Bước đầu nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây gai xanh (boehmeria nivea)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea) HÀ NỘI – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY GAI XANH (Boehmeria nivea) Người thực : VŨ HIỀN ANH Khóa : 62 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn : TS NINH THỊ THẢO HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn kết nghiên cứu thực Số liệu kết khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2022 Sinh viên thực Vũ Hiền Anh i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập làm việc Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, đặc biệt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật- khoa Công nghệ sinh học, giúp đỡ dìu dắt thầy cô, bạn bè môn hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước hết, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học tồn thể thầy dìu dắt truyền đạt kiến thức vô quan trọng, bổ ích suốt q trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Ninh Thị Thảo dành thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học Thực vật bạn làm khóa luận giúp đỡ tơi hồn thành đề tài Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình, người thân, bạn bè động viên tạo điều kiện cho tơi hồn thành q trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 03 năm 2022 Sinh viên thực Vũ Hiền Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1 Giới thiệu chung gai xanh 2.1.1 Nguồn gốc .4 2.1.2 Phân loại .4 2.1.3 Đặc điểm sinh học gai xanh 2.2 Các phương pháp nhân giống gai xanh 2.3 Giá trị gai xanh 2.3.1 Sợi gai 2.3.2 Giá trị kinh tế xã hội 2.4 Giới thiệu giống gai AP1 2.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro gai xanh 10 PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 13 3.2 Nội dung nghiên cứu 13 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát chế độ khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ .13 3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát chế độ khử trùng hạt gai xanh môi trường gieo hạt 15 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả tái sinh chồi từ đoạn thân nảy mầm môi trường gieo hạt 17 3.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 17 iii 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Khảo sát chế độ khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ 19 4.1.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ 19 4.1.2 Ảnh hưởng kết hợp xử lý acid citric 0,2% chất khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ 21 4.1.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ 22 4.2 Khảo sát chế độ khử trùng hạt gai xanh môi trường gieo hạt 24 4.2.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu khử trùng hạt 25 4.2.2 Ảnh hưởng chất khử trùng presept 0,5% chế phẩm ức chế vi sinh vật PPM đến hiệu khử trùng hạt 26 4.2.3 Ảnh hưởng nồng độ khoáng MS đến khả nảy mầm hạt gai xanh 29 4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt 31 4.3 Khảo sát khả tái sinh chồi từ đoạn thân nảy mầm môi trường gieo hạt 33 4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ 33 4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ mô .35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ Error! Bookmark not defined Bảng 4.2 Ảnh hưởng kết hợp xử lý acid citric 0,2% HgCl2 0,1% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủError! Bookmark not defined Bảng 4.3 Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ Error! Bookmark not defined.3 Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu khử trùng hạt Error! Bookmark not defined.5 Bảng 4.5 Ảnh hưởng chất khử trùng presept 0,5% chế phẩm ức chế vi sinh vật PPM đến hiệu khử trùng hạt Error! Bookmark not defined.7 Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng MS đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Error! Bookmark not defined.9 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Error! Bookmark not defined.1 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ ….………………………………………………………… 3Error! Bookmark not defined Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ mô …… Error! Bookmark not defined.5 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây gai xanh Hình 2.2 Sợi gai thành phẩm Hình 2.3 Ruộng gai xanh AP1 .10 Hình 3.1 Hạt (a) thân (b) gai xanh AP1 .13 Hình 3.2 Chế phẩm ức chế vi sinh vật PPM 16 Hình 4.1 Đoạn thân gai xanh khử trùng hgcl2 0,1% phút (a), phút (b), phút (c) môi trường nuôi cấy sau ngày .20 Hình 4.2 Đoạn thân gai xanh xử lý acid citric 0,2% 20 phút hgcl2 0,1% phút (a), phút (b), 10 phút (c) môi trường nuôi cấy sau 30 ngày 22 Hình 4.3 Đoạn thân gai xanh khử trùng presept 0,5% phút (a), phút (b), phút (c) môi trường nuôi cấy sau 42 ngày 24 Hình 4.4 Chồi nảy mầm từ hạt khử trùng presept 0.5% phút (a), phút (b), phút (c) môi trường gieo hạt sau 31 ngày 26 Hình 4.5 Cây non nảy mầm từ hạt khử trùng presept 0,5% 30 giây (a), phút (b), phút (c) môi trường nuôi cấy chứa PPM sau 53 ngày 28 Hình 4.6 Chồi nảy mầm từ hạt môi trường MS(a), 1/2 MS(b), 1/4 MS(c), 1/8 MS (d) MS (e) sau 31 ngày theo dõi 30 Hình 4.7 Cây non nảy mầm từ hạt môi trường ms (a) 1/2 MS(b) sau 50 ngày 30 Hình 4.8 Cây non nảy mầm từ hạt mơi trường ½ ms có bổ sung mg/l GA3 (a), 1mg/l GA3(b), 2mg/l GA (c), mg/l GA3 (d) 10 mg/l GA3 (e) sau 31 ngày 32 Hình 4.9 Chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt ngủ cấy môi trường ms bổ sung mg/l BA(a), 1mg/l BA(b), mg/l BA(c) mg/l ba (d) sau 46 ngày 35 Hình 4.10 Callus hình thành từ mơi trường ms có bổ sung mg/l BA(a), 0,5 mg/l BA(b), mg/l BA (c) 1,5 mg/l BA(d), mg/l BA(e) mg/l BA(f) sau 46 ngày 36 vi DANH MỤC CÁC CỤM TỪ - KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết Tắt Viết đầy đủ BA 6-Benzylaminopurine CT Công thức ĐC Đối chứng GA3 Gibberellic acid LSV0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS Môi trường Murashige Skoog - 1962 PPM Chế phẩm ức chế vi sinh vật Plant Preservative Mixture vii TÓM TẮT Đề tài tiến hành nhằm xác định số yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo vật liệu khởi đầu quy trình nhân giống in vitro gai xanh (Boehmeria nivea) giống AP1 cung cấp Công ty cổ phần đầu tư phát triển sản xuất & XNK An Phước Kết xác định chế độ khử trùng thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu từ hạt gai xanh, sử dụng presept 0,5% thời gian 30 giây, kết hợp bổ sung PPM (Plant Preservative Mixture) vào môi trường nuôi cấy Mơi trường thích hợp để gieo hạt gai xanh ½ MS + 0,5 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar Đề tài bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến quy trình nhân giống in vitro, cụ thể ảnh hưởng GA3 tới nảy mầm hạt gai xanh ảnh hưởng nồng độ BA tới tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ Kết cho thấy công thức đối chứng (không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng) cho hiệu tốt Các kết nêu đề tài sở ban đầu để thiết lập quy trình nhân nhanh in vitro gai xanh, từ làm cở sở nhân giống gai xanh chất lượng cao để khởi tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu xa lĩnh vực sinh học phân tử chuyển gen viii A B C Hình 4.5 Cây non nảy mầm từ hạt khử trùng presept 0,5% 30 giây (A), phút (B), phút (C) môi trường nuôi cấy chứa PPM sau 53 ngày Có thể nói, việc bổ sung chế phẩm PPM vào môi trường nuôi cấy giúp cải thiện rõ rệt tỷ lệ mẫu Tỷ lệ hạt nảy mầm công thức đánh giá đồng mức chấp nhận thực tế hạt gai xanh nhỏ có sức nảy mầm (Mukherjee et al., 2018) Ngoài ra, nghiên cứu này, nồng độ agar điều chỉnh giảm nhẹ, cịn 4g/l, góp phần làm tăng độ ẩm cho mơi trường, từ thúc đẩy thời gian tỷ lệ nảy mầm hạt Nhìn chung, việc khử trùng presept 0,5% kết hợp sử dụng PPM cho hiệu tốt Các công thức cho kết tương đương tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ hạt nảy mầm chất lượng mầm Do vậy, chọn công thức với thời gian khử trùng ngắn (30 giây) làm công thức tối ưu mặt lý thuyết, thời gian khử trùng ngắn đảm bảo tính tồn vẹn hạt giống Qua nội dung nghiên cứu này, rút chế độ khử trùng hiệu hạt gai xanh, sử dụng presept 0,5% 30 giây, kết hợp với môi trường nuôi cấy chứa 0,5 ml/l chế phẩm PPM nồng độ agar 4g/l 28 4.2.3 Ảnh hưởng nồng độ khoáng MS đến khả nảy mầm hạt gai xanh Nghiên cứu Nguyễn Minh Chiến cs (2019) cà chua Montavi nồng độ khống có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ thời gian nảy mầm hạt Trong thí nghiệm này, chúng tơi bố trí nồng độ khống khác nhằm tìm mơi trường ni cấy phù hợp cho hạt gai xanh Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ khoáng MS đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Công Nồng độ Tỷ lệ Tỷ lệ hạt thức MS hạt nảy mầm (%) (%) Hình thái chồi CT1 MS 100 27a Chồi mập, xanh đậm, phát triển CT2 ½ MS 100 35a thành CT3 ¼ MS 100 34a Chồi mập, xanh đậm, phát triển tốt tuần đầu, sau ngả vàng chậm lớn CT4 1/8 MS 100 39a CT5 MS 100 40a P-value 0,43 LSD0,05 16,55 Chồi còi cọc, nhỏ nhạt màu, thân rễ yếu ớt, nhanh ngả vàng Môi trường nuôi cấy: MS theo công thức + 0,5 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar Các chữ khác cột thể sai khác cơng thức Thí nghiệm sử dụng chế độ khử trùng tối ưu khảo sát từ nội dung nghiên cứu trước cho tỷ lệ mẫu cao, đạt 100% Tỷ lệ nảy mầm hạt tốt có xu hướng tăng dần theo mức độ giảm nồng độ khống: mơi trường MS cho 27% hạt nảy mầm, đó, mơi trường chứa 1/8 MS sử dụng nước cất để thay khoáng MS (0 MS) cho tỷ 29 lệ nảy mầm cao nhất, đạt 39% - 40% Tuy nhiên, sau phân tích thống kê, giá trị p-value > 0,05 cho thấy môi trường nuôi cấy với nồng độ khống khác khơng thực tạo ảnh hưởng khác biệt đến tỷ lệ hạt nảy mầm Về hình thái, chồi phát triển môi trường MS 1/2 MS cho chất lượng tốt nhất: chồi mập khỏe, xanh đậm, có khả phát triển thành non Trong đó, mơi trường cịn lại với nồng độ khoáng giảm mạnh, chất lượng chồi bị ảnh hưởng rõ rệt Với môi trường 1/4 MS, chồi khỏe mạnh vịng tuần (Hình 4.6), sau dần chậm lớn lụi khơng thực cấy chuyển Với môi trường 1/8 MS MS, mầm còi cọc, nhỏ nhạt màu, thân rễ yếu ớt (Hình 4.6), nhanh chóng bị lụi sau 10- 14 ngày Sau 50 ngày theo dõi, có chồi cấy mơi trường MS 1/2 MS có khả phát triển thành (Hình 4.7) A B C D E Hình 4.6 Chồi nảy mầm từ hạt mơi trường MS (A), 1/2 MS (B), 1/4 MS (C), 1/8 MS (D) MS (E) sau 31 ngày theo dõi A B Hình 4.7 Cây non nảy mầm từ hạt môi trường MS (A) 1/2 MS (B) sau 50 ngày Kết thí nghiệm cho thấy, khác với cà chua, nồng độ khống khơng tạo ảnh hưởng đến thời gian tỷ lệ nảy mầm hạt gai xanh Trong đó, thống với kết nghiên cứu Nguyễn Minh Chiến cs (2019), nhận thấy ảnh hưởng rõ rệt nồng độ MS tới chất lượng chồi Tỷ lệ khoáng cao đồng nghĩa với môi trường giàu dinh dưỡng, giúp chồi mập 30 khỏe, phát triển tốt Trong đó, mơi trường khơng chứa có nồng độ khống thấp, hạt nảy mầm tốt chồi cịi cọc, khơng lớn Sau cân nhắc yếu tố tỷ lệ hạt nảy mầm, hình thái chồi khía cạnh kinh tế, chúng tơi chọn nồng độ khống 1/2 MS công thức môi trường tối ưu để gieo hạt gai xanh 4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Gibberellic acid (GA3) chất điều tiết sinh trưởng thực vật có tác dụng kích thích hạt nảy mầm, kích thích tế bào kéo dài theo chiều dọc, giúp thân vươn dài, mọc nhiều chồi nách Trong nghiên cứu rễ tơ đan sâm, Ninh Thị Thảo cs (2015) sử dụng 1mg/l GA3 để kích thích hạt đan sâm nảy mầm Trong nghiên cứu khác nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cọc rào, Đỗ Đăng Giáp cs (2012) thực khảo sát ảnh hưởng GA3 dải nồng độ từ đến mg/l Tham khảo nghiên cứu trên, thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành bổ sung từ đến 10 mg/l GA3 vào môi trường ni cấy để khảo sát cách tồn diện ảnh hưởng GA3 tới tỷ lệ nảy mầm hạt gai xanh hình thái chồi gai xanh Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt Nồng Tỷ lệ Tỷ lệ Công độ mẫu mẫu thức GA3 nhiễm (mg/l) (%) (%) 0 100 CT1 Tỷ lệ hạt nảy mầm Hình thái chồi (%) 41a Chồi mập, xanh đậm, phát triển thành CT2 100 36a Chồi phát triển nhanh, CT3 100 45a hình thành Lóng thân CT4 100 41a 31 rễ dài yếu ớt Lá CT5 10 42a 100 P-value 0,64 LSD0,05 15,17 yếu, thiếu sắc tố diệp lục Môi trường ni cấy: ½ MS+ GA3 nồng độ + 0,5 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar Các chữ khác cột thể sai khác công thức Nghiên cứu sử dụng chế độ khử trùng tối ưu thiết lập đạt tỷ lệ mẫu 100% Bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ hạt nảy mầm công thức dao động từ 36% đến 45% Giá trị p -value = 0,64 > 0,05 cho thấy nồng độ GA3 khác không ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm hạt gai xanh Về hình thái chồi, có khác biệt rõ rệt cơng thức đối chứng khơng chứa GA3 với cơng thức cịn lại Công thức đối chứng cho chồi khỏe, mập, xanh, có khả phát triển thành (Hình 4.8 A) Trong đó, cơng thức chứa GA3, chồi phát triển với tốc độ nhanh nhanh chóng hình thành con, nhiên, có sức sống với thân, rễ, dài yếu ớt, thiếu sắc xanh diệp lục (Hình 4.8 B - E) A B C D E Hình 4.8 Cây non nảy mầm từ hạt mơi trường ½ MS có bổ sung mg/l GA3 (A), 1mg/l GA3 (B), 2mg/l GA3 (C), mg/l GA3 (D) 10 mg/l GA3 (E) sau 31 ngày Như vậy, gai xanh, việc bổ sung GA3 không tạo khác biệt tỷ lệ hạt nảy mầm làm giảm chất lượng chồi Do đó, chúng tơi kết luận việc bổ sung GA3 vào môi trường gieo hạt gai xanh không phù hợp Dựa khảo sát thực nội dung nghiên cứu này, đề xuất môi trường gieo hạt phù hợp cho gai xanh là: ½ MS+ 0,5 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar 32 4.3 Khảo sát khả tái sinh chồi từ đoạn thân nảy mầm môi trường gieo hạt Với tác dụng thúc đẩy phân bào, đặc biệt hạn chế phát triển ngọn, thúc đẩy sinh trưởng chồi nách, 6-Benzylaminopurine, gọi BA, chất điều tiết sinh trưởng sử dụng phổ biến giai đoạn nhân nhanh quy trình ni cấy mơ tế bào thực vật Trong nội dung nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA khác đến khả tái sinh chồi từ đoạn thân nảy mầm môi trường gieo hạt Với số lượng cịn hạn chế, thí nghiệm thực lần với số lượng từ 10-20 mẫu/ cơng thức, khơng lặp lại Vì vậy, nội dung này, không xử lý thống kê số liệu Infostat mà đưa mơ tả giá trị trung bình nhằm định hướng cho nghiên cứu sau 4.3.1 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ Nhiều nghiên cứu chứng minh hiệu việc bổ sung BA đến khả tái sinh chồi nuôi cấy mô nhiểu đối tượng trồng hoa lan huệ (Phạm Đức Trọng cs., 2014), hoa hồng cơm (Nguyễn Thị Phương Thảo cs., 2015), yến thảo (Nguyễn Tiến Long cs., 2021) Trong thí nghiệm này, khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA từ đến mg/l đến tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu, chiều cao trung bình hình thái chồi Bảng 4.8 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ Công Nồng Tỷ lệ Tỷ lệ Số chồi/ Chiều thức độ mẫu mẫu mẫu cao TB BA tạo (chồi) chồi (mg/l) (%) chồi Hình thái chồi (cm) (%) CT1 79 91 7,3 33 Chồi cao, mập, to xanh đậm, rễ phát triển CT2 100 90 3,6 4,1 Chồi mập thấp, đẻ CT3 100 80 3,5 nhiều nhánh, lóng thân CT4 100 82 4,4 ngắn Lá nhỏ, đậm màu, ngả màu đỏ Phần gốc hình thành callus, khơng phát triển rễ Mơi trường nuôi cấy: MS+ BA + 0,25 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar Bảng 4.8 cho thấy đoạn thân mang mắt ngủ gai xanh có khả tái sinh mạnh mẽ tất công thức thí nghiệm, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt từ 80% trở lên Trong đó, tỷ lệ mẫu tạo chồi cao thuộc công thức đối chứng không chứa BA (91%) Do vậy, nhận định việc bổ sung BA khơng có tác dụng cải thiện tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn thân gai xanh Bên cạnh đó, kết thí nghiệm cho thấy việc bổ sung BA gây ảnh hưởng rõ rệt tới số lượng chất lượng chồi tạo thành Ở công thức đối chứng, mắt ngủ phát triển thành chồi Tuy nhiên, chồi có chất lượng tốt với chiều cao trung bình 7,3 cm sau 46 ngày theo dõi, thân mập, to xanh đậm, lóng thân dài vừa phải, hệ rễ phát triển nhanh chóng hình thành (Hình 4.9- A) Trong đó, mơi trường bổ sung BA, chồi mập thấp với chiều cao trung bình khoảng – 4,4 cm sau 46 ngày ni cấy Mỗi chồi có trung bình từ 3,5 – nhánh, lóng thân ngắn, nhỏ, đậm màu, ngả màu đỏ, phần gốc hình thành callus, khơng phát triển rễ (Hình 4.9 – B, C, D) So sánh hình thái chồi mơi trường chứa nồng độ BA khác khơng nhận thấy khác biệt đáng kể 34 A B C D Hình 4.9 Chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt ngủ cấy môi trường MS bổ sung mg/l BA (A), 1mg/l BA (B), mg/l BA (C) mg/l BA (D) sau 46 ngày Kết nêu hoàn toàn phù hợp với lý thuyết tác dụng BA lên mô tế bào thực vật – hạn chế chồi kích thích sinh trưởng chồi nách Từ đó, chúng tơi nhận định việc bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy có tiềm làm tăng hệ số nhân nhanh lên gấp nhiều lần Tuy nhiên, giới hạn khóa luận, chúng tơi chưa thực việc cắt cấy chuyển đoạn mắt ngủ tái sinh mơi trường chứa BA, để từ kiểm tra sức sống khả tái sinh mắt ngủ 4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ mô Để khảo sát khả tái sinh chồi từ gai xanh, thực cắt mẩu gai xanh nuôi cấy môi trường chứa nồng độ BA khác Bảng 4.9 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ mô Công thức Nồng độ Tỷ lệ Tỷ lệ BA mẫu mẫu tạo (mg/l) callus (%) (%) Hình thái chồi CT1 100 Sau tuần theo dõi, CT2 0,5 100 30 số mơ bắt đầu có CT3 100 25 35 dấu hiệu cảm ứng tạo CT4 1,5 100 15 CT5 100 25 CT6 100 20 callus, chưa trực tiếp hình thành chồi Mơi trường ni cấy: MS+ BA + 0,25 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar Kết cho thấy, môi trường đối chứng không chứa chất điều tiết sinh trưởng, khả tái sinh kém, đạt 5% Trong đó, mơi trường chứa BA cho tỷ lệ mẫu tạo callus cao hơn, dao động khoảng từ 15 – 30% Sự tái sinh diễn chậm: sau 46 ngày theo dõi, số bắt đầu có dấu hiệu cảm ứng với hình thái callus chưa rõ ràng (Hình 4.10), chưa có mơ trực tiếp hình thành chồi Hình 4.10 Callus hình thành từ mơi trường MS có bổ sung mg/l BA (A), 0,5 mg/l BA (B), mg/l BA (C) 1,5 mg/l BA (D), mg/l BA (E) mg/l BA (F) sau 46 ngày Có thể nói, khả tái sinh mơ gai xanh chậm nhiều so với khả tái sinh đoạn thân mang mắt ngủ khảo sát thí nghiệm trước 36 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Nghiên cứu bước đầu xác định số kết quy trình nhân nhanh in vitro gai xanh sau: - Chế độ khử trùng sử dụng HgCl2 0,1% presept 0,5% chưa phù hợp với đoạn thân mang mắt ngủ gai xanh - Chế độ khử trùng môi trường gieo hạt gai xanh tốt khử trùng hạt presept 0,5% vịng 30 giây sau gieo hạt mơi trường: 1/2 MS+ 0,5 ml/l PPM + 30g/l đường + g/l agar - Việc bổ sung GA3 vào môi trường gieo hạt không phù hợp - Việc bổ sung BA vào môi trường tái sinh đoạn thân mang mắt ngủ có tiềm làm tăng tỷ lệ nhân nhanh, nhiên cần khảo sát thêm chất lượng chồi hình thành - Lá gai xanh tái sinh tốt môi trường chứa BA so với môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Tuy nhiên, khả tái sinh nhiều so với khả tái sinh đoạn thân mang mắt ngủ 5.2 Kiến nghị Cần tiếp tục khảo sát chế độ khử trùng khác cho hiệu tạo vật liệu khởi đầu tốt Đồng thời khảo sát cơng thức mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ, nhân nhanh chồi, tái sinh callus từ mô bước khác để hồn thiện quy trình nhân nhanh in vitro gai xanh 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Trương Thị Trúc Hà, Thái Xuân Du, Bùi Văn Thế Vinh, Nguyễn Đình Lâm Dương Tấn Nhựt (2012) Ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật lên ni cấy đỉnh sinh trưởng thiết lập hoàn chỉnh Cọc rào (Jatropha curcas L.) Tạp chí sinh học, 2012, 34 (3): 188 – 195 Nguyễn Minh Chiến, Tráng A Chinh Đinh Trường Sơn (2019) Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cho giống cà chua Montavi Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 7: 104 Nguyễn Thị Minh Hồng Nguyễn Thị Thu Hương (2020) Đánh giá khả sinh trưởng phát triển gai (Boehmeria nivea L Gaudich) từ nguồn vật liệu khởi đầu khác khu thực hành Trường Đại học Hồng Đức Tạp chí Khoa học Trường Đại học Hồng Đức, 50 Nguyễn Thị Phương Thảo, Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Thu Hằng, Đặng Thị Thanh Tâm, Ninh Thị Thảo, Nguyễn Thị Lâm Hải Nguyễn Thanh Hải (2015) Nhân nhanh cảm ứng hoa in vitro Hoa hồng cơm (Rosa sericea LINDL) Tạp chí Khoa học Phát triển, 13 (4): 606 -613 Nguyễn Tiến Long, Lã Thị Thu Hằng, Trần Thị Triêu Hà, Dương Thanh Thủy Lê Như Cương (2021) Nghiên cứu tạo nguồn vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro hoa Dạ yến thảo (Petunia hybrida L.) Khoa học Nông nghiệp, 63 (7): 53- 56 Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015) Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), Tạp chí Khoa học Phát triển, 13 (2): 251 – 258 Phạm Đức Trọng, Nguyễn Hạnh Hoa Phí Thị Cẩm Miện (2014) Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro sáu dịng hoa Lan huệ hispeastrum esquestre (Aition) Herb Tạp chí Khoa học Phát triển, 12 (3): 392- 403 Tài liệu nước ngoài: George M.W and Tripepi R R (2001) Plant Preservative Mixture™ can affect shoot regeneration from leaf explants of Chrysanthemum, European birch, and Rhododendron Hortscience, 36 (4): 768–769 Mukherjee P.K., Mondal R., Dutta S., Meena K., Roy M., Mandal A.B (2018) In vitro micropropagation in Boehmeria nivea to generate safe planting materials for large-scale cultivation Czech J Genet Plant Breed., 54: 183−189 Thomas P., Agrawal M and Bharathkumar C.B (2017) Use of Plant Preservative Mixture™ for establishing in vitro cultures from field plants: Experience with papaya reveals several PPM™ tolerant endophytic bacteria Plant Cell Reports, 36: 1717–1730 Wang B., Peng D.X., Sun Z.X., Zhang N and Gao S M (2008) In vitro plant regeneration from seedling-derived explants of ramie [Boehmeria nivea (L.) Gaud] In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 44: 105–111 38 Tài liệu Website: Adminquantri (2016) Giống gai xanh AP1 bén duyên xứ Thanh, viết trang điện tử Tập đoàn An Phước – Viramie ngày 29/6/2016, truy cập vào ngày 15/2/2022 từ https://viramie.vn/giong-gai-xanh-ap1-ben-duyen-xu-thanh/ Adminquantri (2019) Tiềm phát triển gai xanh AP1 Việt Nam, viết trang điện tử Tập đoàn An Phước – Viramie ngày 22/3/2019, truy cập vào ngày 16/2/2022 từ https://viramie.vn/xuat-xu-cay-gai-xanh/ Adminquantri (2020) Có chất liệu q thời trang có “tiếng nói”, viết trang điện tử Tập đoàn An Phước – Viramie ngày 8/7/2020, truy cập vào ngày 5/3/2022 từ https://viramie.vn/co-chat-lieu-quy-thi-thoi-trang-moi-cotieng-noi/ Gai (cây), viết Bách khoa toàn thư mở Wikipedia, truy cập ngày 10/2/2022 từ https://vi.wikipedia.org/wiki/Gai_(c%C3%A2y) Sợi gai 36Nm, thông tin sản phẩm trang điện tử Tập đoàn An Phước – Viramie, truy cập vào ngày 16/2/2022 từ https://viramie.vn/san-pham/soigai-36nm/ Trường Sơn (2021) Cây gai xanh mở hướng cho nông dân, viết báo điện tử Sơn La online ngày 7/6/2021, truy cập ngày 10/2/2022 từ http://www.baosonla.org.vn/vi/bai-viet/cay-gai-xanh-mo-huong-di-moi-cho-nong-dan40227 39 PHỤ LỤC Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng kết hợp xử lý acid citric 0,2% chất khử trùng HgCl2 0,1% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ New table : 3/10/2022 - 12:19:03 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Variable N R² Adj R² CV Ty le mau sach 0.66 0.55 25.82 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 172.22 86.11 5.83 0.0393 Cong thuc 172.22 86.11 5.83 0.0393 Error 88.67 14.78 Total 260.89 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=7.68028 Error: 14.7778 df: Cong thuc Means n S.E 11.00 2.22 A 12.67 2.22 A 21.00 2.22 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ đoạn thân mang mắt ngủ New table : 3/11/2022 - 10:30:25 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Variable N R² Adj R² CV Ty le mau sach 0.50 0.33 31.33 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 219.56 109.78 2.96 0.1277 Cong thuc 219.56 109.78 2.96 0.1277 Error 222.67 37.11 Total 442.22 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=12.17095 Error: 37.1111 df: Cong thuc Means n S.E 13.00 3.52 A 20.33 3.52 A 25.00 3.52 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) 40 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian khử trùng presept 0,5% đến hiệu khử trùng hạt New table : 3/11/2022 - 10:39:56 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Variable N R² Adj R² CV Ty le mam 25 0.13 0.05 66.52 Analysis of variance S.V SS df Model 869.52 Cong thuc 869.52 Error 5872.64 22 Total 6742.16 24 table (Partial SS) MS F p-value 434.76 1.63 0.2190 434.76 1.63 0.2190 266.94 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=16.62502 Error: 266.9381 df: 22 Cong thuc Means n S.E 16.63 5.78 A 25.38 5.78 A 30.89 5.45 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất khử trùng presept 0,5% chế phẩm ức chế vi sinh vật PPM đến hiệu khử trùng hạt New table : 3/12/2022 - 8:33:02 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Variable N R² Adj R² CV Ty le mam 37 0.01 0.00 34.66 Analysis of variance S.V SS df Model 40.40 Cong thuc 40.40 Error 3332.69 34 Total 3373.08 36 table (Partial SS) MS F p-value 20.20 0.21 0.8148 20.20 0.21 0.8148 98.02 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=8.10807 Error: 98.0202 df: 34 Cong thuc Means n S.E 27.17 12 2.86 A 28.75 12 2.86 A 29.69 13 2.75 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng nồng độ khoáng MS đến khả nảy mầm hạt gai xanh New table : 3/15/2022 - 10:15:09 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance 41 Variable N R² Adj R² CV Ty le mam 25 0.17 1.3E-03 36.67 Analysis of variance S.V SS df Model 634.00 Cong thuc 634.00 Error 3146.00 20 Total 3780.00 24 table (Partial SS) MS F p-value 158.50 1.01 0.4269 158.50 1.01 0.4269 157.30 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=16.54630 Error: 157.3000 df: 20 Cong thuc Means n S.E 26.00 5.61 A 32.60 5.61 A 33.40 5.61 A 39.20 5.61 A 39.80 5.61 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng nồng độ GA3 đến hiệu tạo vật liệu khởi đầu từ hạt New table : 3/15/2022 - 10:47:05 AM - [Version : 4/30/2020] Analysis of variance Variable N R² Adj R² CV Ty le mam 28 0.10 0.00 30.04 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value Model 379.01 94.75 0.63 0.6431 Cong thuc 379.01 94.75 0.63 0.6431 Error 3435.10 23 149.35 Total 3814.11 27 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=15.16860 Error: 149.3522 df: 23 Cong thuc Means n S.E 34.67 4.99 A 39.17 4.99 A 42.67 4.99 A 42.80 5.47 A 45.20 5.47 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) 42