3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.3.2. Phương phỏp nuụi cấy và lõy nhiễm vi khuẩn.
* Phương phỏp nuụi cấy vi khuẩn:
Chuẩn bị dịch vi khuẩn trước khi lõy nhiễm với mẫu thớ nghiệm gồm cỏc bước:
- Vi khuẩn ủược nuụi cấy trờn mụi trường lỏng LB và lắc trong 17 - 19 giờ (200 vũng/phỳt), trong ủiều kiện nhiệt ủộ từ 26 – 28oC, ỏnh sỏng ủầy ủủ.
- Dịch vi khuẩn ủược ly tõm ủể lấy sinh khối tế bào vi khuẩn ở tốc ủộ 5000 vũng/phỳt trong 6 phỳt ở ủiều kiện nhiệt ủộ phũng và ủược pha trong mụi trường pha loóng vi khuẩn tới khi cú OD600 = 0,3.
* Phương phỏp lõy nhiễm vi khuẩn:
Mẫu cấy ủược nhỳng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian khoảng 5 phỳt, vớt ra, ủể khụ trờn giấy thấm vụ trựng sau ủú ủược cấy lờn mụi trường ủồng nuụi cấy.
ðiều kiện ủồng nuụi cấy: nhiệt ủộ 240C, che tối hoàn toàn, thời gian nuụi cấy phụ thuộc vào thớ nghiệm.
* Phương phỏp diệt vi khuẩn:
- Vi khuẩn ủược rửa nhanh từ 3-5 lần bằng nước cất vụ trựng cú bổ sung Cefotaxime (nồng ủộ tốt nhất). Sau ủú cấy mẫu lờn mụi trường nuụi cấy cú bổ sung Cefotaxime (nồng ủộ tốt nhất) ủể diệt khuẩn hoàn toàn.
- ðiều kiện nuụi cấy: nhiệt ủộ 240C, nuụi cấy trong 7-10 ngày, theo dừi và ủỏnh giỏ kết quả diệt khuẩn.
* Phương phỏp kiểm tra gen GFP
Sau khi lấy nhiễm mẫu, ủồng nuụi cấy mẫu với vi khuẩn trong khoảng thời gian nhất ủịnh, cỏc mẫu ủú ủem diệt khuẩn ủến sạch hoàn toàn. Khi ủó cú
mẫu sạch, cỏc mẫu này ủược soi dưới kớnh hiển vi huỳnh quang soi nổi Leica, mẫu nào cú biểu hiện ỏnh sỏng xanh thỡ ủú chớnh là mẫu ủó mang gen GFP (Green Fluoresce Protein).