Xây dựng hệ thống nhân giống in vitro cho một số giống măng tây f1 nhập nội

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “XÂY DỰNG HỆ THỐNG NHÂN GIỐNG IN VITRO CHO MỘT SỐ GIỐNG MĂNG TÂY F1 NHẬP NỘI” Sinh viên thực : ĐINH HƢƠNG GIANG Lớp : CNSHD – K63 Mã SV : 637315 Ngƣời hƣớng dẫn : TS HOÀNG THỊ GIANG TS NGUYỄN THỊ LÂM HẢI HÀ NỘI, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực qua q trình nghiên cứu khơng chép từ cơng trình nghiên cứu chƣa đƣợc sử dụng cơng bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc rõ ràng, minh bạch, có kế thừa từ nguồn tài liệu đƣợc công bố Nếu phát có sai phạm tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên ĐINH HƢƠNG GIANG i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập rèn luyện Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam nhận đƣợc dạy bảo quan tâm từ thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học nhƣ thầy cô giáo trƣờng cho nhiều kiến thức để tự tin vững bƣớc chặng đƣờng sau này, đến hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Hồng Thị Giang – Phó Giám đốc Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật Viện Di Truyền Nông Nghiệp định hƣớng đề tài tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi nhiệt tình suốt tháng làm khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô TS Nguyễn Thị Lâm Hải– giảng viên khoa Công nghệ sinh học, toàn thể cán bộ, anh, chị, bạn bè thực tập nghiên cứu Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình làm đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân quan tâm, động viên, tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên ĐINH HƢƠNG GIANG ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KẾT QUẢ x PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung măng tây 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Đặc điểm thực vật 2.2 Tình hình sản xuất măng tây giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất giới 2.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ măng Việt Nam 2.3 Lợi ích măng tây 2.3.1 Loại mẫu 10 2.3.2 Nền môi trƣờng 11 2.3.3 Chất điều tiết sinh trƣởng 12 2.3.4 Yếu tố khác ảnh hƣởng tới khả nắng nhân giống rễ măng tây 12 2.4 Các nghiên cứu măng tây 14 2.5 Một số bệnh thƣờng gặp 16 iii 2.5.1 Héo Fusarium 16 2.5.2 Rust (rỉ sét) 16 PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng tạo chồi nhân nhanh in vitro từ mẫu chồi đỉnh măng tây 18 3.4.2 Nghiên cứu xác định mơi trƣờng thích hợp cho rễ tạo măng tây in vitro hoàn chỉnh 20 3.4.3 Nghiên cứu tiêu chuẩn giống măng tây in vitro đƣa vƣờn ƣơm 21 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 4.1 Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng tạo chồi nhân nhanh in vitro từ mẫu chồi đỉnh măng tây 23 4.1.1 Nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng hạt tạo nguồn vật liệu in vitro 23 4.1.2 Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng tái sinh chồi từ mẫu chồi đỉnh in vitro 25 4.1.3 Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng nhân nhanh chồi in vitro 30 4.2 Nghiên cứu xác định mơi trƣờng thích hợp cho rễ tạo măng tây in vitro hoàn chỉnh 35 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng số chất điều hòa sinh trƣởng đến hiệu rễ 36 4.2.2 Nghiên cứu xác định môi trƣờng thích hợp cho rễ tạo măng tây in vitro hoàn chỉnh 40 4.3 Nghiên cứu tiêu chuẩn giống măng tây in vitro đƣa vƣờn ƣơm 44 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng số rễ đến khả sinh trƣởng phát triển giống in vitro 45 iv 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chiều cao đến khả sinh trƣởng phát triển giống in vitro 49 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hƣởng nồng độ Javen thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt măng tây 29 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất điều tiết sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi măng tây 26 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng nồng độ chất điều tiết sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi măng tây 30 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ nƣớc dừa đến khả nhân nhanh chồi măng tây 34 Bảng 4.5 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA IBA đến trình tạo rễ măng tây 36 Bảng 4.6 Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA, IBA kết hợp Ancymidol đến trình tạo rễ măng tây 40 Bảng 4.7 Số lƣợng mẫu măng tây phân loại theo số lƣợng rễ 46 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Khử trùng hạt giống măng tây dung dịch Javen với nồng độ khác 25 Hình 4.2 Sự nảy mầm hạt giống măng tây 25 Hình 4.3 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi giống Atlas 27 Hình 4.4 Auxin chất kích thích sinh trƣởng, thúc đẩy phân chia tế bào 28 Hình 4.5 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả tái sinh chồi giống Lunalim 29 Hình 4.6 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân chồi giống Atlas 32 Hình 4.7 Ảnh hƣởng chất điều hoà sinh trƣởng đến khả nhân chồi giống Sunlim 33 Hình 4.8 Ảnh hƣởng chất điều hồ sinh trƣởng đến khả nhân chồi giống Lunalim 33 Hình 4.9 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng tới trình rễ giống Atlas (MTA) 38 Hình 4.10 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng tới trình rễ giống Sunlim (MTS) 39 Hình 4.11 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng tới trình rễ giống Lunalim (MTL) 39 Hình 4.12 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng IBA kết hợp với Ancymidol tới trình rễ giống Sunlim 42 Hình 4.13 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng IBA kết hợp với Ancymidol tới trình rễ giống Lunalim 43 Hình 4.14 Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng NAA kết hợp với Ancymidol tới trình rễ giống Atlas 44 vii Hình 4.15 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Lunalim 47 Hình 4.16 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Sunlim 48 Hình 4.17 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Atlas 48 Hình 4.18 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Lunalim 49 Hình 4.19 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Sunlim 50 Hình 4.20 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Atlas 50 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A Ancymidol BA 6-benzyladenine CT Công thức HTCT Hệ thống trồng IAA Indole-3-axit axetic IBA 6-benzylaminopurine MS Murashige Skoog MTA Măng tây Atlas MTL Măng tây Lunalim MTS Măng tây Sunlim NAA Axit 1-naphthaleneacetic ix bình từ phịng ni ngồi mơi trƣờng tự nhiên khoảng tuần để huấn luyện Cần chuẩn bị giá thể sơ dừa đƣợc ngâm qua nƣớc khoảng 15 ngày để khử chua, sau cần rửa sơ dừa nƣớc để nƣớc; khay trồng cần đảm bảo có lỗ nƣớc để khơng bị úng tƣới nƣớc; cần có thẻ đánh dấu phân biệt giống măng tây Dùng đũa tre ngón tay ấn nhẹ lỗ không sâu mm giá thể ƣơm tay gấp đặt vào mặt bầu ƣơm không sâu mm, lấp nhẹ, đem khay đặt vào nhà lƣới để tránh đƣợc trời mƣa to, lấy đƣợc 80% – 100% nắng tồn phần ngăn đƣợc trùng xâm hại cây, ngày sau dùng nƣớc có pH 6,5–7,5 tƣới phun sƣơng để giữ ẩm 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng số rễ đến khả sinh trƣởng phát triển giống in vitro Sau tiến hành đƣa khỏi môi trƣờng rễ, ta cần phân loại theo tiêu chí: có rễ, có từ 2-3 rễ có nhiều rễ 45 Bảng 4.7 Số lƣợng mẫu măng tây phân loại theo số lƣợng rễ chiều cao Giống Sunlim Atlas Lunalim Tiêu chí Tổng Số mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ tạo rễ đánh giá mẫu (cây) sống (cây) sống (%) (%) rễ 35 11 2-3 rễ 25 28 >5 rễ 0 < 5cm 38 5-8cm 57 >8 cm 19 21 rễ 15 20 2-3 rễ 16 13 >5 rễ 0 < 5cm 0 5-8cm 21 >8 cm 12 16 rễ 13 0 2-3 rễ 10 20 >5 rễ 0 < 5cm 33 5-8cm 14 28 >8 cm Kết bảng 4.8 cho thấy, với loại rễ khác cho tỷ lệ sống khác giống, đƣa măng tây vƣờn ƣơm có 2-3 rễ cho tỷ lệ sống cao cho giống măng tây Sunlim, Lunalim Atlas Giống Atlas có rễ cho tỷ lệ sống cao 20%, tỷ lệ sống >5 rễ 0% cho giống Thấy giống Sunlim (2-3 rễ) tỷ lệ sống cao 28% so 46 với giống Lunlim 20% Atlas 13% Cả giống măng tây không xuất tái sinh rễ Kết luận: Cây măng tây với loại rễ khác cho tỷ lệ sống khác giống, có 2-3 rễ đạt tỷ lệ sống cao cho giống Lunalim, Sunlim Cây măng tây có rễ cho tỉ lệ sống cao cho giống Atlas Hình 4.15 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Lunalim A CT1; B CT2; C CT3 47 Hình 4.16 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Sunlim A CT1; B CT2; C CT3 Hình 4.17 Mẫu măng tây phân loại theo số rễ : rễ, 2-3 rễ, >5 rễ giống Atlas A CT1; B CT2; C CT3 48 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng chiều cao đến khả sinh trƣởng phát triển giống in vitro Chiều cao tiêu quan trọng để đánh giá tốc độ sinh trƣởng nói chung, Măng tây nói riêng Kết bảng 4.8 cho thấy, đƣa vƣờn ƣơm phân nhóm theo chiều cao 8cm 16% Giống Lunalim với chiều cao 5-8cm cho tỷ lệ sống cao so với giống Atlas Sunlim 28% Kết luận: với chiều cao khác cho tỷ lệ sống khác giống, tỷ lệ sống cao với 8 cm cao với giống Sunlim 21% Atlas 16%, tỷ lệ sống với 5-8cm cao với giống Lunalim 28% Hình 4.18 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Lunalim A CT1; B CT2; C CT3 49 Hình 4.19 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Sunlim A CT1; B CT2; C CT3 Hình 4.20 Mẫu măng tây phân loại theo chiều cao: 8cm giống Atlas A CT1; B CT2; C CT3 50 Nguyên nhân: - Cây măng tây ơn đới thích hợp trồng thời tiết mát mẻ mà thời điểm vào mùa hè với nhiệt độ mơi trƣờng cao khiến khó thích nghi phát triển từ dẫn tới tỷ lệ sống sót khơng cao - Điều kiện nuôi trồng nhà lƣới chƣa thực đảm bảo côn trùng, sâu bệnh hại, nhiệt độ, độ ẩm ánh sáng thích hợp nên ảnh hƣởng tới tỷ lệ sống trồng Theo Đặc điểm sinh trƣởng măng tây, Kỹ thuật gây trồng chăm sóc măng tây (2010), hạt măng tây nảy mầm nhiệt độ 200 độ C, thích hợp để phát triển tốt 24-25 độ C Măng tây phát triển tốt điều kiện nhiệt độ 20-300 độ C, tốt 23-24 độ C, măng tây chịu đƣợc rét, nhƣng dƣới 10 độ C măng ngừng sinh trƣởng 51 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp tái sinh nhân nhanh chồi in vitro cho 03 giống măng tây F1 nhập nội - Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp khử trùng mẫu hiệu để tạo nguồn vật liệu in vitro cho giống măng tây Atlas, Sunlim, Lunalim: Khử trùng hạt giống dung dịch Javel với nồng độ 1% thời gian 30 phút cho kết tốt - Đã tối ƣu đƣợc môi trƣờng tái sinh chồi từ mẫu chồi đỉnh in vitro: Mơi trƣờng ni cấy MS có bổ sung mg/l BAP 0,5 mg/l Kinetin cho khả tái sinh chồi giống măng tây tốt - Đã xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy phù hợp cho khả nhân nhanh chồi invitro mơi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l Kinetin 10% nƣớc dừa cho kết tốt khả nhân nhanh chồi giống măng tây Đã tìm đƣợc mơi trƣờng thích hợp cho rễ cho 03 giống măng tây F1 nội nhập - Đã xác định đƣợc chất điều hóa sinh trƣởng thực vật NAA với nồng độ 0,5mg/l (CT3) có tác động tốt đến q trình tạo rễ Măng tây giống Atlas chất điều hóa sinh trƣởng thực vật IBA với nồng độ 0,1 mg/l (CT5) có tác động tốt đến q trình tạo rễ Măng tây giống Sunlim Lunalim - Đã xác định đƣợc chất điều hóa sinh trƣởng thực vật NAA với nồng độ 0,5mg/l (CT1) có tác động tốt đến trình tạo rễ Măng tây giống Atlas chất điều hóa sinh trƣởng thực vật IBA với nồng độ 0,1 mg/l kết hợp với nồng độ Ancymidol 0,5 mg/l (CT3) có tác động tốt đến trình tạo rễ Măng tây giống Sunlim Lunalim 52 Đã tìm đƣợc tiêu chuẩn giống măng tây in vitro đƣa vƣờn ƣơm cho 03 giống mắng tây F1 nội nhập - Cây măng tây với loại rễ khác cho tỷ lệ sống khác giống, có 2-3 rễ đạt tỷ lệ sống cao cho giống Lunalim, Sunlim Cây măng tây có rễ cho tỉ lệ sống cao cho giống Atlas - Cây măng tây với chiều cao khác cho tỷ lệ sống khác giống, tỷ lệ sống cao với 8 cm cao với giống Sunlim Atlas, tỷ lệ sống với 5-8cm cao với giống Lunalim 5.2 Kiến nghị - Cần vào khoảng thời gian với thời tiết mát mẻ mát mẻ để đảm bảo tỷ lệ sống cho trồng - Cần nâng cấp nhà lƣới với trang thiết bị cần thiết cho trình ni trồng nhƣ: hệ thống phun sƣơng, quạt thơng gió, hệ thống làm mát, 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TRONG NƢỚC Đặc điểm sinh trƣởng măng tây Kỹ thuật gây trồng chăm sóc măng tây 2010 Truy cập từ http://ngheandost.gov.vn/chan-nuoi-vatrongtrot?P_p_id=101_instance_y6w3vdzqm7wz&p_p_lifecycle=0&_101_ instance_y6w3vdzqm7wz_struts_action=%2fasset_publisher%2fview_cont ent&_101_instance_y6w3vdzqm7wz_assetentryid=49366&_101_intance_y 6w3vdzqm7wz_type=content&_101_instance_y6w3vdzqm7wz_ urltitle=%c4%91ac-%c4%91iem-sinh-truong-cua-cay-mang-tay-kythuattrong-va-cham-soc-cay-mang-tay FAOSTAT (2011) Sản lƣợng măng tây sản xuất giới FAOSTAT (2018) Tình hình sản xuất tiêu thụ măng tây giới năm 2018 Hồng Minh Tân cs (2006), Ảnh hƣởng ánh sáng tới khả tổng hợp chất hữu Ks Lê Hồng Triều, (2008) Cây măng tây xanh trồng dễ hay khó Diễn đàn nơng nghiệp Lê Hồng Triều (2009) Kỹ thuật trồng chăm sóc rau măng tây xanh Lƣ Cẩm cs (2008), Kỹ thuật trồng chăm sóc măng tây xanh, Nxb Mỹ Thuật Mai Thị Phƣơng Anh (2001) Kỹ thuật trồng số loại rau cao cấp, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Ngô Phƣơng Ngọc, Lâm Ngọc Phƣơng, (2015) Vi nhân giống Măng tây (Asparagus officinalis L… Tạp chí Khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 83 – 89 10 Nguyễn Công Thành (2018) Măng tây hữu đƣợc sản xuất nhƣ Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam 54 11 Nguyễn Văn Sinh (2019) Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào Visitech kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật 12 PGS.TS Vũ Quang Sáng & cs (2017), …Đặc điểm sinh trƣởng phát triển, suất số giống măng tây xanh ảnh hƣởng phân bón đến giống Jersey Giant Variety F1 Gia Bình- Bắc Ninh Luận văn thạc sĩ Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4-9 13 Phan Trung Thông (2020) Nghiên cứu khả thay phân đạm vô đạm hữu từ bánh dầu măng tây xanh trồng thừa thiên huế Luận văn thạc sĩ Trƣờng đại học nông lâm Huế 29-33 14 Trần Khắc Thi cs (1995) Ứng dụng công nghệ sản xuất rau, Nxb Lao đơng Hà Nội NƢỚC NGỒI Alder et al., (1985) Development of haploid asparagus embryos from liquid cultures of anther-derived calli is enhanced by ancymidol Ameena Abdulla H S Al Malki and Khaled M Suliman Elmeer 2010 Influence of auxin and cytokinine on in vitro multiplication of Ficus Anastasia African Journal of Biotechnology Vol 9(5), pp 635-639 Andrew E Czeizel 1, Istvan Dudás, Attila Vereczkey, Ferenc Bánhidy (2012 Nov 21) Folate deficiency and folic acid supplementation: the prevention of neural-tube defects and congenital heart defects 5(11): 476075 Asghar H., A Fouzia, R Abdur and S Muhammad, 2006 Effect of nitrogen on the growth and yield of asparsgus (Asparagus officinalis) Journal of Agricultural and Biological science Vol 1, No Blasberg CH (1932) Phases of the anatomy of Asparagus officinalis Bot Gaz 94:206-214 55 Bojnauth G, Puchooa S and Bahorun T., 2010 In vitro regeneration of Asparagus officinalis: Primary results, Food and agriculture research concil, Reduit, Mauritius, pp: 7-15 Chang, DC N, Peng KH (1996) Phloroglucinol and tryptone enhance in vitro rooting and survival rate of Asparagus nodal sections Acta Hortic 415: 411-416 Conner AJ, Falloon PG (1993) Osmotic versus nutritional effects when rooting in vitro asparagus minicrowns on high sucrose media Plant Sci 89: 101-10 Cuenca B, Vieitez AM (2000) Influence of carbon source on shoot multiplication and adventitious bud regeneration in in vitro beech cultures Plant Growth Regul 32:1-12 10 Desjardins Y.,1992 Micropropagation of Asparagus officinalis L., Agriculture and forestry, Vol 19, pp: 26-41 11 Ellison, J H 1986 Asparagus Breeding, in: Breeding Vegetable Crops, M J Bassett, ed., AVI Publishing Co., Westport pp: 521-569 12 Farías, V., Krarup, C & Contreras S (2004) Efecto de población sobre rendimiento y calidad de turiones de cuatro cultivares de espárrago, Cien Inv Agr 31: 119-127 13 Feng XR, Wolyn DJ (1991) High frequency production of haploid embryos in asparagus anther culture Plant Cell Rep 10: 574-578 14 Gaba VP (2005) Plant growth regulators in plant tissue culture and development In: Trigiano RN, Gray DJ (Eds) Plant development and biotechnology CRC Press, Boca Raton pp 87-99 15 Galli, M G., Bracale, M., Falavigna, A., Raffaldi, F., Savini, C., and Vigo, A 1993 Different kinds of male flowers in the dioecious plant Asparagus officinalis L., Sex Plant Reprod 6: 16-21 56 16 Ito, P J., and Currence, T M 1965 Inbreeding and heterosis in asparagus, Proc Amer Soc Hort Sci 86: 338-346 17 Jiang C, Sink KC (1997) RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus Euphytica 94:329-333 18 Krug, H and D Kailuweit 1999 Is asparagus cultivation dangerous to the environment? Nitrogen balance of asparagus 35(7): 433-436 (CAB Abst 19990308667) 19 Lazarte JE, Palser BF (1979) Morphology, vascular anatomy and embryology of pistillate and staminate flowers of Asparagus officinalis Am J Bot 753-764 20 Lazarte, J E., and Palser, B F 1979 Morphology, vascular anatomy and embryology of pistillate and staminate flowers of Asparagus officinalis Amer J Bot 66: 753-764 21 Machon, N., Deletre-Le Boulc’h, V., and Rameau, C 1995 Quantitative analysis of sexual dimorphism in Asparagus Can J Bot 73: 1780-1786 22 Mamiya et al, (2001) A method to produce encapsulatable units for synthetic seeds in Asparagus officinalis 23 Mamiya K., Sakamoto Y., Onishi N and Hirosawa T 2001 Synthetic seeds of Asparagus officinalis L (in Bhojwani S and Soh W.Y Eds.) Current Trends in the Embryology of Angiosperms Springer Netherlands pp 337-352 Murashige T., Skoog F., 1962 A r 24 Marcellán, O N., and Camadro, E L 1996 Self- and Cross-incompatibility in Asparagus officinalis and Asparagus densiflorus cv Sprengeri Can J Bot 74:1621-1625 25 Meenakshi Nagdeve, (2020) 17 Impressive Benefits of Asparagus 26 Murashige Ta, Skoog; F A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiologia plantarum 1962;15(3):473-497 57 27 Peng M, Wolyn DJ (1999) Development of a microspore culture method to produce haploid and doubled-haploid asparagus (Asparagus officinalis L.) plants Acta Hortic 479:357-364 28 Pontaroli, A C., and Camadro, E L 2001 Increasing resistance to Fusarium crown and root rot in asparagus by gametophyte selection, Euphytica 122:343-350 29 Razdan, MK (2003) Introduction to plant tissue culture 2nd edn, Science Pub Incorporated USA pp: 22-26 30 Reda Elmardi (2022) Nutritional Benefits of Asparagus In Pregnancy 31 Rick, C M., and Hanna, G C 1943 Determination of sex in Asparagus officinalis L., Amer J Bot 30:711-71 32 Robbins, W W., and Jones, H A 1925 Secondary sex characters in Asparagus officinalis L., Hilgardia 1:183-202 33 Rubluo A., Chávez V., Martínez A.P and MartínezVázquez O 1993 Strategies for the recovery of endangered orchids and cacti through in vitro culture Biol Conserv.,63: 163-169 34 Saharan V., 2010 Effect of gibberellic acid combined with saponin on shoot elongation of Asparagus officinalis Biologia Plant 54 (4), 740-742 35 Schurgers LJ (2013) Vitamin K: key vitamin in controlling vascular calcification in chronic kidney disease 36 Shen S., Zou D., Zhang C., Liu S., 1995 Improved rate of callus and plantlet from anther culture of asparagus (Asparagus officinalis L) Acta Hort 402: 299-305 37 Sneep J (1953) The significance of andromonoecy for the breeding of Asparagus officinalis L Euphytica 2: 89-95 38 Štajner N, Bohanec B, Jakše M (2002) In vitro propagation of Asparagus maritimus–A rare Mediterranean salt-resistant species Plant Cell Tissue Organ Cult 70: 269-274 58 39 Thévenin, L 1967 Les problèmes d’amélioration chez Asparagus officinalis L I Biologie et amélioration, Ann Amélior Plantes 17:33-66 40 Tu, C C., Cheng, H., and Cheng, A S 1985 A rapid method for testing resistance to Fusarium wilt in asparagus hybrids, in: Proceedings Sixth International Asparagus Symposium, E C Loughedd and H Tiessen, eds., University of Guelph, Guelph, pp 136-143 41 Watanabe S., Imakawa S and Yakuwa T 1991 Conditions of rooting from shoot apices for mass propagation in asparagus J Fac.Agr Hokkaido Univ 64(4): 292-303 42 Yeager AF, Scott DH (1938) Studies of mature asparagus plantings with special reference to sex survival and rooting habits In Proc Amer Soc Hort Sci 36: 513-514 59