Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro ở một số giống lúa và xây dựng quy trình chuyển gen thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ •• CƠNG NGHỆ SINH HỌ C •• Thái Nguyên - 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC •••• Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” trung thực, thực Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nơng Lâm- Đại học Thái Ngun Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực nội dung khác đề tài Học viên LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn T.S Nguyễn Xn Vũ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm cán bộ, quý đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh tiếng Việt) CT Công thức LSD Least Singnificant Difference Test - Sai khác nhỏ có ý nghĩa CV Coeficient of Variation - Hệ số biến động MT Mơi trường TN Thí nghiệm AS Acetosyringone LB Left border- ranh giới trái RB Right border-ranh giới phải MS Murashige Skoog DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 Bảng 1.2 Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu .19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng NaOCl 3% tới hiệu khử trùng mẫu (sau ngày nuôi cấy) 29 Bảng 3.2 Ảnhhưởngcủa môi trường nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo số giống lúa 30 Bảng 3.3 Ảnhhưởngcủa 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo số giống lúa (sau 14 ngày) 33 Bảng 3.4 Ảnhhưởngcủa BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa .34 Bảng 3.5 Ảnhhưởngcủa kinetin đến khả tái sinh số giống lúa 35 Bảng 3.6 Ảnhhưởngcủa tuổi mô sẹo đến khả tiếp nhận gen GUS _/V, _Ẳ 0^7 »Ặ iz số giống lúa 37 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến hiệu chuyển gen số giống lúa 39 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ AS đến khả tiếp nhận gen GUS số giống lúa 40 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen .42 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyểngen .43 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc môsẹo chuyển gen 44 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình hình sản xuất diện tích lúa tồn cầu năm 2018 [16] Hình 1.2 Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 .7 Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens 10 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid 11 Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA .12 Hình 1.7 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua A tumefaciens .13 Hình 2.1 T-DNA plasmid pCambia3301 mang gen bar gen gus, gen điều kiển CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải) 20 Hình 3.1 Mơ sẹo tái sinh môi trường N6 (A) MS (B) giống lúa Bao thai sau ngày nuôi cấy .31 Hình 3.2 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa (sau 14 ngày) A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đoàn kết 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng kinetin đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai 35 Hình 3.5 Biểu gen GUS mô sẹo ngày tuổi giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 38 Hình 3.6 Biểu gen GUS nồng độ AS 100 uM giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 40 Hình 3.7 Biểu gen GUS sau phút lây nhiễm với vi khuẩn giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 41 Hình 3.8 Biểu gen GUS sau ngày đồng nuôi cấy giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 43 Hình 3.9 Chọn lọc tế bào chuyển gen môi trường hygromycin 10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) 25 mg/l (D) 44 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu 3 Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò lúa 1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất lúa giới 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa giới 1.2.2 Tình hình sản xuất lúa giới .6 1.3 Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa Việt Nam 1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa Việt Nam .7 1.3.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens chế chuyển gen vào thực vật 10 1.4.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 10 1.4.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid T-DNA 11 1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 12 1.5 Hệ thống gen thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng nghiên cứu 14 1.5.1 Gen gusA 14 1.5.2 Gen bar 14 1.6 Một số phương pháp biến nạp gen lúa 14 1.6.1 Phương pháp vi tiêm 14 1.6.2 Chuyển gen xung điện 15 1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) .15 1.6.4 Chuyển gen súng bắn gen 15 1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens .16 1.8 Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro lúa giới Việt Nam 16 1.9 Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen lúa giới Việt Nam 17 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Vật liệu sử dụng phạm vi nghiên cứu 19 2.1.3 Thiết bị sử dụng 20 2.2 Địa điểm thời gian tiến hành 20 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa 21 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen số giống lúa 23 2.4 Điều kiện bố trí thí nghiệm 26 2.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 26 2.5.1 Các tiêu theo dõi .26 2.5.2 Các tiêu đánh giá 26 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh invitro số giống lúa .29 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NaOCl đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy .29 3.1.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo 30 3.1.3 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa 32 3.1.4 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa 33 3.1.5 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi số giống lúa Việt Nam 35 3.2 Kết nghiên cứu khả tiếp nhận gen 36 3.2.1 Ảnh hưởng tuổi mô sẹo đến hiệu biến nạp gen .36 3.2.2 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến hiệu biến nạp gen 38 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ AS đến hiệu chuyển gen số giống lúa 39 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 41 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 42 3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc chuyển gen 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Kết luận 45 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 giống lúa với tỷ lệ từ 36,7 đến 51,3% thông qua gen thị GUS, mức độ biểu gen tốt (+++, hình 3.6) Khi nồng độ AS tăng lên hay giảm, làm giảm tỷ lệ biến nạp gen Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ AS đến khả tiếp nhận gen GUS _ r r J _A _ • A A _ số giống lúa Giống Cơng thức Khang dân Bao Thai Đồn kết Nồng độ ụM Số mẫu biến nạp (mẫu) Số mẫu nhuộm gus (mẫu) 40 40 40 40 50 100 150 60 60 60 60 CV% LSD05 50 100 150 60 60 60 60 CV% LSD05 40 40 40 40 50 100 150 60 60 60 60 CV% LSD05 40 40 40 40 Tỷ lệ mẫu nhuộm gus+ (%) 11,6d 26,7b 36,7a 18,3c 7,4 1,44 14,2d 36,7b 45a 31,7c 6,3 1,63 23,3c 29,2b 41,7a 29,0b Mức độ • 1•Ấ • /s + + +++ ++ + ++ +++ ++ + + +++ ++ 6,2 1,43 13,3d 33,2b 51,3a 40 + 60 40 ++ 60 40 ++ 60 Nếp 87 c 40 +++ 60 26,0 CV% 4,3 LSD05 2,4 Ghi chú: +++: màu xanh đậm, vùng biểu rộng; ++: màu xanh nhạt vùng biểu 50 100 150 trung bình; +: màu xanh nhạt, vùng biểu hẹp Các chữ a, b, c, d, e khác cột thể sai khác có ý nghĩa công thức với mức ý nghĩa a