Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill].

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương loại trồng chiến lược nhiều quốc gia giới Hạt đậu tương có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, chứa 40% - 50% protein, 18% -25% lipit, chứa nhiều loại axit amin cần thiết (lizin, triptophan, metionin, xystein, lozin ) nhiều loại vitamin (B1, B2, C, D, E, K ), nguồn lượng cần thiết cho sống người Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, hệ rễ có nốt sần mang vi khuẩn cố định đạm nên đậu tương thường trồng luân canh với lúa ngô để tăng vụ cải tạo đất bạc màu Với giá trị to lớn mà đậu tương trồng phổ biến nhiều nơi từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới, từ 550 vĩ Bắc đến 550 vĩ Nam, từ vùng thấp mực nước biển vùng cao 2000m so với mực nước biển với diện tích khoảng 74,4 triệu [4], [9] Trong đó, chúng trồng nhiều Mỹ, Braxin, Argentina, Trung Quốc, Ấn Độ Ở Việt Nam đậu tương gieo trồng vùng nông nghiệp nước Các giống đậu tương nước ta phong phú gồm giống đậu tương nhập nội, giống lai tạo, giống đậu tương đột biến tập đoàn giống đậu tương địa phương Các giống đậu tương địa phương đa dạng phong phú kiểu hình kiểu gen, nguồn nguyên liệu để chọn tạo giống đậu tương cho suất chất lượng phù hợp với mục tiêu chọn giống [9] Tạo giống đậu tương có suất cao, kháng bệnh, chống chịu với điều kiện bất lợi biến đổi khí hậu nhà tạo giống quan tâm Bên cạch phương pháp truyền thống, phương pháp tạo giống công nghệ sinh học phương pháp mang lại hiệu cao công tác chọn giống đậu tương với tính trạng mong muốn Ở Việt Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nam, tạo giống đậu tương công nghệ sinh học bắt đầu quan tâm nghiên cứu Một công cụ quan trọng tạo giống công nghệ sinh học kĩ thuật chọn dòng tế bào soma, với tần suất tạo biến di truyền ngẫu nhiên khoảng 10 -5- 10-8, nuôi cấy mô sẹo xem nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống chịu trồng (Lê Trần Bình cs, 1997) [1] Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh khâu quan trọng việc ứng dụng công nghệ sinh học để cải tạo giống theo hướng tăng cường khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi đậu tương Xuất phát từ lí lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu nước kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng nuôi cấy in vitro - Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương - Đánh giá khả chịu hạn đậu tương kỹ thuật thổi khô mô sẹo ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, (giờ) - Khảo sát môi trường tái sinh tạo hoàn chỉnh - Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá thay đổi hệ gen dòng đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu nước - Thiết lập sơ đồ hình xác định khoảng cách di truyền dòng đậu tương nghiên cứu - Tuyển chọn dòng đậu tương ưu tú để tiếp tục theo dõi, đánh giá hệ tiếp sau Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Đậu tương có tên khoa học (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có NST 2n = 40, có nguồn gốc từ Trung Quốc loại trồng hàng năm không thấy xuất loài hoang dại Các giống đậu tương địa phương nước ta du nhập từ Trung Quốc từ lâu [4] Cây đậu tương trồng cạn ngắn ngày, khó tìm thấy loại có tác dụng nhiều mặt hiệu kinh tế cao đậu tương Về thực phẩm hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao 40% - 50% protein, 18% - 25 % lipit 20% gluxit [9] Protein đậu tương có phẩm chất tốt loại protein thực vật, có đầy đủ cân đối loại axit amin cần thiết Lipit đậu tương chúa tỷ lệ lớn axit béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%), số iot cao (120- 137) có tác dụng phòng chống bệnh biếu cổ cho người, đặc biệt vùng trung du miền núi Hạt đậu tương nhiều khoáng có khả cung cấp lượng lớn (4.710kcal), người ta chế biến hạt đậu tương thành 600 sản phẩm khác [9] Đậu tương trồng lấy hạt, cung cấp dầu quan trọng lấy dầu Hiện qua thống kê FAO cho thấy từ năm 1980 trở lại sản lượng đậu tương giới tăng lên lần chủ yếu nhờ vào tăng suất diện tích Trong vòng 20 năm qua diện tích gieo trồng tăng nhanh, suất bình quân tăng cao 23 tạ/ha Các nước sản xuất đậu Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tương đứng đầu giới: Mỹ, Brazin, Argentina Trung Quốc chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu tương giới [9] Ở Việt Nam, đậu tương trồng vùng nông nghiệp, vùng núi phía Bắc có diện tích gieo trồng lớn 46,6%, đồng Sông Hồng 19,3%, vùng Tây Nguyên 11%, miền Đông Nam Bộ 10,2%, đồng Sông Cửu Long 8,9%, khu Bốn 2,3% vùng Duyên hải miền Trung 1,6% [9] Cây đậu tương chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta, đặc biệt vùng nông thôn nghèo, kinh tế chưa phát triển Tuy nhiên, việc sản xuất đậu tương nước chưa đầu tư cao, suất thấp, nghiên cứu cải tiến đặc điểm nông học giống địa phương tạo giống có suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái vùng khác phương pháp truyền thống kết hợp với đại đáp ứng yêu cầu thực tiễn đặt chiến lược quan trọng phát triển đậu đỗ nước ta 1.1.2 Đặc điểm sinh học sinh thái học đậu tƣơng Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm không khí tạo thành đạm dễ tiêu [4] Các công trình nghiên cứu cho thấy giống có khả cộng sinh có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân đậu tương thân thảo, phân cành dạng bụi, đậu tương kép với chét, có 4-5 chét Đậu tương tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt trắng, hoa mọc từ nách ngọn, đậu tương thuộc loại ráp, thẳng cong, có nhiều lông chín có màu vàng xám Hạt đậu tương nội nhũ Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mà có lớp vỏ bao quanh phôi lớn Hạt có hình tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt đa dạng dao động từ 20-400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt giống khác nhau, biểu đặc trưng giống Cây đậu tương có loại hình sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn sinh trưởng vô hạn, thời gian sinh trưởng thường chia nhóm chín sớm, trung bình muộn Theo thời gian sinh trưởng, nhà chọn giống đậu tương cho giống chín sớm (75-90 ngày), giống chín sớm (90-100 ngày), giống chín trung bình (100-110 ngày), loại chín muộn trung bình (110-120 ngày), giống chín muộn (130-140 ngày), giống chín muộn (140150 ngày) thời gian sinh trưởng yếu tố quan trọng để lựa chọn trồng luân canh xen vụ Đậu tương tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương có giống trồng vào vụ hè, có giống trồng vào vụ đông, có giống trồng vụ xuân hè có giống trồng thích hợp với vụ thu đông [9] Các họ đậu nói chung, đậu tương nói riêng có nhu cầu nước cao loại khác thuộc nhóm chịu hạn Đó hạt đậu tương có hàm lượng protein lipit cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần 500 – 530 kg nước, trình nảy mầm nhu cầu nước đậu tương cao 50%, ngô 30%, lúa 20% [9] Hạn tượng thường xuyên xảy tự nhiên dẫn đến tình trạng thiếu nước đặc biệt thực vật Khái niệm hạn dùng để thiếu nước môi trường gây nên suốt trình hay giai đoạn làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển Những trồng có khả trì phát triển cho suất tương đối ổn định Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều kiện khô hạn gọi chịu hạn Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn đậu tương phương diện sinh lý di truyền cho thấy đặc tính liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hóa keo chất nguyên sinh, đặc điểm trình trao đổi chất Tính chịu hạn đậu tương tính trạng đa gen Chúng thể nhiều khía cạnh khác nhau: phát triển nhanh rễ, tính chín sớm tương đối, chất di truyền giống có khả sử dụng nước tiết kiệm trình sinh trưởng phát triển Căn vào đặc điểm này, đậu tương chia thành hai nhóm: - Nhóm chịu nước giai đoạn phát triển - Nhóm chịu thiếu nước tất giai đoạn phát triển 1.2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG 1.2.1 Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào soma Cơ sở khoa học chọn dòng tế bào thực vật tính toàn tế bào thực vật Mỗi tế bào lấy từ thể thực vật khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Điều nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở thứ hai mô quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm số lượng lớn tế bào không đồng Vì quần thể tế bào nuôi cấy xem quần thể thực vật mà diễn thay đổi kiểu gen, kiểu hình tuổi Khi tế bào tái sinh thành thể thay đổi mức độ thể Những biến đổi di truyền tự phát xảy trình nuôi cấy mô tế bào Larkin Scowcroft (1982) gọi ―biến di sinh dưỡng‖ hay ―biến dị soma‖ Giải thích xuất biến dị soma Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều kiện in vitro có nhiều ý kiến khác Theo Skirvin CS (1994), xuất biến dị soma rối loạn phân bào nguyên nhiễm gây chất kích thích sinh trưởng có mặt số chất môi trường nuôi cấy Sự hình thành biến dị soma đột biến số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể, tái tổ hợp phân bào nguyên nhiễm[13], phát huy tác dụng yếu tố di truyền vận động, methyl hóa ADN…[1] Các loại mô phân hóa tách từ thể thực vật có khả tái sinh trực tiếp thành cây, chúng có khả phát triển trực tiếp từ tế bào mô sẹo (callus) Trong phương thức nuôi cấy phổ biến nuôi cấy mô sẹo nghiên cứu nhiều đối tượng Mô sẹo loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục, có khả phân hóa thành phôi, chồi hoàn chỉnh Mô sẹo hình thành qua nuôi cấy in vitro từ quan sinh dưỡng thực vật Trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin, điều kiện nuôi cấy thích hợp mô sẹo hình thành trì thông qua cấy chuyển tái sinh Các mô sẹo sau xử lý điều kiện cực đoan khả sinh trưởng tái sinh tăng lên rõ rệt [35] Nhiều nghiên cứu cho thấy, tái sinh từ mô sẹo có biến đổi di truyền phong phú [16] Tuy nhiên, với loại thiết phải nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy tối ưu thích hợp cho việc đánh giá tái sinh Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới khả tái sinh nguồn gốc mô sẹo [23], mức bội thể mô sẹo, thành phần nồng độ chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy Theo Lê Trần Bình CS (1995) tách động điều kiện cực đoan mức độ thời gian định mô hay tế bào thường chết, tế bào có sức sống sống sót cho hiệu tái sinh cao [3] Để đạt hiệu chọn dòng nuôi cấy mô sẹo người ta phải sử dụng khối mô có kích thước nhỏ nhằm Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hạn chế chọn lọc không triệt để kích thước lớn không đồng khối mô sẹo ban đầu 1.2.2 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện người ta phát thấy nhóm chất kích thích sinh trưởng thực vật là: auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, absixic acid Những chất phân thành nhóm dựa vào tính tương đồng cấu trúc chức sinh lý, nhiên chức nhiều chúng có tác động chồng chéo lẫn Còn số nhóm khác điều khiển giai đoạn sinh trưởng định Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng dẫn xuất auxin, cytokinin giberelin Nhóm auxin nhóm kích thích sinh trưởng nhà sinh lý học thực vật phát quan tâm sớm Auxin hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào phân hóa quan, kiểu tác động liên quan đến làm chuyển đổi mềm hóa màng tế bào Chính chức người ta sử dụng đánh giá hoạt tính nó, ví dụ cách đo phần kéo dài mầm yến mạch trồng điều kiện tối biết hoạt tính auxin Nhóm auxin bao gồm chất sau: 2,4 Diclorophenoxyacetic acid (2,4-D), α - Naphtylacetic acid (α-NAA), Indolacetic acid (IAA), 2,4- D dễ gây độc có tác dụng kích thích trình phân chia tế bào nên thường sử dụng nhiều [16] α NAA có tác dụng làm tăng hô hấp tế bào mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym ảnh hưởng mạnh đến trình trao đổi nitơ, tăng khả tiếp nhận sử dụng chất môi trường, α-NAA có tác dụng tạo rễ cho non mạnh auxin khác [16] Nhóm giberelin nhóm phát qua nghiên cứu bệnh lúa von, tác động làm tế bào dãn phân chia, làm lùn cao Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm giberilic acid (GA3), chất sử dụng rộng rãi nông nghiệp Nhóm cytokinin nhóm chất kích thích sinh trưởng có tác dụng làm tăng phân chia tế bào Các cytokinin dùng nuôi cấy mô kinetin 6- benzyl aminopurin (BAP) phát nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô Ethylen nhóm có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển gần chúng coi hoocmon thực vật Ethylen thường sử dụng để làm chín đồng loạt chuối, hoa đồng loạt dứa, ảnh hưởng đến trình phân bào [16] Abscisis acid (ABA) thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng, có tác dụng làm tăng cường khả chống chịu tế bào thực vật điều kiện ngoại cảnh bất lợi [16], ABA đưa vào môi trường tái sinh mang lại hiệu định 1.2.3 Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng tế bào có khả chống chịu Nguyên lý kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật tượng tế bào thực vật nuôi cấy tế bào mô sẹo điều kiện in vitro chúng thường có biến đổi di truyền tự phát, gọi chúng biến dị tế bào soma (biến dị soma) Xử lý mô sẹo tác nhân phi sinh học điều kiện phòng thí nghiệm cho phép chọn dòng tế bào thích hợp theo định hướng chọn lọc Tuy vậy, loài thực vật người ta phải nghiên cứu trạng thái nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng Đến chọn dòng tế bào chịu stress số loài thực vật lúa, lạc, đậu, ngô người ta sử dụng số hệ thống nuôi cấy sau đây: Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo khối tế bào mô mền có cấu trúc thấp, chưa phân hóa, phân chia cách hỗn loạn có tính biến động di Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn truyền cao Mô sẹo thu nuôi cấy in vitro quan phận khác thực vật thân, lá, rễ, hoa .trong môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo trì môi trường nuôi cấy cách cấy chuyển có định kỳ, nhiên thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả tái sinh cây; ii) tăng tính biến động di truyền mô Các tế bào di truyền có tính ổn định di truyền thấp Nhiều tác giả công bố nhận tái sinh từ mô sẹo thông qua nhiều lần cấy chuyển có thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) biến đổi di truyền khác Vì việc nhân nhanh trì tính đồng di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận trọng nhiều loại thực vật sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh hoàn chỉnh thông qua đường tạo phôi vô tính Mặt khác tái sinh từ mô sẹo với biến đổi di truyền phong phú lại có ý nghĩa việc chọn giống vật liệu di truyền trở lên phong phú (Lê Trần Bình CS) [1] [2] [3], (Bùi Bảo Hoàn) [6] Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù nuôi cấy tế bào đơn (single cell) cụm nhỏ tế bào (cell agregate) môi trường lỏng Các tế bào tạo từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi…Muốn thu tế bào huyền phù nhỏ, cần sàng lọc liên tục qua loại sàng có mắt lọc nhỏ (< 0,5 mm) Để đạt nuôi cấy huyền phù tương đối cần phải sàng lọc hàng chục lần, thời gian cần thiết để thiết lập môi trường nuôi cấy huyền phù 2-3 tháng Đây điều trở ngại nghiên cứu với thực vật thời gian nuôi cấy dài tế bào huyền phù khả tái sinh Lúc việc chọn dòng gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống Vì trường Số hóa Trung tâm Học liệu - Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... sĩ là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu nước kỹ thuật nuôi cấy in vitro... để đánh giá thay đổi hệ gen dòng đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu nước - Thiết lập sơ đồ hình xác định khoảng cách di truyền dòng đậu tương nghiên cứu - Tuyển chọn dòng đậu tương ưu tú để tiếp... vitro - Khảo sát môi trường tạo mô sẹo phôi hạt đậu tương - Đánh giá khả chịu hạn đậu tương kỹ thuật thổi khô mô sẹo ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, (giờ) - Khảo sát môi trường tái sinh tạo hoàn