Nghiên cứu khả năng tiếp nhận cấu trúc crispr cas9 chỉnh sửa gen gmac29 của giống đậu tương ddt thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN CẤU TRÚC CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA GEN GmNAC29 CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT22 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS” HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN CẤU TRÚC CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA GEN GmNAC29 CỦA GIỐNG ĐẬU TƢƠNG ĐT22 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS” Sinh viên thực : NGUYỄN MINH HIẾU Mã sinh viên : 637128 Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn : TS NGUYỄN THÀNH ĐỨC Ngƣời hƣớng dẫn : PGS.TS ĐỒNG HUY GIỚI HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu trƣớc Tơi xin cam đoan tài liệu, thơng tin trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Minh Hiếu i LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian học tập nghiên cứu khóa luận Viện Di truyền Nơng Nghiệp vừa qua đem lại cho em nhiều kinh nghiệm quý báu kiến thức chuyên môn, kĩ thực hành hành trang kiến thức bổ ích cho em sau Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thành Đức, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực Vật, Viện Di truyền Nông nghiệp ln tận tình bảo, hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình nghiên cứu Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy PGS.TS Đồng Huy Giới, môn Sinh học, khoa Cơng nghệ sinh học, ln tận tình bảo, giúp đỡ đƣa lời khuyên bổ ích giúp em hồn thành khóa luận cách tốt Ngồi ra, em vơ cảm ơn anh, chị Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Tế bào Thực Vật ln nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ em kiến thức nhƣ kinh nghiệm suốt thời gian nghiên cứu khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè luôn đồng hành, động viên giúp đỡ em suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Minh Hiếu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu đậu tƣơng giống đậu tƣơng ĐT22 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Giá trị đậu tƣơng 2.1.4 Đặc tính sinh học giống đậu tƣơng ĐT22 2.1.5 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới 2.1.6 Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam 2.2 Tác động phi sinh học khả thích ứng đậu tƣơng 2.2.1 Ảnh hƣởng bất lợi phi sinh học tới đậu tƣơng 2.2.2 Sự đáp ứng đậu tƣơng với bất lợi phi sinh học 10 2.3 Công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 11 2.3.1 Cơ chế đột phá kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 11 iii 2.3.2 Một số thành tựu CRISPR/Cas9 cải thiện di truyền trồng15 2.3.3 Tiềm thách thức công nghệ CRISPR/Cas9 16 2.3.4 Ứng dụng cần thiết chỉnh sửa gen GmNAC29 giống đậu tƣơng ĐT22 Việt Nam 18 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu nghiên cứu 20 3.2 Hóa chất, thiết bị, địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.2.1 Hóa chất 21 3.2.2 Dụng cụ, thiết bị 22 3.2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 3.3 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 23 3.3.1 TN1: Đánh giá khả nảy mầm hạt đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng GM 23 3.3.2 TN2: Đánh giả ảnh hƣởng thời gian đồng ni cấy đến tỷ lệ sống sót mẫu biến nạp 24 3.3.3 TN3: Đánh giá ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi giống đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng SIM 27 3.3.4 TN4: Đánh giá ảnh hƣởng nƣớc dừa đến khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng ĐT22 SEM 29 3.3.5 TN5: Đánh giá khả rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tƣơng môi trƣờng RM 30 3.3.6 TN6: Hoàn thiện quy trình chuyển nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tƣơng ĐT22 31 3.3.7 TN7: Tách chiết DNA tổng số từ đậu tƣơng T0 chỉnh sửa gen mẫu đối chứng 31 3.3.8 TN8: Phân tích đậu tƣơng chỉnh sửa gen GmNAC29 hệ T0 kỹ thuật PCR 33 iv 3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết khả nảy mầm hạt đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng GM36 4.2 Ảnh hƣởng thời gian đồng ni cấy đến tỷ lệ sống sót mẫu biến nạp38 4.3 Ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi giống đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng SIM 41 4.4 Ảnh hƣởng nƣớc dừa đến khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng SEM 44 4.5 Kết khả rễ tạo hồn chỉnh giống đậu tƣơng mơi trƣờng RM 46 4.6 Kết quy trình chuyển nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tƣơng ĐT22 48 4.7 Kết tách chiết DNA tổng số từ đậu tƣơng T0 chỉnh sửa gen mẫu đối chứng 50 4.8 Kết phân tích đậu tƣơng chỉnh sửa gen GmNAC29 hệ T0 kỹ thuật PCR 52 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 57 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 65 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADN : Deoxyribonucleic acid ARN : Acid ribonucleic BAP : 6-Benzylaminopurine CCM : Co-cultivation medium (Môi trƣờng đồng nuôi cấy) CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cs : Cộng DSB : Double strand break FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations GA3 : Gibberellic Acid GM : Germination medium (Môi trƣờng nảy mầm) gRNA : A guide RNA GSO : General Statistics Office (Tổng cục thống kê) HDR : Homology-directed repair HR : Homologous recombination IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid LEA : Late embryogenesis abundant MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : α-Naphthalene acetic acid NAC : N-Acetyl Cysteine NHEJ : Non-homologous end joining PAM : Protospacer-Adjacent Motif PGRs : Plant growth regulators RM : Rooting medium (Môi trƣờng rễ) RNAi : RNA interference vi ROS : Reactive Oxygen Species SEM : Shoot elongation medium (Môi trƣờng kéo dài chồi) SIM : Shoot Induction medium (Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi) TALEN : Transcription Activator Like Effector Nuclease TU : Thiourea YEB : Yeast Extract Broth (Dịch chiết nấm men nuôi khuẩn Agrobaceria) ZFNs : Zinc Finger Nucleases vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sản lƣợng đậu tƣơng theo năm giới (triệu tấn) Bảng 2.2: Tình hình sản xuất đậu tƣơng Việt Nam năm gần Bảng 3.1: Các cặp mồi đƣợc sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng PCR sử dụng kit EZ PCR Mix-Tracking Dye 34 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 34 Bảng 4.1: Kết nảy mầm hạt giống ĐT22 môi trƣờng GM 36 Bảng 4.2: Kết đánh giá ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy 39 Bảng 4.3: Kết đánh giá ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi giống đậu tƣơng ĐT22 42 Bảng 4.4: Kết đánh giá ảnh hƣởng nƣớc dừa đến khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng ĐT22 44 Bảng 4.5: Kết rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tƣơng môi trƣờng RM 46 Bảng 4.6: Thí nghiệm mơ hình biến nạp cấu trúc vector chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tƣơng ĐT22 49 Bảng 4.7: Kết kiểm tra nồng độ DNA tổng số đậu tƣơng chỉnh sửa gen GmNAC29 máy đo quang phổ 52 Bảng 4.8: Tổng hợp kết phân tích dòng đậu tƣơng T0 chỉnh sửa gen GmNAC29 54 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm Xuân Hội (2012) Thiết kế vector chuyển gene điều khiển OsDREB1A có tiềm tăng cƣờng khả chịu điều kiện bất lợi lúa Tạp chí Công nghệ sinh học 10: 271-279 Lê Thị Ngọc Quỳnh, Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2018) Tình hình ứng dụng CRISPR/Cas cải thiện di truyền nông nghiệp Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ, 6-12 Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dƣơng Tuấn Bảo, Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng (2013) Ứng dụng công nghệ sinh học phát triển giống đậu tƣơng Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, 2: 1153-1156 Nguyễn Hoàng Quang Phạm Xuân Hội (2011) Tạo dạng hoạt hóa DREB2A kỹ thuật gây đột biến trực tiếp PCR hai bƣớc thiết kế vector chuyển gene Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Trung Anh (2017) Nghiên cứu chuyển gen GmNAC004 vào giống đậu tƣơng ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, (3): 13-17 Nguyễn Hữu Kiên, Nguyễn Văn Đồng (2016) Yếu tố phiên mã NAC thực vật: vai trò tiềm ứng dụng Hội thảo Quốc gia Khoa học trồng lần thứ hai, 2: 302-306 Nguyễn Hữu Kiên, Vũ Văn Tiến, Nguyễn Trung Anh, Lê Thị Mai Hƣơng, Đinh Thị Mai Thu, Nguyễn Thị Hòa, Tống Thị Hƣờng, Đinh Thị Thu Ngần, Phạm Xuân Hội, Jae-Yean Kim, Nguyễn Văn Đồng (2020) Thiết kế vector CRISPR/Cas9 cấu trúc hệ thống để điều chỉnh gen GmNAC29 liên quan đến tƣơng tác chống chịu hạn chế Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nơng thôn 23: 3-9 Nguyễn Hữu Kiên, Vũ Văn Tiến, Nguyễn Trung Anh, Lê Thị Mai Hƣơng, Đoàn Thị Hải Dƣơng, Đinh Thị Mai Thu, Nguyễn Thị Hòa, Tống Thị Hƣờng, Đinh Thị Thu Ngần, Phạm Xuân Hội, Jae-Yean Kim, Nguyễn Văn Đồng (2020) Thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmHyPRP1, gen đậu tƣơng liên quan tới trình chống chịu đa stress phi sinh học Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển Nông thôn 24: 10-17 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Trung Anh (2018) Nghiên cứu chuyển cấu trúc gen 35S::GmNAC004 vào giống 57 đậu tƣơng ĐT22 thông qua chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, 11: 32-37 10 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Hữu Kiên, Trần Thu Cúc (2012b) Kết bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1b đậu tƣơng Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 9(39):125-131 11 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Mai Hƣơng, Nguyễn Hữu Kiên (2012a) Nghiên cứu quy trình biến nạp gen vào giống đậu tƣơng ĐT22 thơng qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Khoa học công nghệ nông nghiệp Việt Nam, 9(39):119-124 12 Nguyễn Văn Thiều (2002) Cây đậu tƣơng - Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm Nhà xuất Nông nghiệp - Hà Nội 13 Tổ Chức Lƣơng Thực Và Nông Nghiệp Liên Hợp Quốc - FAOSTAT (2019) Thống kê số liệu đậu tƣơng Truy cập từ https://www.fao.org/faostat/en/#compare ngày 11/07/2022 14 Tổ Chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hợp Quốc - FAOSTAT (2022) Thống kê số liệu đậu tƣơng Truy cập từ https://www.fao.org/faostat/en/#compare ngày 11/07/2022 15 Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2019) Sản lƣợng số hàng năm Truy cập từ https://www.gso.gov.vn/so-lieu-thong-ke/ ngày 11/07/2022 16 Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2022) Sản lƣợng số hàng năm Truy cập từ https://www.gso.gov.vn/pxweb2/?pxid=V0607&theme=N%C3%B4ng%2C%20l%C3%A2m%20nghi %E1%BB%87p%20v%C3%A0%20th%E1%BB%A7y%20s%E1%BA%A 3n 17 Trần Văn Điền (2007) Giáo trình Cây đậu tƣơng Nhà xuất Nông nghiệp - Hà Nội 18 Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam – VAAS (2021) Giống đậu tƣơng ĐT22 Truy cập từ https://vaas.vn/vi/giong/giong-dau-tuong-dt22 ngày 11/07/2022 ngày 11/07/2022 Tài liệu nƣớc Choi K., Khan R., Lee S W (2021) Dissection of plant microbiota and plant-microbiome interactions Journal of Microbiology 59(3) 281–291 DOI: 10.1007/s12275-021-0619-5 DOI: 10.1007/s12275-021-0619-5 58 Dempewolf H., Eastwood R J., Guarino L., Khoury C K., Müller J V., Toll J (2014) Adapting agriculture to climate change: a global initiative to collect, conserve, and use crop wild relatives Agroecology and Sustainable Food Systems 38:4, 369–377 DOI: 10.1080/21683565.2013.870629 Doudna J A., Charpentier E (2014) Genome editing The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 Science 346(6213):1258096 DOI: 10.1126/science.1258096 Fehlenberg V., Baumann M., Gasparri, N I., Piquer-Rodriguez M., GavierPizarro G., and Kuemmerle (2017) The role of soybean production as an underlying driver of deforestation in the South American Chaco Global Environmental Change 45:24-35 DOI:10.1016/j.gloenvcha.2017.05.001 Hakeem K.R., Chandna R., Ahmad P., et al (2012) Relevance of Proteomic Investigations in Plant Abiotic Stress Physiology Omics 16(11):621-35 DOI: 10.1089/omi.2012.0041 Hasanuzzaman M., Bhuyan MHMB., Parvin K., Bhuiyan TF., Anee TI., Nahar K., Hossen MS., Zulfiqar F., Alam MM., Fujita M (2020) Regulation of ROS Metabolism in Plants under Environmental Stress: A Review of Recent Experimental Evidence International Journal of Molecular Sciences 21(22):8695 DOI: 10.3390/ijms21228695 Herridge D F., Peoples M B., Boddey R M (2008) Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems Plant and Soil, 311(1): 1-18 DOI: 10.1007/s11104-008-9668-3 Jia H., Wang N (2014) Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA PLoS One 9(4):e93806 DOI: 10.1371/journal.pone.0093806 Li P., Cao W., Fang H., Xu S., Yin S., Zhang Y., Lin D., Wang J., Chen Y., Xu C., Yang Z (2017) Transcriptomic Profiling of the Maize (Zea mays L.) Leaf Response to Abiotic Stresses at the Seedling Stage Frontiers in plant science 8, 290-290 DOI: 10.3389/fpls.2017.00290 10 Thao N P., Thu N B., Hoang X L., Van Ha C., Tran L S (2013) Differential expression analysis of a subset of drought-responsive GmNAC genes in two soybean cultivars differing in drought tolerance Int J Mol Sci, 14(12): 23828-23841 DOI:10.3390/ijms141223828 11 Manavalan L P., Guttikonda S K., Tran L S., Nguyen H T (2009) Physiological and molecular approaches to improve drought resistance in soybean Plant Cell Physiol 50(7):1260-76 DOI: 10.1093/pcp/pcp082 12 Platt R J., Chen S., Zhou Y., Yim M J., Swiech L., Kempton H R., Dahlman J E, Parnas O., Eisenhaure T M., Jovanovic M., Graham D B., 59 Jhunjhunwala S., Heidenreich M., Xavier R J., Langer R., Anderson D G., Hacohen N., Regev A., Feng G., Sharp P A., Zhang F (2014) CRISPRCas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling Cell 159(2):440-55 DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.014 13 Ran FA., Hsu PD., Wright J., Agarwala V., Scott DA., Zhang F (2013) Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system Nature protocols 8(11):2281-2308 DOI: 10.1007/s11104-008-9668-3 14 Valliyodan B., Dan Q., Patil G., Zeng P., Huang J., Dai L., Chen C., Li Y., Joshi T., Song L., Vuong T D., Musket T A., Xu D., Shannon J G., Shifeng C., Liu X., Nguyen H T (2016) Landscape of genomic diversity and trait discovery in soybean Scientific Reports 6:23598 DOI: 10.1038/srep23598 15 Verma S., Nizam S., Verma P.K (2013) Biotic and Abiotic Stress Signaling in Plants In: Sarwat M., Ahmad A., Abdin MZ (Eds) Stress Signaling in Plants: Genomics and Proteomics Perspective Springer Science, New York, USA (1):25-49 16 Wang Y., Cheng X., Shan Q., Zhang Y., Liu J., Gao C., Qiu J L (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew Nature Biotechnology 32(9): 947-951 DOI: 10.1038/nbt.2969 17 Waqas M A., Kaya C., Riaz A., Farooq M., Nawaz I., Wilkes A., Li Y (2019) Potential Mechanisms of Abiotic Stress Tolerance in Crop Plants Induced by Thiourea Frontiers in Plant Science 10:1336 DOI: 10.3389/fpls.2019.01336 18 Xie K, Yang Y (2013) RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR–Cas system Molecular Plant 6(6): 1975-1983 DOI: 10.1093/mp/sst119 19 Xue W., Chen S., Yin H., Tammela T., Papagiannakopoulos T., Joshi N S., Cai W., Yang G., Bronson R., Crowley D G., Zhang F., Anderson D G., Sharp P A., Jacks T (2014) CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver Nature 514(7522):380-4 DOI: 10.1038/nature13589 60 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN MƠI TRƢỜNG NI CẤY Thành phần mơi trƣờng ni cấy STT Thành phần/1lít Bacto-peptone 10 g Yeast-extract 5g NaCl 5g GM B5 major salts 100 (10X) ml B5 minor salts (100X) Ferrous-NaEDTA (100X) YEP CCM 10 ml SIM SEM RM 100 ml 10 ml ml 10 ml 10 ml ml 10 ml 10 ml MS major salts 10 ml 100ml 100ml (10X) MS minor salts (100X) MES 10 Sucrose 20 g 11 pH 5,8 12 Agar 10 g 10 ml 10 ml 3,9 g 0,6 g 0,6 g 0,6 g 30 g 30 g 30 g 20 g 5,4 5,7 5,7 5,6 10 g 10 g 10 g 10 g 10 g Khử trùng 120oC, 20 phút, sau bổ sung: 13 Kanamycin 50 mg 14 Rifampicin 25 mg 15 Acetosyringone ml (AS), 40 mg/ml 16 Asp/Glu, 25 mg/ml 17 B5 vitamin (500X) ml ml 61 ml ml ml ml ml STT Thành phần/1lít GM 18 BAP, 1,67 mg/ml YEP CCM ml mg/ml Dithiothrietol 20 IAA, mg/ml 22 GA3, mg/ml 0,25 L-cystein, 25 Na-thiosulfate, 158 0,5 ml 10 ml ml ml mg/ml Vancomycin, 26 ml 16 ml mg/ml 25 0,5 ml 0,5 ml ml mg/ml 24 ml 0,1 ml Glufosinate, 10 23 RM ml (DTT), 154 mg/ml 21 SEM 0,1 ml 0,1ml Cefotaxime, 200 19 SIM mg/ml Môi trƣờng MS m major salts, 10X stock STT Thành phần Nồng độ (g/L) NH4NO3, Ammonium nitrate (F) 16,5 KNO3, Potassium Nitrate (S) 19 CaCl2.H2O, Calcium Chloride (F) 4,4 MgSO4.7H2O, Magnesium sulfate (F) 3,7 KH2PO4.H2O, Potassium phosphate (F) 1,7 62 ml Môi trƣờng MS minor salts, 100X stock STT Thành phần Nồng độ (g/L) H3BO3, Boric acid (F) 0,62 MnSO4.H2O, Manganous sulfate (S) 1,69 ZnSO4.7H2O, Zinc Sulfate (F) 0,86 KI, Potassium Iodide (S) 0,083 Na2MoO4.2H2O, Sodium Molybdate (F) 0,025 CuSO4.5H2O, Cupric sulfate (S) 0,0025 CoCl2.6H2O, Cobalt Chloride (S) 0,0025 Môi trƣờng B5 major salts, 10X stock STT Thành phần Nồng độ (g/L) KNO3, Potassium Nitrate (S) 25 CaCl2.H2O, Calcium Chloride (F) 1,5 MgSO4.7H2O, Magnesium sulfate (F) 2,5 (NH4)2SO4, Ammonium sulfate (F) 1,34 NaH2PO4.H2O, Sodium phosphate (F) 1,5 Môi trƣờng B5 minor salts, 100X stock STT Thành phần Nồng độ (g/L) H3BO3, Boric acid (F) 0,3 MnSO4.H2O, Manganous sulfate (S) ZnSO4.7H2O, Zinc Sulfate (F) 0,2 KI, Potassium Iodide (S) 0,075 Na2MoO4.2H2O, Sodium Molybdate (F) 0,025 CuSO4.5H2O, Cupric sulfate (S) 0,0025 CoCl2.6H2O, Cobalt Chloride (S) 0,0025 63 Stock B5 Vitamin, 500X STT Thành phần Nồng độ (g/L) Myo-inositol (S) 50 Nicotinic acid (Niacinamide) (S) 0,5 Pyridoxine-HCl 0,5 Thiamine-HCl (S) Ion-EDTA, 100X stock STT Thành phần Nồng độ (g/L) FeSO4.7H2O, Ferrous sulfate (F) 2,8 NaEDTA, Ethylenediamine (F) 3,75 64 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Kết Nghiên cứu khả nảy mầm hạt đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng GM BALANCED ANOVA FOR VARIATE SACH FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD VARIATE V003 SACH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5645.73 1411.43 ****** 0.000 * RESIDUAL 10 14.0001 1.40001 * TOTAL (CORRECTED) 14 5659.73 404.267 BALANCED ANOVA FOR VARIATE BENH FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD VARIATE V004 BENH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5645.73 1411.43 ****** 0.000 * RESIDUAL 10 13.9995 1.39995 * TOTAL (CORRECTED) 14 5659.73 404.267 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NMAM FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD VARIATE V005 NMAM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 3079.73 769.933 549.94 0.000 * RESIDUAL 10 14.0002 1.40002 * TOTAL (CORRECTED) 14 3093.73 220.981 BALANCED ANOVA FOR VARIATE MXANH FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD VARIATE V006 MXANH LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 65 CT$ 3209.07 802.267 523.22 0.000 * RESIDUAL 10 15.3332 1.53332 * TOTAL (CORRECTED) 14 3224.40 230.314 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS SACH BENH NMAM MXANH 0.000000 50.0000 5.00000 0.000000 24.0000 26.0000 13.6667 7.33333 3 48.3333 1.66667 42.6667 40.0000 48.3333 1.66667 36.3333 29.6667 48.6667 1.33333 33.0000 24.0000 SE(N= 3) 0.683133 0.683118 0.683136 0.714917 5%LSD 10DF 2.15258 2.15253 2.15259 2.25273 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HIEUTN1 7/ 8/22 23: :PAGE Thi nhiem bo tri CRD F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SACH BENH NMAM MXANH GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 33.867 15 16.133 15 26.133 15 20.200 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.106 1.1832 3.5 0.0000 20.106 1.1832 7.3 0.0000 14.865 1.1832 4.5 0.0000 15.176 1.2383 6.1 0.0000 | | | | Kết Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian đồng ni cấy đến tỷ lệ sống sót mẫu biến nạp BALANCED ANOVA FOR VARIATE DACHOI FILE HIEUTN2 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V003 DACHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 4479.78 895.956 435.87 0.000 * RESIDUAL 12 24.6668 2.05557 * TOTAL (CORRECTED) 17 4504.44 264.967 - 66 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CUMCHOI FILE HIEUTN2 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V004 CUMCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 3200.94 640.189 311.45 0.000 * RESIDUAL 12 24.6664 2.05554 * TOTAL (CORRECTED) 17 3225.61 189.742 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SSSCL FILE HIEUTN2 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V005 SSSCL song sot sau chon loc LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1775.78 355.156 206.22 0.000 * RESIDUAL 12 20.6666 1.72222 * TOTAL (CORRECTED) 17 1796.44 105.673 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HIEUTN2 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 3 DACHOI 5.00000 11.3333 26.6667 40.0000 48.3333 39.3333 CUMCHOI 0.000000 2.33333 14.6667 24.3333 38.3333 24.0000 SSSCL 0.000000 0.000000 7.00000 14.0000 29.0000 12.6667 SE(N= 3) 0.827761 0.827755 0.757675 5%LSD 12DF 2.55061 2.55060 2.33466 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HIEUTN2 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE GRAND MEAN (N= 18) NO STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | 67 | | | DACHOI CUMCHOI SSSCL OBS 18 28.444 18 17.278 18 10.444 TOTAL SS 16.278 13.775 10.280 RESID SS 1.4337 1.4337 1.3123 | 5.0 0.0000 8.3 0.0000 12.6 0.0000 | Kết Nghiên cứu ảnh hƣởng BAP đến khả tạo đa chồi giống đậu tƣơng ĐT22 môi trƣờng SIM BALANCED ANOVA FOR VARIATE DACHOI FILE HIEUTN3 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V003 DACHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5934.00 1483.50 741.76 0.000 * RESIDUAL 10 19.9997 1.99997 * TOTAL (CORRECTED) 14 5954.00 425.286 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CUMCHOI FILE HIEUTN3 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V004 CUMCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 3812.40 953.100 549.87 0.000 * RESIDUAL 10 17.3333 1.73333 * TOTAL (CORRECTED) 14 3829.73 273.552 BALANCED ANOVA FOR VARIATE SSSCL FILE HIEUTN3 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V005 SSSCL song sot sau chon loc LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2864.27 716.067 282.66 0.000 * RESIDUAL 10 25.3331 2.53331 * TOTAL (CORRECTED) 14 2889.60 206.400 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HIEUTN3 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD MEANS FOR EFFECT CT$ 68 CT$ NOS 3 3 DACHOI CUMCHOI 0.000000 0.000000 25.3333 5.00000 40.3333 21.0000 57.0000 44.3333 47.3333 27.3333 SSSCL 0.000000 4.66667 19.0000 38.0000 25.3333 SE(N= 3) 0.816491 0.760115 0.918933 5%LSD 10DF 2.57279 2.39515 2.89559 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HIEUTN3 7/ 8/22 23: :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE DACHOI CUMCHOI SSSCL GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 34.000 15 19.533 15 17.400 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 20.622 1.4142 4.2 0.0000 16.539 1.3166 6.7 0.0000 14.367 1.5916 9.1 0.0000 | | | | Kết Nghiên cứu ảnh hƣởng nƣớc dừa đến khả kéo dài chồi giống đậu tƣơng ĐT22 SEM BALANCED ANOVA FOR VARIATE TCDCBD FILE HIEU4S 7/ 8/22 23:12 :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V003 TCDCBD tong chieu dai choi ban dau LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 351667E-02 703333E-03 0.20 0.47 * RESIDUAL 12 431333E-01 359445E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 466500E-01 274412E-02 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDCSTN FILE HIEU4S 5/ 9/22 20:48 :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V004 CDCSTN chieu dai choi sau thi nghiem LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 724311 144862 79.99 0.000 69 * RESIDUAL 12 217333E-01 181111E-02 * TOTAL (CORRECTED) 17 746044 438850E-01 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTL FILE HIEU4S 5/ 9/22 20:48 :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD VARIATE V005 TLTL ty le tang len LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 317000 634000E-01 63.40 0.000 * RESIDUAL 12 120000E-01 999997E-03 * TOTAL (CORRECTED) 17 329000 193529E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HIEU4S 5/ 9/22 20:48 :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 3 TCDCBD 1.44667 1.46000 1.44667 1.44333 1.47667 1.47667 CDCSTN 1.55000 1.67000 1.90000 1.99333 2.12000 2.01333 TLTL 1.07333 1.14333 1.31333 1.38667 1.43667 1.36667 SE(N= 3) 0.346143E-01 0.245704E-01 0.182574E-01 5%LSD 12DF 0.106658 0.757097E-01 0.562572E-01 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HIEU4S 5/ 9/22 20:48 :PAGE thi nghiem bo tri kieu CRD F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TCDCBD CDCSTN TLTL GRAND MEAN (N= 18) NO OBS 18 1.4583 18 1.8744 18 1.2867 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.52384E-010.59954E-01 4.1 0.9567 0.20949 0.42557E-01 2.3 0.0000 0.13911 0.31623E-01 2.5 0.0000 70 | | | | 5 Kết Nghiên cứu khả rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tƣơng môi trƣờng RM Số lƣợng rễ Chiều dài rễ Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) STT STT 14 21 14 21 Cây 10 Cây 1.9 3.9 Cây 9 Cây 2.1 4.1 Cây Cây 2.1 3.9 Cây 10 10 Cây 3.8 3.9 Cây 9 10 Cây 2.1 3.6 3.7 Cây 9 Cây 1.9 3.9 Cây 7 8 Cây 1.9 3.7 3.8 Cây 8 Cây 3.8 3.9 Cây 9 Cây 2.1 3.6 3.7 Cây 10 Cây 10 4.1 4.2 Cây 11 10 12 13 Cây 11 2.3 4.4 4.5 Cây 12 12 12 13 Cây 12 2.3 4.3 4.4 Cây 13 10 11 Cây 13 2.9 4.5 4.6 Cây 14 10 10 11 Cây 14 2.5 4.3 4.4 Cây 15 10 Cây 15 2.4 4.1 4.2 Cây 16 10 11 Cây 16 2.2 4.3 4.3 Cây 17 9 Cây 17 2.3 4.2 4.3 Cây 18 10 11 Cây 18 2.1 4.1 4.2 Cây 19 10 Cây 19 2.4 4.3 4.4 Cây 20 10 Cây 20 2.3 4.2 4.2 8.45 9.35 10.05 TB 2.19 4.05 4.14 TB 71