phương pháp và vật liệu)

3 Thực hiện thí nghiệm sinh hóa và quan sát hình thái (Bảng 2.2)

a) Khả năng phát triển trong môi trường YS ở 35oC trong 10-12 ngày

b) Kiểm tra sự tạo nhầy, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường GYCA hoặc YDC trong 2-3 ngày

c) Kiểm tra khả năng phân hủy protein: là thử nghiệm khả năng phân hủy casein trong dịch sữa có chứa chất chỉ thị bromcresol purple đã khử trùng Dịch sữa và khuẩn được ủ 27oC quan sát phản ứng phân hủy

d) Kiểm tra thủy phân asculin: phản ứng dương tính khi dịch đổi màu nâu tối (môi trườngYS lỏng + ferric ammonium citrate 0,05% và asculin 0,1%, pH 6,8)

e) Kiểm tra khả năng thủy phân gelatin f) Kiểm tra khả năng tạo urease

g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates

4 Kiểm tra tính gây bệnh

Khẳng định độc tính dòng phân lập được bằng cách chủng nhân tạo Ký chủ được chủng hoàn toàn là cây sạch bệnh Tạo vết thương trên cây ký chủ Sau đó nhỏ dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bước trên lên vết thương Đặt cây ký chủ đã chủng vào điều kiện tối ưu cho bệnh phát triển Thông thường thì ở nhiệt độ 27o

C-30oC, trong vòng 7 ngày sau khi chủng thì thấy triệu chứng bệnh

2.6.2 Quy trình định danh theo phương pháp phân tử

Dựa trên quy trình định danh bằng phương pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh hóa nhưng bổ sung thêm một số phương pháp sinh học phân tử để định danh chính xác ở mức loài Quy trình gồm các bước sau:

1 Phân lập và kiểm tra hình thái, sinh hoá trên các môi trường khác nhau như NA, YGA, YDC, KB

2 Tiến hành kiểm tra dòng phân lập được bằng phản ứng ELISA để kiểm tra và phân loại dựa trên độc tính gây bệnh

3 Kiểm tra sự oxy hóa nguồn cacbon (khả năng tạo axit từ đường cacbon) 4 Kiểm tra khả năng gây bệnh của dòng phân lập bằng phương pháp chủng