Luận văn nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tu

Luận văn nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ---------  --------- NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO CHO CÂY LILY SIBBERIA VÀ BƯỚC ðẦU CHUYỂN GEN NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 606201 Người hướng dẫn : PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI - 2007 Trng i hc Nụng nghip H Ni - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip -------------------- i LI CAM OAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và cha từng đợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ đợc chỉ rõ nguồn gốc. H Ni, ngy 10 thỏng 9 nm 2007 Tỏc gi lun vn Nguyn Th Hng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội, ñã tạo ñiều kiện về vất chất cũng như tinh thần tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi làm việc cũng như thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. ðinh Trường Sơn, và toàn thể anh chị em của Viên Sinh học Nông nghiệp ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi thực hiện ñề tài. Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2007 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- iii MỤC LỤC Trang 1. më ®Çu 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục ñích, yêu cầu của ñề tài 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 3 1.2.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của ñề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1. Giới thiệu chung về cây hoa lily 5 2.1.1. Nguồn gốc 5 2.1.2. Vị trí phân loại thực vật 5 2.1.3. ðặc tính sinh vật học 6 2.1.4. Tình hình phát triển hoa lily 7 2.1.4.1. Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới 7 2.1.4.2. Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam 8 2.2. Chuyển gen ở thực vật 9 2.2.1. Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen 9 2.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 9 2.3. Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật 10 2.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào. 10 2.3.1.2. Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào 11 2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật. 13 2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 2.3.2.1. Ti-plasmid 15 2.3.2.2. Chức năng của T-ADN 15 2.3.2.3. Chức năng của gen Vir 16 2.3.2.4. Cơ chế lây nhiễm 19 2.3.2.5. Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 22 2.4. Tình hình phát triển cây trồng chuyển gen 23 2.4.1. Những hướng chuyển gen chính ở thực vật 23 2.4.2. Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu 25 2.5. Nghiên cứu chuyển gen trên cây hoa lily 26 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- iv 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1. ðối tượng nghiên cứu 29 3.2. Nội dung nghiên cứu 30 3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen 30 3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza 30 3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin 30 3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin 31 3.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 32 3.2.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường saccaroza 33 3.2.2. Các thí nghiệm chuyển gen. 33 3.3. Phương pháp nghiên cứu 34 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tái sinh mô vẩy củ tạo mẫu cho chuyển gen. 34 3.3.2. Phương pháp nuôi cấy và lây nhiễm vi khuẩn. 34 3.3.3. Cách bố trí thí nghiệm 35 3.3.4. Chỉ tiêu theo dõi 35 3.3.5. ðịa ñiểm và thời gian thực hiện 36 3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro 37 4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ saccaroza 38 4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của chất ñiều tiết sinh trưởng 41 4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin 41 4.1.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất auxin 46 4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng 52 4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường sacaroza 60 4.2. Nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens 63 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của cefotaxime 64 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy 66 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 74 5.1. Kết luận 74 5.2. ðề nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 PHỤ LỤC 1 80 PHỤ LỤC 2 81 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl adenin αNAA α-Naphthylacetic acid IAA Indol acetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 ðC ðối chứng psht Phát sinh hình thái ðNC ðồng nuôi cấy GFP Green fluoresence protein AS Acetosyringone Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 38 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kinetin ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 42 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của BA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 43 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của IAA ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy 46 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của αNAA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 47 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 49 Bảng 4.7. Ảnh hưởng tổ hợp kinetin + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 53 Bảng 4.8. Ảnh hưởng tổ hợp BA + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 56 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D + saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy 60 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của cefotaxime ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lát mỏng vẩy củ 64 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng ñộ cefotaxime ñến khả năng diệt khuẩn 66 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mọc khuẩn 67 Bảng 4.13. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu sạch và mẫu sống sau khi diệt khuẩn 70 Bảng 4.14. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen chỉ thị GFP 71 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 14 Hình 2.2. Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-ADN 20 Hình 2.3. Mô hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 21 Hình 3.1. Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia” 29 Hình 3.2. Sơ ñồ Plasmid mang gen GFP 29 Hình 4.1. Mẫu tái sinh tạo callus, chồi và rễ trên môi trường 30g/l sacaroza 40 Hình 4.2. Ảnh hưởng của sacaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ 40 Hình 4.3. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l kinetin 45 Hình 4.4. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l BA 45 Hình 4.5. Ảnh hưởng của BA và kinetin ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ 45 Hình 4.6. Mẫu tái sinh tạo callus, rễ trên môi trường 2mg/l αNAA 51 Hình 4.7. Mẫu tái sinh tạo callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D 51 Hình 4.8. Ảnh hưởng của IAA, αNAA và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ 51 Hình 4.9. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l kinetin 59 Hình 4.10. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l BA 59 Hình 4.11. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình thái của mô vẩy củ. Trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l kinetin và 1mg/l2,4D + 0,2mg/l BA 59 Hình 4.12. Mẫu tái sinh trên môi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9% saccaroza 62 Hình 4.13. Mẫu tạo callus trên môi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9% saccaroza 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- viii Hình 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BA + saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng vẩy củ 62 Hình 4.15. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 3 ngày ðNC 69 Hình 4.16. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 5ngày ðNC 69 Hình 4.17. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 7 ngày ðNC 69 Hình 4.18. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 10ngày ðNC 69 Hình 4.19. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 15 ngày ðNC 69 Hình 4.20. ðối chứng 69 Hình 4.21. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen GFP 72 Hình 4.22. Mẫu mang gen GFP (1 ngày ðNC) 73 Hình 4.23. Mẫu mang gen GFP (3 ngày ðNC) 73 Hình 4.24. Mẫu mang gen GFP (5 ngày ðNC) 73 Hình 4.25. Mẫu mang gen GFP (7 ngày ðNC) 73 Hình 4.26. Mẫu mang gen GFP (10 ngày ðNC) 73 Hình 4.27. Mẫu ñối chứng (không mang gen GFP) 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp -------------------- 1 1. më ®Çu 1.1. ðẶT VẤN ðỀ Lily là loại hoa cắt rất quan trọng trên thế giới và ở Việt Nam. Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn ñược ñánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao. Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn. Vì thế, loại hoa này hiện ñang rất ñược quan tâm và trú trọng phát triển. ðể phát triển loại hoa này ở Việt Nam, nhiều cơ quan và nhà nghiên cứu ñã tập trung nghiên cứu nhân giống bằng cả phương pháp truyền thống (nhân giống bằng củ) và phương pháp nuôi cấy mô, tế bào. ðã có rất nhiều thành công trong việc nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào, như: Nhân giống lily bằng phương pháp tạo củ in vitro; nhân giống lily bằng phương pháp tạo cây in vitro,…(Viện Sinh học Nông nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp). Tuy nhiên, chúng ta mới chỉ thành công trong việc nghiên cứu nhân giống, còn việc nghiên cứu tạo giống vẫn còn là vấn ñề mới mẻ và chưa ñược tập trung nghiên cứu cụ thể. ðến nay, việc nghiên cứu tạo giống hoa lily thích ứng với ñiều kiện khí hậu Việt Nam vẫn chưa ñược ñề cập ñến. Trong tạo giống hoa nói chung và hoa lily nói riêng thì phương pháp chuyển gen ñược coi là phương pháp có hiệu quả. Việc chuyển gen cho cây hoa lily nhằm mục ñích tạo sự ña dạng về màu sắc hoa hay tăng khả năng thích nghi cho cây ở các ñiều kiện trồng trọt khác nhau là nội dung rất ñược quan tâm của nhiều nhà khoa học nông nghiệp trên thế giới và cả trong nước. . DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I ---------  --------- NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO CHO CÂY LILY SIBBERIA VÀ. hoá và tái phân hoá của tế bào 11 2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật. 13 2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium