Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn AGROBACTERIUM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ THANH DIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ KHẢNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM KHÓA LUÂN TÓT NGHIÊP ĐAI HOC • • • • Chuyên ngành: Di truyền học Người hướng dẫn khoa học TS. PHẠM THỊ LÝ THU HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, có hỗ trợ từ giáo viên hướng dẫn TS. Phạm Thị Lý Thu. Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu trước đây. Những số liệu bảng phục vụ cho việc phân tích , nhận xét, đánh giá tác giả nghiên cứu có ghi nhật kí thí nghiệm bảng theo dõi thí nghiệm hàng ngày trình thực tập. Ngoài ra, đề tài sử dụng số nghiên cứu, nhận xét, đánh số liệu tác giả, quan, tổ chức khác thể phần tài liệu tham khảo. Nếu phát có gian lận xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, kết luận văn mình. Hà Nội, ngày . tháng .năm 2015 Tác giả Trần Thị Thanh Diệp LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập Viện Di truyền Nông nghiệp, học hỏi nhiều kiến thức chuyên môn, kĩ thực hành làm việc. Để có kiến thức kết ngày hôm nay, trước tiên xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến Ban lã nh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt TS. Phạm Thị Lý Thu người tận tình bảo, hướng dẫn cho kiến thức chuyên môn, kĩ thực tế, mở mang nâng cao kiến thức để hoàn thành khóa luận cách tốt nhất. Cùng với giúp đỡ tận tình cán khoa học Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật tạo điều kiện thuận lợi cho có môi trường học tập làm việc tốt. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô khoa Sinh- KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực tập. Cuối xin gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè, người động viên giúp đỡ trình thực tập vừa qua. Trong trình thực tập viết khóa luận, thời gian thực đề tài hạn chế nên không tránh khỏi sai sót. Vì vậy, mong nhận đóng góp thày cô giáo, bạn bè để giúp hoàn thành tốt khóa luận này. Hà Nội, ngày . tháng .năm 2015 Tác giả Tràn Thị Thanh Diệp Hình 1.1. Phản ứng tổng hợp EPSP từ S3P PEP xúc tác enzyme Bảng 1.1. Các gen sử dụng tạo ngô chuyển gen mang đặc tính chống 2,4-D :Dichlophenoxy acetic acid DNA :Deoxiribonucleic acid AS :Acetosyringone DANH MỤC CIMMYT : The International Maize and Wheat Improvement Center - Trung tâm cải tiến ngô lúa mỳ quốc tế cs : Cộng CTAB : Cetyl trimetylammonium bromua EPSP : 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate EPSPS : Enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase Hpt : Hygromycin phosphotransferase L-PPT :L-phosphinothricin Pat/bar : Gen mã hoá cho enzym phosphinothricin acetyl transferase (PAT). PCR : Polymerase Chain Reaction- phản ứng PCR PEP : Phosphoenolpyruvate S3P : 3-phosphate-shikimate T-DNA : Tumor indosing plasmid= Plasmid gây khối u thực vật TCN : Trước công nguyên Vir : Virulence Region= Vùng gây độc DANH MỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài Ngô ba lương thực quan trọng giới (cùng với lúa mì gạo) lương thực có vai trò kinh tế quan trọng bậc nhất. Tính đến năm 2012 diện tích trồng ngô giới vào khoảng 159 triệu (FAO, 2013). Theo dự đoán vào năm 2020, nhu cầu ngô tăng lên 50% với 852 triệu năm vượt qua gạo lúa mì (Pingali Padney, 2010). Hiện ngành sản xuất ngô giới nói chung nước ta nói riêng phải đối mặt với nhiều vấn đề như: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại vấn đề lớn nông nghiệp làm giảm suất trồng từ 10 - 15%. Do đó, hàng loạt biện pháp phòng trừ cỏ dại áp dụng như: sử dụng thuốc diệt cỏ chọn lọc không chọn lọc. Đặc biệt vùng có tượng xói mòn đất, thuốc diệt cỏ sử dụng giải pháp để loại trừ cỏ dại. Tuy nhiên, việc lạm dụng số thuốc diệt cỏ có độc tính cao gây hậu nghiêm trọng môi trường, hệ sinh thái sức khỏe người. Điều đặt nhiệm vụ to lớn cho nhà chọn giống, nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo giống ngô cho suất cao, mang đặc tính kháng thuốc diệt cỏ. Các giống trồng biến đổi gen mang đặc tính khác nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng, tăng thu nhập cho người lao động. Hàng năm, số lượng nông dân quốc gia trồng trồng biến đổi gen liên tục gia tăng. Cây ngô chuyển gen thương mại hóa vào năm 1996, đến năm 2012 diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 55,1 triệu 11 nước, có nước trồng triệu bao gồm: Hoa Kỳ (34,1 triệu ha), Brazil (12,1 triệu ha), Argentina (3,3 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) Canada (1,6 triệu ha). Nước có sản lượng tăng cao vào năm 2012 Brazil (3 triệu ha). Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ giống trồng ưu thế, chiếm 7,8 triệu tương đương với 5% diện tích trồng chuyển gen toàn cầu trồng nước. Ở Việt Nam, thời gian gần đây, nghiên cứu biến nạp gen vào loài trồng quan tâm, ý nhiều hơn, với đối tượng ngô, nói loài trồng tương đối khó tính trình nuôi cấy invitro chuyển nạp gen, hiệu biến nạp gen thấp. Mặt khác, việc tạo trồng chuyển gen có khả áp dụng vào sản xuất từ nghiên cứu nước đòi hỏi cấp thiết lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học ngành nông nghiệp Việt Nam. Mặt khác, kháng thuốc diệt cỏ nhân tạo đặc điểm thường sử dụng nhiều thực vật biến đổi gen, ngô chuyển gen mang đặc tính kháng thuốc diệt cỏ quan tâm nghiên cứu. Việc chuyển gen vào ngô nâng cao tính chọn lọc hiệu kinh tế thuốc diệt cỏ làm giảm ảnh hưởng thuốc quần thể sinh vật đất. Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn dựa sở lý luận khoa học nêu trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 2. Mục đích nghiên cứu - Biến nạp gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS vào số dòng ngô chọn lọc. - Phân tích sinh học phân tử PCR có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ CP4 EPSPS dòng ngô chuyển gen tái sinh. - Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dòng ngô chuyển gen CP4 EPSPS điều kiện nhà lưới. 3. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học khả tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu đề tài tạo sở cho nghiên cứu tạo dòng/ giống ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ áp dụng vào thực tiễn sản xuất. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Nguồn gốcphân loại vai trò ngố 1.1.1. Nguồn gốc phân loại ngô Phân loại khoa học: Ngô thuộc: Loài: Zea mays .L Chi : Maydeae Họ: Poaceae (hòa thảo) Bộ: Poaỉes (Hòa thảo) Lớp: Monocotyledons (Một mầm) Ngành: Angiospermatophyta (Hạt kín) Ngô, tiếng Anh “maize” xuất phát từ tiếng Tây Ban Nha (maíz) thuật ngữ tiếng Taino để loài này, từ thông dụng Vương quốc Anh để ngô. Tại Hoa Kỳ, Canada Australia, thuật ngữ hay sử dụng corn, từ trước dùng để gọi cho loại lương thực. Hiện nay, thuật ngữ dùng để ngô, dạng rút gọn "Indian com" “cây lương thực người Anh điêng”. Lịch sử nghiên cứu thuộc lĩnh vực khảo cổ, di truyền học, thực vật học, dân tộc học địa lý học .quan tâm đưa nhiều giả thuyết. Có giả thuyết cho nguồn gốc ngô khoảng năm 5.500 tới 10.000 trước công nguyên (TCN). Những nghiên cứu di truyền học gần cho trình hóa ngô diễn vào khoảng năm 7000 TCN miền trung Mexico tổ tiên loại cỏ teosinte hoang dại gần giống với ngô ngày mọc lưu vực sông Balsas. Liên quan đến khảo cổ học, người ta phát bắp ngô có sớm hang Güila Naquitz thung lũng Oaxaca, có niên đại vào khoảng năm 4.250 TCN, bắp ngô cổ hang động gần Tehuacan, Puebla, có niên đại vào khoảng 2750 TCN. Một số giả thuyết cho rằng, có lẽ sớm khoảng năm 1500 TCN, ngô bắt đầu phổ biến rộng nhanh. Ngô lương thực phần lớn văn hóa tiền Columbus Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Nam Mỹ khu vực Caribe (Ganinat, 1997). 1.1.2. Vai frò ngô Cây ngô lương thực quan trọng đứng thứ ba giới (sau lúa mỳ lúa gạo) đứng thứ hai Việt Nam (sau lúa). Ngô trồng rộng rãi toàn giới, với tổng sản lượng hàng năm lớn loại ngũ cốc khác. Hoa Kỳ sản xuất khoảng 40% tổng sản lượng ngô giới, sau Hoa Kỳ nước Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn Độ, Pháp Argentina. Chỉ tính riêng năm 2009, tổng diện tích trồng ngô toàn cầu 159 triệu ha, đạt sản lượng 817 triệu tấn, nhiều gạo (678 triệu tấn) lúa mì (682 triệu tấn) (FAO, 2009). Ngô loại lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân toàn giới. Ngô có số vai trò chính: - Là nguồn có giá trị dinh dưỡng: Ngô có chứa chất protein (10,6%), lipid (4-5%), glucid (69%), hàm lượng vitamin ngô cao, tập chung chủ yếu lớp hạt ngô mầm. - Làm lương thực, thực phẩm cho người: Cây ngô ba trồng quan trọng sử dụng làm thức ăn cho người gia súc. Toàn giới sử dụng 17% sản lượng ngô làm lương thực cho người nước phát triển 30%, nước phát triển khoảng 40%. Các nước Trung Mỹ, Nam Á Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Khẩu phàn ăn nước châu Mỹ La Tinh bánh ngô, đậu đỗ ớt giống nước châu Á sử dụng cơm (gạo), cá, rau xanh nước châu Âu sử dụng bánh mỳ, khoai tây, sữa. - Ngô làm thức ăn chăn nuôi: Theo số liệu thống kê CIMMYT, giai đoạn 1997 - 1999, giới dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi 66% - khoảng 400 triệu tấn/năm. Các nước phát triển có tỷ lệ dùng ngô làm thức ăn nuôi cao, thường 70%. Hiện nay, Việt Nam dùng ngô làm thức ăn chăn nuôi (khoảng 90%) song tỷ lệ ngô tổng số chất tinh khoảng 50%, ta dùng thêm gạo gẫy, cám, bột sắn Từ ngô hạt xay vỡ nuôi gia cầm (gà, vịt, ngan, ngồng .), nghiền thành bột chế biến làm thức ăn cho trâu bò, lợn gia cầm, chế biến thức ăn cho cá. Thân ngô cho trâu bò ăn tươi, sau thu hoạch (nhất ngô thu bắp non) băm nhỏ ủ chua làm thức ăn cho gia súc. [...]... công nghệ chuyển gen vào cây ngô đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu chất nguyên sinh của phôi và nghiên cứu về các vấn đề sinh học cơ bản thông qua nghiên cứu về cây ngô chuyển gen Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là lựa chọn tốt hơn về sự phân phối của gen vào cây ngô so với vi c sử dụng phương pháp súng bắn gen Hệ... 1.2.Các phương pháp chuyển gen ở thực vật Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng hai phương pháp chính được áp dụng rộng rãi và có giá ừị thực tiễn, có thể chuyển các gen vào hàng loạt các cây trồng khác nhau, đó là: - Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tume/aciens - Chuyển gen trực tiếp 1.2.1 Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tume/aciens 1.2.1.1 Hệ thong chuyển gen. .. của giống ngô Hi-II tăng hiệu suất chuyển gen trung bình xấp xỉ 40% Frame & cs (2002) sử dụng vi khuẩn Agrobacterium mang vector nhị thể chuyển gen vào dòng ngô AI88 thu được hiệu suất chuyển gen đạt 5,5% 1.5.Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới và ở Vi t Nam 1.5.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây ngô trên thế giới Chuyển gen vào thực vật hai lá mầm thông qua vi khuẩn A.tumefaciens... đã chuyển gen Thông thường, huyền phù tế bào đơn được thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy chuyển là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen 1.2.2.4 Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phẩn Phương pháp chuyển gen này được gọi là phương pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào, có thể theo đường ống phấn chui vào bầu nhụy cái và chuyển. .. giá thà nh vật tư đắt 1.3 .Nghiên cứu chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua vỉ khuẩn Agrobacterium tumefaciens Sự thành công trong vi c tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tàn số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp Đối với phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thì tàn số... hành chuyển gen - Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium Các chất kháng sinh như: cefotaxim, carbenicillin, timentin thường được sử dụng để loại bỏ vi khuẩn sau khi nuôi cộng sinh trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban đầu ở ngô và lúa.Mặc dù Cefotaxim biểu hiện rất hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen ban... cao là cần thiết đối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tằn số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng nuôi cấy 1.4 .Nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens ở cây ngô Cây ngô chuyển gen (Zea mays) đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp sử dụng súng bắn gen vào năm 1990 (Gordon-Kamm... glyphosate và NK66BƯGT kháng sâu đục thân và kháng thuốc trừ cỏ) 1.6 Cơ sở khoa học nghiên cứu về chọn tạo cây ngô biến đổi gen kháng thuốc diệt cỏ Trong sản xuất nông nghiệp, kiểm soát cỏ dại là một vấn đề quan ừọng, nếu không kiểm soát cỏ dại có thể làm giảm sản lượng cây trồng từ 20-60% Ngày nay, hàng loạt các biện pháp phòng trừ cỏ dại đã được áp dụng như: sử dụng các thuốc diệt cỏ chọn lọc hoặc không... đất, thuốc diệt cỏ được sử dụng như một giải pháp duy nhất để loại trừ cỏ dại Trong giai đoạn từ 1991-2012, đặc tính kháng cỏ là tính trạng nổi bật Giống ngô kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đầu tiên được thương mại hóa vào năm 1996 bởi công ty Monsanto và được gọi là “Roundup Ready Com” Năm 2011 ngô biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ đã được trồng ở 14 quốc gia Đen năm 2012, 26 giống ngô kháng thuốc trừ cỏ. .. (Hưng Yên) thuộc Vi n Di truyền Nông nghiệp + Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật - Vi n Di truyền Nông nghiệp 2.2 .Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng - Các dòng ngô Vi t Nam VH1, CM8 được trồng trong nhà lưới cung cấp nguồn vật liệu phôi non cho các thí nghiệm chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ - Phương pháp trồng, chăm sóc, thụ phấn, thu mẫu Trồng ngô trên đất . nhận gen kháng thuốc trừ cỏ của một số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterỉum. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu đề tài tạo cơ sở cho nghiên cứu tạo dòng/ giống ngô chuyển gen kháng thuốc. cơ sở lý luận khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu tạo dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 2. Mục đích nghiên cứu - Biến. PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN TRẦN THỊ THANH DIỆP NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG NGÔ KHẢNG THUỐC TRỪ CỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM KHÓA LUÂN TÓT NGHIÊP ĐAI HOC • • • • Chuyên