PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên) Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (Viện Công nghệ Sinh học)

Tóm tắt

Hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro từ đốt lá

mầm Hạt đậu tương sau khi thu hoạch được nuôi cấy trên môi trường GM: 3052mg/l muối B5; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,8; 6,5g/l agar, vitamin B5 1X Sau 3 ngày hạt nảy mầm có màu xanh cắt bỏ phần trụ rễ, tách đôi lá mầm thành hai mẫu riêng biệt cấy chuyển sang môi trường tạo cảm ứng chồi (môi trường SIM): 3052mg/l muối B5; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6; 6,5g/l agar, vitamin B5 1X; BAP (1mg/l, 1,5mg/l, 1,67mg/l)

Sau 4 tuần cấy chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi (môi trường SEM): 3052mg/l muối B5; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6, 6,5g/l agar; GA3 0,5ml/l (stock 1), zeatin riboside (ZR): 1mg/l, L – asparagine: 50mg/l, L- pyro glutamic acid: 100mg/l; vitamin B5 1X, IAA: 0,1mg/l Khi các chồi dài 5 – 7cm tách riêng từng chồi cấy chuyển sang môi trường ra rễ (môi trường RM): 1,58g/l MS; 20g/l sucrose; 0,58g/l MES; 1mg/l IBA, pH 5,6; agar: 6,5g/l, vitamin B5 1X Khi cây có rễ hoàn chỉnh (lá xanh và

bộ rễ phát triển) được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới Trong quá trình nghiên cứu hệ thống tái sinh cây in vitro từ đốt lá mầm của hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84, đã cho thấy cả hai giống đều có khả năng tạo đa

chồi và tạo cây hoàn chỉnh Khi tạo cảm ứng đa chồi thì nồng độ BAP thích hợp là 1mg/l và khi gây tổn thương có khả năng tạo đa chồi cao

Từ khóa: Đa chồi, đậu tương, Glycine max, in vitro, đốt lá mầm, hệ thống tái sinh

I MỞ ĐẦU

Cây đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao Hạt đậu tương chứa 40-50% protein, 18-25% lipit, 36-40% hydratcacbon và các loại axit amin cần thiết cho cơ thể con người như: xitstein, lizin, triptophan, lơxin, metionin Ngoài ra trong hạt đậu tương còn chứa nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể người và động vật

Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao, kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi luôn được các nhà tạo giống quan tâm Bên cạnh các phương pháp truyền thống đã và đang được sử dụng, phương pháp tạo giống mới bằng kỹ thuật gen di truyền cũng đang là phương pháp mang lại hiệu quả cao trong công tác tạo giống đậu tương với các tính trạng mong muốn (Krishnan, 2005) [2] Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương

đã được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium với

Ti-plasmid qua đốt lá mầm (Chee và cs, 1989;

Donaldson and Simmonds, 2000) [1], [6] hoặc phôi xoma (Yoichi Kita, 2007) [8] và cho đến nay theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81% ở Mỹ; 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil (Letster, 2004) [3] Tuy nhiên, ở Việt Nam, tạo giống đậu tương mới bằng kỹ thuật chuyển gen mới chỉ bắt đầu được quan tâm nghiên cứu

Đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực

hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây Tái sinh in vitro

ở cây đậu tương có thể được thực hiện từ phôi xoma, phôi non và đốt lá mầm [1], [6], [8] Kỹ thuật tái sinh từ đốt lá mầm có ưu điểm về khả năng tái sinh và cho ra chồi cao, thời gian từ khi bắt đầu cho đến khi ra cây được rút ngắn đáng kể còn khoảng 3 tháng (Olhoft và cs, 2003) [5] Thành công của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng và

các yếu tố khác Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng tối ưu ở các loài và giữa các bộ phận cơ thể không giống nhau (Murashige và Skoog, 1962; Vũ Văn Vụ, 1999) [4], [7] Môi trường dinh dưỡng cơ bản bao gồm muối vô cơ (NO-

3, NH4

+ ), nguồn cac bon (đường sacarose, mantose, glucose, galactose ), vitamin (B1, B5 ), và các chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra, người ta có thể bổ sung các thành phần khác như hợp chất nitơ hữu cơ, axit hữu cơ và dịch chiết từ thực vật tuỳ theo mục đích nuôi cấy

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.Nguyên liệu

Hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giống này có thể trồng 3 vụ trong năm, có nhiều ưu điểm, thời gian sinh trưởng ngắn, độ thuần khá, năng suất đạt 2-2,3 tấn/ha, có thể trồng đại trà

Nuôi cấy in vitro được thực hiện trong điều

kiện dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250

C ± 10C

2.Phương pháp nghiên cứu

Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro : hạt của các

giống đậu tương thu nhập được gieo trồng Theo dõi thời gian sinh trưởng, ra hoa kết quả của các giống, khi hạt chín thu cắt quả chín (qua các thí nghiệm chúng tôi nhận thấy các hạt khi vừa đến lúc thu hoạch làm thí nghiệm cho tỷ lệ nảy mầm là 100%)

Khử trùng hạt: Bóc vỏ, chọn những hạt to, mẩy

không bị nứt vỏ đem tráng nước vô trùng hai lần sau đó rửa cồn trong vòng 1 phút, làm lại hai lần, sau đó tráng sạch hạt bằng nước vô trùng, lắc hạt với dung dịch Javen trong vòng 20 phút, đảo, lắc thật đều, tráng sạch hạt bằng nước vô trùng nhiều lần (thí nghiệm với nồng độ cồn và Javen khác

nhau, thời gian khử trùng khác nhau)

Môi trường nảy mầm hạt (GM): Ngâm hạt trong

nước cất 2 giờ sau đó cấy vào bình tam giác trong môi trường GM : Muối B5 + 30g/l sucrose + 6,5g/l aga, PH = 5,8 Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau 0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày Sau thời gian khoảng 2-3 ngày khi hạt đã nảy mầm chuyển sang mầu xanh theo dõi tỷ lệ nảy mầm

Môi trường cảm ứng tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy

mầm dùng dao giải phẫu cắt bỏ phần lớn trụ rễ, chừa lại khoảng 3-5 mm cách từ nốt lá mầm xuống, tách đôi lá mầm thành hai mẫu cấy riêng biệt, cắt bỏ phần lá mầm, theo dõi tạo đa chồi qua quá trình không gây thương tổn, gây thương tổn bằng dao và gây thương tổn bằng đầu điện Các mảnh cấy được cấy lên môi trường cảm ứng chồi (SIM) với các nồng độ BAP khác nhau (Bảng 1) Làm thí nghiệm với cấy mầm trên bề mặt môi trường SIM và thí nghiệm cấy nghiêng 450C trong môi trường SIM Nuôi dưới đèn neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi là 250

C ± 10C Đánh giá tỷ lệ nảy chồi/ mảnh cấy và số chồi/ 1 mảnh cấy

Môi trường cảm ứng kéo dài chồi: Sau 4 tuần

chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM) (Bảng 1) MS: 4,3 g/l; 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5,6; 6,5g/l agar + GA3 : 0,5 ml/l ( stock 1); Zeatin riboside (ZR) :1mg/l L-asparagine : 50mg/l; L-pyroglutamic acid : 100mg/l ; IAA : 0,1 mg/l; Vitamin B5: 1X

Môi trường ra rễ: Sau khi các chồi có kích thước

khoảng 5 – 7cm thì chuyển sang môi trường ra rễ (RM) gồm có: 1,58g/l : MS; 20g/l sucrose; 0,59g/l MES; 1mg/l: IBA; pH = 5,6; agar: 6,5 g/l +

Vitamin B5 : 1X

Tái sinh cây hoàn chỉnh: Cây tái sinh hoàn chỉnh

được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới

Bảng 1 Thành phần các môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh cây từ đốt lá mầm

Loại môi trường Ký hiệu Thành phần cơ bản

Cảm ứng tạo chồi GM 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, pH5.8; 6,5g/l agar + vitamin B5 1X

Cảm ứng tạo đa chồi

SIM 1 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5.6; 6,5g/l agar + 1mg/l BAP + vitamin B5 1X

SIM 1,5 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5.6; 6,5g/l agar + 1,5 mg/l BAP + vitamin B5

SIM 1,67 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5.6; 6,5g/l agar + 1,67mg/l BAP + vitamin B5 1X

Cảm ứng kéo dài chồi SEM MS:4,3 g/l; 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5.6; 6,5g/l agar + GA3 : 0,5 ml/l ( stock 1); Zeatin riboside (ZR) :1mg/l L-asparagine : 50mg/l; L-pyroglutamic acid : 100mg/l ; IAA : 0,1 mg/l; vitamin B5: 1X

Cảm ứng ra rễ RM 1,58g/l : MS; 20g/l succro; 0,59g/l MES; IBA(1mg/l, 1,5mg/l, 2mg/l); pH = 5,6; agar: 6,5 g/l + vitamin B5 : 1X

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Ảnh hưởng của nồng độ cồn và javen đến khả năng khử trùng hạt đậu tương

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với cồn trong thời gian một phút và javen trong thời gian 20 phút với các nồng độ của cồn và javen đều là: 50%, 60%, 70%, 80% Kết quả nghiên cứu chúng tôi thấy cồn ở nồng độ 70% và giaven với nồng độ 60% thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu tương, vừa đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao (98% – 100%) và tỷ lệ nhiễm thấp Trong thực tế hạt đậu tương là đối tượng rất khó khử trùng, nếu khử trùng bằng cồn và nước javen với nồng độ quá cao và thời gian quá dài thì hạt bị tổn thương và không nảy mầm được Ngược lại, nếu nồng độ cồn và javen quá thấp và thời gian ngắn thì không đủ khử nhiễm nên tỷ lệ nhiễm cao sau khi cấy

2 Môi trường nảy mầm của hạt

Hạt đã khử trùng ngâm trong nước cất hai tiếng sau đó cấy trên môi trường GM Ở giai đoạn nảy mầm, hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn trong hạt nên môi trường chỉ cần cung cấp những chất cơ bản và chưa cần cung cấp nhóm kích thích sinh trưởng Ở cả hai giống ĐT12 và ĐT84 đều sau 1 ngày hạt bắt đầu nứt vỏ và sau 3 ngày hạt nảy mầm hoàn chỉnh và bắt đầu chuyển sang màu xanh, tỷ lệ nảy mầm đạt 98% – 100%

3 Môi trường cảm ứng tạo chồi

Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cảm ứng chồi

Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi từ nách lá mầm Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài thực vật cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và xytokinin như IAA, IBA, BAP Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh trưởng xytokinin được sử dụng phổ biến để tạo cảm ứng chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau Vì việc sử dụng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp có ý nghĩa

quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của cây Đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào (Vũ Văn Vụ, 1999) [7]

Khả năng tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi/ một mảnh lá mầm là những thông số dùng để đánh giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi

cấy in vitro nhằm sử dụng cho mục đích chuyển

gen sau này Kết quả ở bảng 2 cho thấy khả năng tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi/ 1 mảnh lá mầm nuôi cấy ở các nồng độ BAP khác nhau trên 2 giống đậu tương ĐT12 và ĐT84

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả hai giống có khả năng tạo cảm ứng chồi ở môi trường có bổ sung 1,5mg/l BAP với tỷ lệ tạo chồi như sau:

giống ĐT12 sau 2 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt 89,5%, sau 4 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt 91,2% và số chồi TB/ 1 mảnh lá mầm là 1,8 Giống ĐT84 sau 2 tuần tỷ lệ

tạo chồi đạt 91,6%, sau 4 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt 92,1%, số chồi trung bình trên một mảnh lá mầm là

1,9

Hình 1 Hạt giống ĐT12 nuôi cấy trên môi trường GM sau 3 ngày

Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cảm ứng chồi

Giống đậu tương

Nồng độ BAP (mg/l)

Mẫu TN Số mảnh cấy

Tỷ lệ tạo chồi sau 2 tuần

Tỷ lệ tạo chồi sau 4 tuần

Số chồi TB/ 1 mảnh lá

Chất lượng chồi ĐT12

Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần

Hình 3 Hình ảnh giống ĐT12 sau 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần nuôi cấy trên môi trường SIM

Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng tạo cảm ứng chồi

Sau khi hạt đậu tương nảy mầm 3 – 5 ngày cắt bỏ trụ rễ để lại 3- 5mm, tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy riêng biệt Chúng tôi tiến hành thí nghiệm cấy các mẫu mảnh lá mầm không gây thương tổn và gây thương tổn bằng dao giải phẫu, kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3

Gây thương tổn là một trong những tác động

tạo chồi Kết quả ở bảng 3 cho thấy khi không gây thương tổn từ lá mầm thường chỉ phát triển một chồi, nhưng khi gây thương tổn bằng dao giải phẫu thì số chồi tạo thành tăng lên rõ rệt (2 – 4 chồi)/ 1 mảnh lá mầm Như vậy, tỷ lệ tạo đa chồi khi gây thương tổn bằng dao giải phẫu lớn gấp 2 lần so với những mẫu thí nghịêm không gây thương tổn Và ở cả hai giống đậu tương có sự chênh lệch không đáng kể dưới ảnh hưởng của tác động gây thương tổn

Bảng 3 Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng tạo chồi

Hình 4 Các mẫu ĐT84 sau khi gây thương tổn tạo chồi (A, B, C, D, E) và không gây thương tổn (F)

Khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT 84

Sau khoảng thời gian 2 tuần khi chồi được hình thành cấy chuyển sang môi trường SEM có bổ sung các chất dinh dưỡng khác nhau tạo thuận lợi cho sự phát triển của chồi và chuẩn bị cho cây ra rễ Trong đó có bổ sung hai chất kích thích sinh trưởng đó là GA3 và IAA, trong đó IAA thuộc nhóm kích thích sinh trưởng auxin và là dạng auxin chủ yếu và quan trọng nhất của tất cả các thực vật kể cả thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao Còn GA3 thuộc nhóm kích thích sinh trưởng gibberellin, hiệu quả sinh lý rõ nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân do GA3 kích thích lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc Chính vì vậy nó có tác dụng kéo dài chồi (Vũ Văn Vụ, 1999) [7]

Kết quả sau 3 tuần cả hai giống ĐT12 và ĐT84 đều cho chồi có kích thước đạt 5 – 7cm

Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Trong môi trường ra rễ chúng tôi có bổ sung IAB với các nồng độ 1mg/l, 1,5mg/l, 2mg/l IBA thuộc nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kích thích rễ phát triển Tuy nhiên khi sử dụng IAB trong giai đoạn sinh trưởng của rễ thì cần nồng độ IAB thấp, nếu dùng nhiều có khả năng gây ức chế

Kết quả nghiên cứu cho thấy IBA ở nồng độ 1mg/l thích hợp cho sự ra rễ của cả hai giống đậu tương Giống đậu tương ĐT12 tỷ lệ ra rễ đạt 98%, tỷ lệ ra rễ của giống ĐT84 đạt 97% Nồng độ IBA không tỷ lệ thuận với tỷ lệ ra rễ vì khi nồng độ IBA tăng thì khả năng ra rễ lại giảm

Số mẫu thí nghiệm

Số lượng rễ (%)

Chất lượng rễ (%)

Số lượng rễ (%)

Chất lượng rễ (%)

Cả hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 đều có

khả năng tái sinh cây in vitro từ đốt lá mầm

Đã hoàn thiện hệ thống tái sinh từ đốt lá mầm đối với hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 Điều kiện khử trùng thích hợp là cồn 70%

và javen 60% Môi trường tạo đa chồi có hiệu quả là môi trường có bổ sung BAP với nồng độ 1,5mg/l và các mẫu cấy có gây thương tổn Môi trường ra rễ có bổ sung IBA với nồng độ thích hợp là 1mg/l đối với cả hai giống ĐT12 và ĐT84

Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài Khoa học-Công nghệ cấp

Bộ Giáo dục&Đào tạo B2009-TN do PGS.TS Chu Hoàng Mậu làm chủ nhiệm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Donaldson P.A., Simmonds D.H., (2000), Susceptibility to Agrobacterium tumefaciens and cotyledonary node transformation in short-season

soybean Plant Cell Reports, 19: 478–484

[2] Krishnan HB (2005), Engineering soybean for enhanced

sulfur amino acid conten Crop Sci 45: 454 – 461

[3] Lester MC (2004), Understanding biochechnology in Agriculture, 8(3): 21 – 29

[4] Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for

rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol plant 15: 473 – 497

[5] Olhoft PM, Flagel LE, Christopher MD and Somers DA 2003 Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node

method Planta, 216: 723-735

[6] Paula P Chee, Krystal A Fober, and Jerry L

Slightom (1989, Transformation of Soybean (Glycine max) by Infecting germinating Seeds with

Agrobacterium tumefaciens Plant Physiol,

91:1212-1218

[7] Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb

Đại học Quốc gia Hà Nội (148 trang)

[8] Yoichi Kita, Keito Nishizawa, Masakazu Takahashi, Masahiko Kitayama, Masao Ishimoto (2007), Genetic improvement of the somatic embryogenesis and regeneration in soybean and transformation of the

improved breeding lines Plant Cell Rep, 26: 439–447

Two soybean cultivars: DT 12 and DT 84 are used in vitro regeneration system research through

cotyledonary nodes The harvested soybean seed is transplanted in the GM medium: 3052mg/l salt B5, 10ml MSIV, 30/l sucrose, and 0.6369 g/l MES, pH 5.8, 6.5g/l agar, vitamin B5 1X After 3 days of sprout shoot, the bud is green, and cut the radicle, the cotyledonary nodes is divided into 2 separate samples which will be sprouted in SIM medium: 3052mg/l salt B5, 10ml MS IV, 30g/l sucrose, 0.6369 g/l MES, pH 5.6, 6.5g/l agar, vitamin B5 1X, BAP (1mg/l, 1.5mg/l, 1.67mg/l)

The tree will be moved to SEM medium after 4 weeks 3052mg/l salt B5, 10ml MS IV, 30g/l sucrose, 0.6369 g/l MES, pH 5.6, 6.5g/l agar, GA3 0.5ml/l (stock 1), zeatin riboside (ZR): 1mg/l, L – asparagine: 50mg/l , L- pyro glutamic acid: 100mg/l, vitamin B5 1X, IAA: 0.1mg/l When buds are about 5-7cm in length, separate them and move to the RM medium: 1.58g/l MS, 20g/l sucrose, 0.58g/l MES, 1mg/l IBA, pH 5.6, agar: 6.5g/l, vitamin B5 1X When the tree has a fully-developed root (green leaves and a fully-developed root), it is grown in the net house In the research process, both soybean cultivars have the ability to making multi-bud and fully-developed tree When the bud making induction with appropriate BAP concentration is

1.5mg/l, DT12’s bud making capacity is 91.2%, DT84 is 92.1% If cotyledonary nodes is harmed, the average

multi-bud rate of DT12 is 2.31 per piece of cotyledonary nodes and DT84 is 2.18, double compared with unharmed

Key words: Multi-bud, soybean, Glycine max, in vitro, cotyledonary nodes, regeneration system