Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN

Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƯƠNG PHÁP

TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN

Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN

Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƯƠNG PHÁP

TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09 / 2007

LỜI CẢM ƠN

Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con trưởng thành như ngày hôm nay, cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cám ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm cùng thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở trường

Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Thầy Zhang Liqun ở Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc đã cung cấp mẫu vi

khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir)

chứa plasmid pRK600 và các tài liệu phục vụ cho thí nghiệm

Ban giám đốc cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận

Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này Tất cả các anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt những năm học cũng như thời gian thực hiện khóa luận

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên

Trần Nguyễn Thúy An

iv

TÓM TẮT

Đề tài “Tối ưu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy

An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện Địa điểm: trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007

Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu

nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng Việc phát

triển các phương pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn

nghiên cứu những hệ thống này Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã được phát triển như những phương pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trường

Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea

victoria đã được chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất Những dòng Pseudomonas fluorescens được đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện

qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh

Nội dung nghiên cứu

1 Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối

kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trường KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu

2 Khảo sát các điều kiện tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

3 Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp

SUMMARY

Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city,

“Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas

fluorescens by triparental mating” This subject was conducted at Nong Lam

University from March to August in 2007

Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent

because of their strongly antifungal ability and their broad host range The

development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a

population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these systems In response to this problem, novel molecular markers have been developed recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic activity of target microorganisms in a certain environment Among them, the green

fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the most powerful tool The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be

conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour

Researching contents are

1 Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly

antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce under short wave length ultraviolet light

2 Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into

Pseudomonas fluorescens by triparental mating

3 Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens

after conjugation

Obtaining results

The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected

The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by

triparental mating has been obtained

GFP Green Fluorescent Protein Hfr High frequency recombinance IS Insert sequence

MCS Multi cloning site

PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA

UV Ultraviolet (light) w/v Weight for volume

NST Nhiễm sắc thể

TGE Transposable genetic element

dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate LB Luria – Bertain

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cơ chế lai giữa F+ và F

7

Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F+ 8

Hình 2.3 Cơ chế lai giữa Hfr và F 8

Hình 2.8 Cơ chế phương pháp tiếp hợp 3 thành phần 15

Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của thiết bị electroporation 17

Hình 2.10 Quy trình biến nạp bằng phương pháp CaCl2 18

Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP 24

Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp 29

Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trường KB 36

Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 38

Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 39

Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 40

Hình 4.5 Đối chứng trên môi trường M9 41

Hình 4.6 Kết quả đối chứng 45

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan

trong thí nghiệm 30 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số

dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 34

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của

một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 35 Bảng 4.3 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích

hợp làm đối tượng nghiên cứu 36 Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 thay đổi

theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37 Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 thay đổi

theo tỉ lệ vi khuẩn 38 Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trường M9 thay đổi

theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trường KB 40

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn 4

2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị 11

2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị 11

2.2 Plasmid 13

2.3 Các phương pháp thường dùng để chuyển DNA plasmid 15

2.3.1 Phương pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) 15

2.3.2 Phương pháp điện biến nạp 16

2.3.2.1 Phương pháp 16

2.3.3 Phương pháp Calcium chloride 18

2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học 19

2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20

2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20

2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 21

2.6 Protein GFP 24

2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm 24

2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp 25

Chương 3 28

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 28

3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 28

3.2.1 Vật liệu 28

3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp 28

3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 29

3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 29

3.2.2 Các loại môi trường dùng trong nuôi cấy vi khuẩn 31

3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu 31

3.3 Phương pháp nghiên cứu 31

Chương 4 34

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Kết quả 34

x

4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trường KB 36

4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần 37

4.1.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37

4.1.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn 38

4.1.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trường KB 39

4.1.3.4 Kết quả đối chứng 40

4.2 Thảo luận 41

4.2.1 Các thông số tối ưu cho quá trình tiếp hợp 41

4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần 41

4.2.3 Môi trường tối ưu cho chọn lọc 43

4.2.4 Kết quả đối chứng 42

4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ưu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44 Chương 5 47

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Thuốc trừ sâu hóa học được sử dụng trong sản xuất nông nghiệp đem lại cho chúng ta năng suất cao và nhiều lợi ích kinh tế, tuy nhiên chúng cũng đem đến những vấn đề như ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Do đó, nhu cầu ngày càng cao trong nông nghiệp là tìm ra phương pháp bảo vệ cây trồng hòa hợp với hệ sinh thái tự nhiên Kiểm soát sinh học là một sự lựa chọn thay thế có nhiều tiềm năng trong việc ngăn cản sự tàn phá do bệnh cây trồng mà không gây ô nhiễm

Kiểm soát sinh học liên quan đến việc sử dụng vi sinh vật để ức chế bệnh cây và tăng cường sức khỏe cây trồng Nó đặc biệt thích hợp để ngăn chặn những bệnh từ đất mà việc sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học cho đến nay vẫn chưa đem lại hiệu quả

Kháng sinh được cho là một trong những cơ chế quan trọng nhất trong việc kiểm soát sinh học những bệnh từ đất Nhiều loài vi khuẩn sử dụng trong những nghiên cứu kiểm soát sinh học là những loài có thể tạo ra kháng sinh

Agrobacterium tạo ra agrocin 84 và 434 có nguồn gốc từ nucleoside Chủng Baccillus kiểm soát bệnh cây trồng tạo ra lipopeptide fengycin, một phức hợp

aminopolyol zwittermycin A và kanosamine Tác nhân kiểm soát sinh học

Pseudomonas là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng tạo ra kháng

sinh Chúng tạo ra một chuỗi những kháng sinh phenolic, như là diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), pyoluteorin, pyrrolnitrin, và ít nhất 4 loại phenazine khác nhau Bên cạnh đó, chúng có phổ kí chủ rộng, bao gồm cà chua, bí, cà rốt, và bắp cải Những điều kiện trên đem đến cho chúng tiềm năng phát triển như một loại thuốc trừ sâu sinh học đối với nhiều loại cây trồng Vì vậy, việc

2,4-nghiên cứu xác định khả năng định cư của vi khuẩn Pseudomonas trên rễ cây trồng

2

rất quan trọng Cần phát triển một phương pháp hữu hiệu để quan sát những tế bào vi khuẩn riêng lẻ trong một tập đoàn vi khuẩn trong những mô hình thí nghiệm và môi trường tự nhiên như trong biofilm hay trên rễ cây trồng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này

Protein green fluorescent (gfp) từ loài sứa Aequorea victoria đã được chứng

minh là có giá trị trong nhiều nghiên cứu sinh học khác nhau Theo Bloemberg và

ctv (1997) gfp mang lại khả năng nghiên cứu nghiên cứu tế bào mà không phải phá

hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh Thêm vào đó,

những tế bào được đánh dấu gfp có thể quan sát bằng kính hiển vi có gắn bộ lọc

huỳnh quang thông thường nếu được kích thích ở bước sóng thích hợp, đáp ứng đầy đủ tính chất cho một hệ thống “marker gene”, “reporter gene” nhằm kiểm soát khả năng định cư của vi khuẩn đối kháng trên đất hay cây trồng Để đánh dấu vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens với marker GFP chúng ta có thể sử dụng nhiều phương

pháp, trong đó tiếp hợp ba thành phần là một trong những phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có chi phí thấp

Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu quy trình

chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp

1.2 Mục đích

1- Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối

kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trường KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm

2- Khảo sát các điều kiện tối ưu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần

1.3 Yêu cầu

Chọn lọc được dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối

kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trường KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm

Xây dựng được quy trình tiếp hợp plasmid pUT-gfp vào vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens bằng phương pháp tiếp hợp ba thành phần tối ưu cho

dòng vi khuẩn nhận

Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp

Chuyển gene ở vi khuẩn chỉ đi theo một hướng duy nhất là từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Thể cho thường chỉ truyền đi một phần nhỏ DNA của chúng nên không tạo thành các hợp tử hoàn chỉnh mà chỉ tạo thành các hợp tử không hoàn chỉnh Các gene của vi khuẩn thường chỉ truyền trong cùng loài nhưng thỉnh thoảng sự chuyển gene tới các loài khác cũng có thể xảy ra

2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn

2.1.2.1 Biến nạp (transformation)

Biến nạp là phương pháp chuyển gene nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong môi trường xung quanh của thể nhận, các DNA này có nguồn gốc từ thể cho

Các yếu tố ảnh hưởng đến biến nạp

Kích thước DNA: DNA mạch đôi có trọng lượng ít nhất 5x105 dalton cho kết quả biến nạp tốt nhất (Mayer, 2007) Do đó, biến nạp dễ bị ảnh hưởng bởi các nuclease có trong môi trường

Tính khả nạp của thể nhận: một số vi khuẩn có thể hấp thụ DNA một cách tự nhiên Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiện điều đó vào một thời kì cụ thể trong chu kì sinh trưởng khi chúng tạo ra một loại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến Ở giai đoạn này, vi khuẩn được gọi là khả nạp Những loài vi khuẩn khác thì không thể thu nhận DNA một cách tự nhiên nhưng ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách xử lý với hóa chất (ví dụ như CaCl2)

Các giai đoạn trong biến nạp

1 Thu nhận DNA: sự hấp thu DNA ở vi khuẩn G- và G+ khác nhau Vi khuẩn G+ thu nhận DNA dưới dạng mạch đơn còn mạch bổ sung được tạo thành trong thể nhận Trái lại, vi khuẩn G- thu nhận DNA mạch đôi

2 Tái tổ hợp tương đồng: sau khi DNA từ thể cho được thu nhận, xuất hiện một sự tái tổ hợp qua lại giữa NST và DNA từ thể cho Sự tái tổ hợp này đòi hỏi tính tương hợp và gây ra sự thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận

3 Sự tái tổ hợp đòi hỏi các gene điều khiển tái tổ hợp ở vi khuẩn (recA, B, và C) và tính tương đồng giữa các DNA liên quan Kiểu tái tổ hợp này gọi là tái tổ hợp chung hay tái tổ hợp tương đồng Vì đòi hỏi sự tương đồng, chỉ DNA từ các loài vi khuẩn có mối liên quan gần mới có nhiều khả năng biến nạp thành công Tuy nhiên, cũng có những trường hợp hiếm chuyển gene xảy ra giữa những loài vi khuẩn ít liên quan

Về tầm quan trọng, biến nạp xảy ra trong tự nhiên có thể dẫn đến sự gia tăng độc tính Ngoài ra, biến nạp còn được sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp

2.1.2.2 Tải nạp (transduction)

Tải nạp là quá trình chuyển thông tin di truyền từ thể cho sang thể nhận nhờ 1 bacteriophage (hay phage)

6

Lớp vỏ của phage có thể bảo vệ DNA không bị ảnh hưởng bởi các nuclease trong môi trường Hầu hết các trường hợp chuyển gene bằng con đường tải nạp xảy ra trong cùng loài Tuy nhiên, đối với phage có phổ kí chủ rộng thì chuyển gene cũng có thể xảy ra giữa các loài Khả năng tải nạp của phage liên quan đến vòng đời của chúng Thông thường người ta chia tải nạp thành hai loại là tải nạp phổ biến và tải nạp đặc hiệu

Tải nạp phổ biến là quá trình tải nạp mà bất kì gene nào của vi khuẩn cho cũng có tiềm năng được chuyển qua vi khuẩn nhận Phage làm trung gian tải nạp phổ biến sẽ làm gãy DNA tế bào chủ thành những mảnh nhỏ Trong quá trình chúng gói DNA vào các hạt phage nhờ cơ chế “headfull”, thỉnh thoảng một số mảnh của DNA tế bào chủ cũng được gói ngẫu nhiên vào lớp vỏ của phage Do đó, bất kì gene nào từ thể cho cũng có khả năng được chuyển đi miễn là kích thước của chúng vừa với phần đầu của phage Khi phage có chứa DNA của thể cho xâm nhiễm vào thể nhận, DNA thể cho sẽ xâm nhập vào thể nhận và xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng thay thế DNA giữa thể cho và thể nhận

Tải nạp đặc hiệu: là quá trình tải nạp mà chỉ có những gene nhất định nào đó từ thể cho có thể chuyển sang thể nhận Những phage khác nhau có thể chuyển những gene khác nhau nhưng 1 phage cụ thể nào đó chỉ chuyển được những gene nhất định nào đó Tải nạp đặc hiệu có trung gian là phage tiềm tan hay phage ôn hòa, gene nào được chuyển phụ thuộc vào vị trí mà prophage chèn vào NST

Trong quá trình tách ra của prophage, thỉnh thoảng xảy ra lỗi làm một số DNA của tế bào chủ cũng được tách ra cùng với DNA phage Chỉ có những DNA của tế bào chủ ở 2 phía nơi prophage chèn vào mới có thể được chuyển Sau khi nhân lên và được phóng thích, các phage xâm nhiễm vào thể nhận Sự tiềm tan hóa xảy ra giúp các gene từ thể cho được chuyển ổn định.Thể nhận lúc này có hai bản sao của gene được chuyển Cũng có thể xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng giữa các gene của thể cho và thể nhận

Về tầm quan trọng, sự biến đổi tiềm tan (phage) xuất hiện trong tự nhiên là nguồn tạo ra các chủng vi khuẩn độc

Các kiểu giới tính ở vi khuẩn

Thể cho: vi khuẩn có khả năng của 1 thể cho nếu trong tế bào có sự hiện diện của yếu tố giới tính F Yếu tố F là 1 đoạn DNA dạng vòng có khả năng tự sao chép trong tế bào, chúng là 1 đơn vị sao chép độc lập còn được gọi chung là plasmid Yếu tố F có những gene cần thiết cho sự tự sao chép và khả năng truyền DNA của chúng cho thể nhận Yếu tố F còn mã hóa cho khả năng tạo pili giới tính trên bề mặt vi khuẩn Các pili này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiếp hợp

Thể nhận: vi khuẩn là 1 thể nhận khi chúng không có yếu tố F

Các trạng thái tồn tại của yếu tố F

(i) F+: vi khuẩn được gọi là F+ khi chúng có chứa yếu tố F, mà yếu tố F trong trường hợp này chỉ chứa các gene cần thiết cho sự tự sao và chuyển DNA, không có gene nào của NST được kết hợp vào

(iii) F’: trong trường hợp này yếu tố F độc lập với NST của tế bào chủ nhưng chúng có mang một số gene của tế bào chủ F’ tạo thành khi tách yếu tố F ra khỏi NST trong 1 thể Hfr Thỉnh thoảng khi yếu tố F được

tách ra, các gene ở 2 bên có thể được tách ra theo tạo thành thể F’ Khi lai F’ với F-

, F- sẽ trở thành F’ còn F’ vẫn là F’ Mức độ chuyển gene cao với các gene của NST nằm trên F’ và thấp với các gene vẫn nằm trong NST thể cho

Về tầm quan trọng, đối với vi khuẩn G- đây là con đường chính để chuyển gene Chuyển gene có thể xảy ra giữa các loài vi khuẩn khác nhau Việc truyền tính kháng nhiều loại kháng sinh bằng con đường tiếp hợp hiện là vấn đề lớn trong việc chữa trị các bệnh cho vi khuẩn Vì thể nhận sẽ trở thành thể cho sau khi nhận plasmid nên có thể dễ dàng hiểu được tại sao 1 gene kháng kháng sinh chứa trên plasmid có thể nhanh chóng chuyển 1 quần thể nhạy thành 1 quần thể kháng với kháng sinh đó Vi khuẩn G+ cũng có những plasmid chứa các gene kháng với nhiều loại kháng sinh, các gene này có thể được chuyển đi bằng con đường tiếp hợp hay tải nạp Theo Mayer (2007), cơ chế tiếp hợp ở vi khuẩn G+ hơi khác với vi khuẩn G-đó là thể cho sẽ tạo 1 chất dính gây ra sự kết hợp với thể nhận và chuyển DNA

Cameron (2007) cho rằng tiếp hợp là một phương pháp rất hiệu quả để đưa DNA vào thể nhận Nó có thuận lợi là DNA đưa vào ở dạng mạch đơn nên dễ dàng hơn cho việc tái tổ hợp tương đồng so với DNA đưa vào ở dạng mạch kép (biến nạp

10

và điện biến nạp) Tiếp hợp cũng là con đường thường được sử dụng để đưa DNA

từ E.coli vào vi khuẩn vùng rễ

Cơ chế quá trình tiếp hợp

Việc truyền yếu tố F từ một vi khuẩn F+ sang một vi khuẩn F- đòi hỏi một sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào Khi nuôi chung với vi khuẩn F- các vi khuẩn F+ sẽ có phản ứng của giới tính đực kéo dài pili sinh dục của mình và bám vào một thụ thể của tế bào vi khuẩn nhận, sau đó pili co lại để kéo tế bào nhận lại gần Giai đoạn tiếp theo vi khuẩn cho tiết ra enzyme làm tan vách tế bào của vi khuẩn nhận và truyền DNA của mình vào Hiện tượng tái tổ hợp sẽ diễn ra sau đó Quá trình truyền vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận xảy ra theo các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: sự tiếp xúc ngẫu nhiên xuất hiện vài phút sau khi trộn vi khuẩn với nhau Xác suất của sự tiếp xúc phụ thuộc vào nồng độ của hai nòi vi khuẩn

Giai đoạn 2: là sự bắt cặp giữa tế bào nhận và tế bào cho Tế bào nhận đóng vai trò thụ động, màng tế bào của nó bị hòa tan tại chổ tiếp xúc với pili sinh dục của vi khuẩn đực, tạo thành những cầu nguyên sinh chất có đường kính từ 10 – 30 µm Quá trình này phụ thuộc vào pH, điều kiện dinh dưỡng trong môi trường

Giai đoạn 3: các DNA của tế bào cho chuyển sang tế bào nhận theo cấu trúc thẳng Số lượng gene chuyển sang phụ thuộc vào thời gian tiếp hợp

Giai đoạn 4: là quá trình tái tổ hợp giữa nhiễm sắc thể của thể nhận và đoạn vật chất di truyền của thể cho, quá trình này đòi hỏi tính tương đồng

Cuối cùng là sự tái tạo nhiễm sắc thể trong những thế hệ sau, thể lai được hình thành

2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE)

Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (TGE) là những đoạn DNA có khả năng di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác

Transposase

Hình 2.6: Cấu trúc một trình tự chèn (Mayer, 2007) 2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị

(i) Di chuyển ngẫu nhiên, TGE có thể di chuyển từ bất kì phân tử DNA nào đến bất kì phân tử DNA nào khác, thậm chí đến 1 vị trí khác trên cùng 1 phân tử Thực ra, sự di chuyển này không hoàn toàn là ngẫu nhiên, cũng có những vị trí trên phân tử DNA mà TGE sẽ ưu tiên chèn vào (ii) Chúng không có khả năng tự sao chép: các TGE không có cơ chế tự sao chép (ngoại trừ một số phage có khả năng chuyển vị), do đó, để nhân lên chúng phải kết hợp với các đơn vị sao chép khác (iii) Sự chuyển vị được điều khiển bởi cơ chế tái tổ hợp tại vị trí đặc hiệu Sự chuyển vị đòi hỏi ít hoặc không cần tính tương đồng giữa các vị trí Sự chuyển vị xảy ra nhờ 1 transposase mã hóa cho TGE Và cuối cùng, sự chuyển vị có thể xảy ra đồng thời với sự nhân đôi Trong nhiều trường hợp, sự chuyển vị làm di chuyển TGE từ vị trí này tới vị trí khác Tuy nhiên, cũng có những trường hợp sự chuyển vị xảy ra đồng thời với sự nhân đôi của TGE, 1 bản sao vẫn ở lại vị trí cũ còn bản sao kia sẽ được chuyển đến vị trí mới

2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị

Các trình tự chèn (IS_insertion sequence)

Các trình tự chèn là các TGE không chứa gene nào khác ngoài các gene cần thiết cho sự chuyển vị Về cách đặt tên, các trình tự chèn được kí hiệu là IS, kèm theo 1 con số Ví dụ IS1

Về cấu trúc, IS là 1 đoạn DNA thẳng, ở hai đầu có chứa các trình tự lặp lại, ở giữa có các gene liên quan đến sự chuyển vị và các trình tự kiểm soát sự biểu hiện gene, ngoài ra không có bất kì 1 gene không thiết yếu nào khác hiện diện

Tầm quan trọng của các trình tự chèn được thể hiện trong các lĩnh vực sau: Đột biến: đưa 1 trình tự chèn vào 1 gene của vi khuẩn sẽ làm bất hoạt gene

12

Hình 2.7: Cấu trúc transposon (Mayer, 2007)

Chèn plasmid vào NST: các vị trí mà plasmid chèn vào NST vi khuẩn là ngay tại trình tự chèn trên NST hay gần đó

Sự biến đổi phase: kháng nguyên lông là một trong những kháng nguyên

chính kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại sự xâm nhiễm vi khuẩn Salmonella

có 2 gene mã hóa cho 2 loại kháng nguyên lông khác nhau Sự biểu hiện của các gene này được điều hòa bởi 1 trình tự chèn Điều hòa theo hướng này thì gene này

biểu hiện, theo hướng kia thì gene kia biểu hiện Do đó, Salmonella có thể thay đổi

kháng nguyên lông của chúng để đáp ứng với sự tấn công của hệ thống miễn dịch Sự biến đổi phase cũng xảy ra ở những kháng nguyên bề mặt khác của vi khuẩn

Transposons (Tn)

Transposon là các yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị có chứa 1 hay nhiều gene khác ngoài các gene cần thiết cho sự chuyển vị Về cách đặt tên, transposon được kí hiệu là Tn kèm theo 1 con số Ví dụ Tn5

Về cấu trúc, cấu trúc của 1 transposon tương tự như 1 trình tự chèn Các gene có thêm nằm ở giữa, 2 đầu là các trình tự lặp lại Trong một số trường hợp (các transposon ghép) các trình tự lặp lại ở hai đầu chính là các trình tự chèn

Tầm quan trọng: nhiều gene kháng kháng sinh nằm trên transposon Vì transposon có thể nhảy từ phân tử DNA này tới phân tử DNA khác nên các transposon này là 1 yếu tố chính trong sự phát tán plasmid, đem đến tính kháng nhiều loại thuốc cho các vi khuẩn có chứa plasmid như vậy Những plasmid kháng nhiều loại thuốc đang là 1 vấn đề y học lớn vì việc sử dụng bừa bãi thuốc kháng

sinh có thể đem đến 1 sự chọn lọc thuận lợi cho các loài vi khuẩn có chứa những plasmid này

Các transposon vi khuẩn phân biệt với nhau bằng mức độ hội nhập (intergration) Các phần tử Tn7, Tn9, IS4, IS5 có mức độ hội nhập cao Các phần tử Tn10, IS1, IS2 có mức độ hội nhập trung bình Các phần tử Tn2, Tn4, Tn5 và DNA phage Mu nói chung gắn vào các chỗ ngẫu nhiên của bộ gen Tần số chuyển vị của các transposon vi khuẩn cũng biến đổi trong phạm vi rộng từ 10-7

– 10-4, ở các điều kiện khác nhau thì nó phụ thuộc vào độ dài của transposon

2.2 Plasmid

Plasmid là những phân tử DNA dạng vòng có khả năng sao chép và tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn Hầu hết plasmid có chứa 1 hoặc nhiều gene mà những gene này thường không thiết yếu cho sự sống của tế bào chủ nhưng quy định cho những đặc điểm hữu ích, ví dụ như khả năng kháng kháng sinh Người ta thường dựa vào khả năng kháng kháng sinh như một marker chọn lọc để chắc rằng vi khuẩn nuôi cấy có chứa một plasmid cụ thể nào đó (Brown, 1995)

Tất cả plasmid đều có chứa ít nhất một trình tự DNA đóng vai trò như một điểm khởi đầu sao chép, cho phép plasmid nhân lên độc lập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ Về kích thước, plasmid thay đổi từ nhỏ nhất là 1 kb đến lớn nhất là 250 kb, nhưng chỉ những plasmid có kích thước nhỏ hơn 10 kb mới thích hợp để sử dụng trong cloning

Về số bản sao, plasmid được chia thành nhóm plasmid có nhiều bản sao và nhóm có ít bản sao Đối với plasmid có nhiều bản sao, có thể tìm thấy 20 đến 50 plasmid trong 1 tế bào Loại plasmid này có 1 đặc điểm hữu ích là vẫn có thể nhân lên khi sự tổng hợp protein của tế bào ngừng lại Đặc tính này được ứng dụng để tăng số lượng plasmid mà không cần tăng lượng tế bào chủ tạo thuận lợi cho quá trình ly trích plasmid Khi canh khuẩn đạt đến nồng độ tế bào thích hợp, một tác nhân ức chế tổng hợp protein (ví dụ như chloramphenicol) được thêm vào, và canh khuẩn được ủ tiếp khoảng 12 tiếng nữa Trong thời gian này, plasmid tiếp tục nhân

14

lên trong khi sự sao chép nhiễm sắc thể của tế bào chủ và sự phân chia tế bào bị khóa lại Kết quả là số bản sao của plasmid có thể đạt đến hàng ngàn bản sao Đối với plasmid có ít bản sao, sự sao chép xảy ra cùng lúc với sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn Trong tế bào vi khuẩn có từ 1 – 3 bản sao plasmid như vậy Kích thước tối thiểu của nó 20 – 30 kb, còn tối đa thì lớn hơn một bậc Khi ly trích plasmid có ít bản sao, muốn gia tăng lượng plasmid thì phải gia tăng lượng tế bào chủ

Plasmid được chia thành 2 nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp Plasmid tiếp hợp có khả năng phát động sự tiếp hợp giới tính giữa các tế bào vi khuẩn, quá trình này dẫn đến kết quả là plasmid tiếp hợp được lan truyền từ 1 tế bào tới tất cả các tế bào khác trong canh khuẩn Sự tiếp hợp và chuyển plasmid được kiểm soát bởi hệ

thống chuyển hay các gene tra, mà chỉ có trong những plasmid tiếp hợp Tuy nhiên,

1 plasmid không tiếp hợp, dưới một số điều kiện thích hợp, có thể được truyền đi cùng với plasmid tiếp hợp khi cả hai cùng hiện diện trong 1 tế bào

Nhiều loại plasmid có thể được tìm thấy trong cùng 1 tế bào Trên thực tế,

những tế bào E.coli được biết là có thể chứa đến 7 loại plasmid khác nhau cùng lúc

Theo Mølbak (2003) để có thể cùng tồn tại trong 1 tế bào, những plasmid khác nhau phải liên kết với nhau Nếu 2 plasmid không có khả năng liên kết với nhau thì khi đó 1 trong 2 sẽ nhanh chóng bị mất đi khỏi tế bào

Việc phân loại plasmid thông thường dựa trên những đặc điểm chính được quy định bởi các gene của plasmid (Brown, 1995) Theo cách này, plasmid được

chia thành 5 loại: (i) Fertility hay “F” plasmid: chỉ chứa các gene tra và không có

đặc điểm gì ngoại trừ khả năng phát động sự truyền tiếp hợp của plasmid Ví dụ như

F plasmid của E.coli (ii) Resistance hay “R” plasmid: có chứa những gene đem đến

cho tế bào chủ tính kháng với 1 hoặc nhiều tác nhân kháng khuẩn, như là chloramphenicol, ampicillin và thủy ngân R plasmid rất quan trọng trong vi sinh vật học lâm sàng bởi vì sự phát tán của chúng ra các quần thể tự nhiên có thể dẫn đến hậu quả nghiêm trọng trong việc chữa trị các bệnh nhiễm vi khuẩn Ví dụ: RP4,

thông thường tìm thấy ở Pseudomonas, nhưng cũng có thể xuất hiện ở nhiều loài vi

Hình 2.8: Cơ chế phương pháp tiếp hợp 3 thành phần (Cameron, 2007)

khuẩn khác (iii) Col plasmid: mã hóa cho các colicin_là những protein có thể gây

độc cho vi khuẩn khác Ví dụ: ColE1 ở E.coli (iv) Degradative plasmid: cho phép

tế bào chủ tổng hợp những phân tử đặc biệt như toluene và acid salicylic Ví dụ:

TOL ở Pseudomonas putida Và cuối cùng là Virulence plasmid: đem đến đặc tính gây bệnh cho tế bào chủ Ví dụ: Ti plasmid ở Agrobacterium tumefaciens, gây bướu

ở cây 2 lá mầm

2.3 Các phương pháp thường dùng để chuyển DNA plasmid

2.3.1 Phương pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating)

Là phương pháp chuyển gene từ thể cho sang thể nhận qua sự tiếp xúc trực tiếp giữa các tế bào và có sự trợ giúp của dòng vi khuẩn có plasmid hỗ trợ

16

So với phương pháp tiếp hợp thông thường ở vi khuẩn thì phương pháp tiếp hợp ba thành phần có thêm sự hiện diện của dòng vi khuẩn trợ giúp có chứa plasmid hỗ trợ Vậy tại sao plasmid hỗ trợ lại cần thiết cho việc tiếp hợp? Theo Cameron (2007) hiệu quả chuyển gene sẽ tăng lên đáng kể khi có sự hiện diện của plasmid hỗ

trợ vì nó có gene chuyển tra gene Tra gene cung cấp nhiều chức năng tạo thuận lợi

cho việc tiếp hợp như hình thành pili, duy trì sự tiếp xúc giữa các tế bào, làm duỗi DNA và làm đứt oriT (mob) để khởi đầu việc chuyển DNA mạch đơn vào thể nhận Cameron (2007) còn cho rằng tiếp hợp ba thành phần là con đường thường được sử

dụng để đưa DNA từ E.coli vào vi khuẩn vùng rễ

2.3.2 Phương pháp điện biến nạp

Điện biến nạp là một phương pháp hóa học sử dụng để đưa những phân tử phân cực vào tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện lớn làm xáo trộn tạm thời lớp đôi phospholipid, cho phép những phân tử phân cực như DNA đi vào tế bào

Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử đòi hỏi các gene lạ hoặc vật liệu protein được chèn vào 1 tế bào chủ Nhưng thực hiện điều này không đơn giản vì lớp đôi phospholipid của màng nguyên sinh chất ngăn cản các phân tử phân cực như DNA và protein đi xuyên qua màng một cách tùy ý

Nhiều phương pháp cho phép vượt qua rào cản này đã được nghiên cứu và phát triển Điện biến nạp là một phương pháp như vậy Điện biến nạp lợi dụng những tương tác ưa nước – kị nước tương đối yếu và khả năng tự liền lại của màng sau khi bị xáo trộn Nhờ vậy, một shock điện áp nhanh có thể làm xáo trộn các vùng của màng một cách tạm thời, cho phép những phân tử phân cực đi qua, nhưng sau đó màng có thể nhanh chóng đóng lại, tế bào vẫn còn nguyên vẹn

2.3.2.1 Phương pháp

Trộn tế bào chủ và các phân tử muốn chèn vào trong dung dịch, cơ chế hoạt động của thiết bị điện biến nạp được trình bày dưới dạng sơ đồ sau đây:

Khi công tắc đầu tiên đóng lại, tụ điện nạp điện và giữ một điện áp cao Khi công tắc thứ hai đóng lại, điện áp này phóng điện qua dịch huyền phù tế bào Điển hình như, cần một xung điện từ 10000 đến 100000 V/cm (thay đổi theo kích thước tế bào) kéo dài từ một vài phần triệu giây tới một phần nghìn giây để thực hiện điện biến nạp Xung điện này xáo trộn lớp đôi phospholipid của màng và hình thành nhiều lỗ trong một thời gian ngắn Điện thế qua màng tế bào đồng thời tăng lên khoảng 0.5 - 1.0 V để những phân tử được tích điện (như DNA) băng qua màng qua các lỗ theo cách thức tương tự như điện di Khi các ion và phân tử tích điện chui qua lỗ, màng tế bào trung hòa điện tích, các lỗ nhanh chóng đóng lại, và lớp đôi phospholipid liền lại Những phân tử mong muốn lúc này ở bên trong tế bào và có thể sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo

Theo Smith (1989) điện biến nạp là phương pháp rất phổ biến và có hiệu quả cao trong việc chuyển các phân tử DNA mục tiêu vào tế bào vi khuẩn

Hình 2.9: Cơ chế hoạt động của thiết bị điện biến nạp

18

2.3.3 Phương pháp Calcium chloride

Phương pháp này được phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5.106

đến 2.107 khuẩn lạc/μg plasmid DNA

Quy trình biến nạp bằng phương pháp calcium chloride được trình bày dưới dạng sơ đồ sau:

2.4

Thông thường, người ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hóa trị II như CaCl2, MgCl2, RbCl2 Việc biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0 – 40C) Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào dễ dàng hơn Giai đoạn shock nhiệt kế tiếp sẽ kích thích sự chuyển DNA vào tế bào Môi trường dưỡng chất được thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tương ứng

So với điện biến nạp, phương pháp này tốn nhiều thời gian hơn, hệ số biến nạp của tế bào sau khi xử lý thấp nhưng đơn giản và dễ thực hiện (Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, 2005)

Hình 2.10: Quy trình biến nạp bằng phương pháp CaCl2

2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học

Theo Cook và Baker (1983), phòng trừ sinh học bệnh cây là sử dụng một hoặc nhiều loài sinh vật (ngoại trừ con người) để khống chế mầm bệnh hay làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một tác nhân gây hại nào đó Đến năm 1988, Cook đã đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học Theo ông, phòng trừ sinh học bệnh cây là sử dụng sinh vật, gene và các sản phẩm của gene để điều khiển tác nhân gây bệnh Cách điều khiển tác nhân gây bệnh có thể là: (i) duy trì nguồn bệnh ở mức thấp dưới ngưỡng gây hại, (ii) làm chậm hoặc loại trừ tiến trình xâm nhiễm của bệnh, (iii) kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây

Các công trình nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sinh học được công bố vào đầu thế kỉ 20 cho thấy vi khuẩn là một trong những tác nhân phòng trừ sinh học phổ

biến và hiệu quả Đây là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ biến nhất là Pseudomonas spp., kế đến là Bacillus spp và Streptomyces (Burr và cộng sự, 1978; Weller và

Cook, 1983)

Vi khuẩn đóng vai trò là tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên quan hệ đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh cây Tác động đối kháng có thể xảy ra bằng nhiều cơ chế như: cạnh tranh chỗ cư trú; cạnh tranh dinh dưỡng, đặc biệt là việc cạnh tranh chất Fe bằng cách tạo ra các hợp chất siderophore Trong môi trường tự nhiên khi thiếu một chất dinh dưỡng nào đó hay hàm lượng chất đó không đủ cung cấp vi sinh vật thì loại vi sinh vật nào có khả năng đồng hóa mạnh sẽ lấy được nhiều thức ăn và phát triển, còn loại yếu bị đói và có thể bị tiêu diệt Cơ chế thứ ba là tiết chất kháng sinh và phân hóa tố: trong quá trình hoạt động sống, nhiều vi sinh vật có thể tiết ra bên ngoài các chất có tác dụng ức chế một hoặc nhiều loại vi sinh vật khác Các chất này có thể là kháng sinh hay các phân hóa tố để phân giải tế bào vi sinh vật khác Tác động đối kháng cũng có thể do cơ chế siêu kí sinh trên mầm bệnh hoặc kích thích sự tăng trưởng của cây trồng: nhiều vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cây trồng một cách gián tiếp bằng cách kích thích sự tăng trưởng của cây nhờ đó cây kháng được mầm bệnh

20

2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Trong số các loài Pseudomonas spp., P fluorescens là được chú ý nghiên

cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004)

Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram (-), có đơn hoặc tùng

mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kì linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong

nước Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-300

C

Chúng có trắc nghiệm dương tính với oxidase Một số dòng Pseudomonas

fluorescens (chẳng hạn như CHAO hay Pf-5) có những đặc tính kiểm soát sinh học,

giúp bảo vệ vùng rễ một số loài thực vật chống lại nấm kí sinh như Fusarium hay

Pythium, cũng như một số loài nematode ăn thực vật

Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học

của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất

người ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide

2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Giống: Pseudomonas

Loài: Pseudomonas fluorescens

2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Năm 1935, các nhà khoa học Liên Xô đã dùng một số loài vi khuẩn thuộc

nhóm Pseudomonas bón vào đất để chống lại nấm Sclerotonia và Botrylis bảo vệ

nhiều loại cây trồng

Những chủng vi khuẩn vùng rễ trong đó có Pseudomonas fluorescens đối kháng mạnh với Rhizoctonia solani, Sclerotium (corticium) rolfsii Nguồn vi khuẩn

này cũng được sử dụng trong phòng trừ sinh học hiệu quả đối với bệnh thối bẹ lá, bệnh thối thân đậu phộng, nâng cao sự phát triển cây trồng và tăng năng suất (Sakthivel và ctv, 1986)

Mew và Rosales (1984) đã phân lập từ ngoài đồng hai loài vi khuẩn phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang trên môi trường KB đối kháng với nấm

Rhizoctonia solani

Gutter Son và ctv (1986) đã sử dụng dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong phòng trừ bệnh héo cây con trên cây bông

Sivamani và Gnanamanickam (1988) đã xử lý cây chuối con Musa balbisiana

bằng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens trên bệnh héo rũ Kết quả bệnh

ít hơn, rễ cây phát triển tốt hơn và tăng chiều cao

Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens có huỳnh

quang và không có huỳnh quang phân lập từ rễ lúa ở miền Nam Ấn Độ đối kháng

tốt với nấm Rhizoctonia solani được thực hiện bởi Devi và ctv (1989)

Voisard và ctv (1989) cho biết cyanide sản xuất bởi Pseudomonas fluorescens giúp ngăn chặn bệnh thối đen rễ thuốc lá

Lambert và ctv (1987) đã phân lập Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas

cepacia, Serratia liquefacien và Bacillus sp có hoạt tính chống nấm phổ rộng từ

cây bắp, lúa mạch, và xà lách xoong