Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ủó ủược ỏp dụng thành cụng trờn nhiều ủối tượng cõy trồng, ủặc biệt là cõy hai lỏ mần như: khoai tõy, cà chua, thuốclỏ, ủu ủủ,....việc chuyển gen vào cõy một lỏ mầm khú thành cụng hơn. Nhưng gần ủõy, người ta cũng ủó thành cụng trong việc chuyển gen cho cõy một lỏ mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium như: lỳa, ngụ. để thực hiện thành cụng việc chuyờn gen nhờ vi khuẩn người ta thường sử dụng kỹ thuật ủĩa lỏ. Cỏc bước của kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn gồm:
* Bước 1: Tạo cỏc ủĩa lỏ và ngõm trong dịch khuẩn.
đối tượng sử dụng ủể chuyển gen ủược cắt ra thành những mảnh nhỏ, sau ủú xử lý chỳng trong dung dịch cú chứa vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens mang plasmid chứa gen mong muốn ủó ủược thiết kế trong vài chục phỳt.
* Bước 2: Tiến hành ủồng nuụi cấy ủĩa lỏ và vi khuẩn.
đĩa lỏ sau khi ủược xử lý trong dung dịch khuẩn, chỳng ủược cấy lờn mụi trường ủồng nuụi cấy. Quỏ trỡnh ủồng nuụi cấy này ủược thực hiện trong ủiều kiện tối hoàn toàn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào ủối tượng chuyển gen. Trong mụi trường ủồng nuụi cấy cú bổ sung acetosyrigone ủể tăng cường khả năng hoạt hoỏ gen vựng Vir qua ủú thỳc ủẩy thờm quỏ trỡnh
chuyển gen. đõy là giai ủoạn quyết ủịnh hiệu quả của cụng tỏc chuyển gen.
* Bước 3: Làm sạch khuẩn trờn ủĩa lỏ và cấy lờn mụi trường tỏi sinh.
Quỏ trỡnh làm sạch ủĩa lỏ ủược thực hiện nhờ phương phỏp rửa sạch bằng dung dịch khỏng sinh Cefotaxime ủể diệt hết khuẩn. Sau khi rửa sạch cỏc ủĩa lỏ tiến hành thấm khụ chỳng bằng giấy thấm vụ trựng, sau ủú ủặt chỳng lờn mụi trường tỏi sinh tạo cõy hoàn chỉnh.
* Bước 4: Nuụi cấy tỏi sinh ủĩa lỏ.
Quỏ trỡnh này ủược thực hiện trong ủiều kiện nhiệt ủộ, ỏnh sỏng thớch hợp nhất cho sự phỏt sinh hỡnh thỏi của ủĩa lỏ.
* Bước 5: Chọn lọc cỏc cõy mang gen chuyển vào.
Quỏ trỡnh này ủược thực hiện qua sự phỏt hiện cỏc gen chỉ thị. Việc phỏt hiện cỏc gen chuyển vào cú thể ủược thực hiện thụng qua việc phõn tớch ADN và ủỏnh giỏ biểu hiện của gen thụng qua biotest.
* Bước 6: Nhõn dũng và ủỏnh giỏ sinh trưởng của cõy chuyển gen.
Quỏ trỡnh này trước tiờn ủược thực hiện trong ủiều kiện nuụi cấy nhõn tạo (in vitro), sau ủú ủỏnh giỏ sự sinh trưởng của chỳng ở ủiều kiện in vivo (vườn ươm), và cuối cựng là ủỏnh giỏ sự sinh trưởng phỏt triển của chỳng trong ủiều kiện tự nhiờn (ủồng ruộng).
2.4. TèNH HèNH PHÁT TRIỂN CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN