Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus fermentum bằng phương pháp sấy phun hỗ trợ quá trình lên men ca cao

Lactobacillus fermentum đã được phân lập từ hạt ca cao lên men. Vi khuẩn này được đánh giá là có tác động tốt đối với chất lượng hạt ca cao sau lên men. Việc bổ sung giống khởi động có ý nghĩa đối với quá trình lên men ca cao, nhằm hạn chế và khắc phục tác động của một số điều kiện ảnh hưởng không tốt đối chất lượng hạt ca cao sau lên men. Nhằm thuận tiện cho việc bổ sung giống khởi động trong lên men thực phẩm, các loại chế phẩm vi sinh thường được sử dụng để thay thế cho sinh khối tươi. Sấy phun là một trong những phương pháp vi bao tạo các chế phẩm vi sinh đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất các loại chế phẩm vi bao hiện nay

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN Lactobacillus fermentum BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẤY PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO Họ tên : Đào Thị Minh Nguyệt Ngành : Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm dinh dƣỡng ngƣời Niên khóa : 2013 – 2017 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05 năm 2017 NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI BAO VI KHUẨN Lactobacillus fermentum BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẤY PHUN HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO Tác giả ĐÀO THỊ MINH NGUYỆT Khóa luận đệ trình để đáp ứng u cầu cấp Kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm dinh dưỡng người Giáo viên hướng dẫn: TS DƢƠNG THỊ NGỌC DIỆP TS VŨ THỊ LÂM AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05 năm 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài, nỗ lực cố gắng thân, tơi nhận giúp đỡ tận tình từ quý thầy cô, anh chị bạn bè Đầu tiên, xin cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa quý thầy cô khoa Công nghệ thực phẩm trang bị cho kiến thức suốt năm học Những kiến thức móng vững để tơi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu phục vụ cho công việc thời gian tới Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến TS Dương Thị Ngọc Diệp TS Vũ Thị Lâm An trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo cho tơi suốt q trình thực hồn thành đề tài Cảm ơn thầy cô, anh chị tập thể người phòng Thực Hành Vi Sinh, phòng Kỹ Thuật Thực Phẩm khoa Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm giúp đỡ sở vật chất, trang thiết bị bảo thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, ủng hộ tơi để tơi hồn thành đề tài Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất người Thành phố Hồ Chí Minh tháng 05 năm 2017 Đào Thị Minh Nguyệt i TÓM TẮT Lactobacillus fermentum phân lập từ hạt ca cao lên men Vi khuẩn đánh giá có tác động tốt chất lượng hạt ca cao sau lên men Việc bổ sung giống khởi động có ý nghĩa q trình lên men ca cao, nhằm hạn chế khắc phục tác động số điều kiện ảnh hưởng không tốt đối chất lượng hạt ca cao sau lên men Nhằm thuận tiện cho việc bổ sung giống khởi động lên men thực phẩm, loại chế phẩm vi sinh thường sử dụng để thay cho sinh khối tươi Sấy phun phương pháp vi bao tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp sản xuất loại chế phẩm vi bao Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích tạo chế phẩm vi bao vi khuẩn Lactobacillus fermentum phương pháp sấy phun tạo điều kiện thuận lợi cho việc bổ sung giống khởi động hỗ trợ trình lên men ca cao đạt hiệu Quá trình thực bao gồm thí nghiệm nhằm xác định loại chất vi bao (tinh bột acetate maltodextrin), tỉ lệ chất vi bao (10%, 15%, 20% 25%), nhiệt độ sấy phun đầu vào (100 oC, 110 oC, 120 oC 130 oC) thích hợp với L fementum, đảm bảo khả sống sót sau sấy phun Đồng thời, xác định tỉ lệ sống sốt vi khuẩn sau 30 ngày bảo quản Cuối so sánh khả sinh acid lactic chế phẩm sau 30 ngày bảo quản với sinh khối tươi bổ sung vào trình lên men ca cao ca cao lên men tự nhiên quy mơ phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy, tiến hành vi bao L fermentum với dịch tạo màng chứa 20% maltodextrin, nhiệt độ sấy phun đầu vào 100 oC tỉ lệ sống sót vi khuẩn đạt 25,76% Sau 30 ngày bảo quản 4±1 oC, tỉ lệ sống sót L fermentum chế phẩm 76,71% Khi bổ sung chế phẩm sau 30 ngày bảo quản sinh khối tươi vào trình lên men ca cao, sau ngày hàm lượng acid lactic trung bình hạt ca cao lên men tương đương 0,645% 0,654% (khơng có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê, p < 0,05) Như vậy, chế phẩm tạo thành thay cho sinh khối tươi việc bổ sung giống khởi động trình lên men ca cao ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH HÌNH ẢNH vii DANH SÁCH BẢNG BIỂU viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài .2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan ca cao 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Thành phần hóa học hạt ca cao tươi 2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men .5 2.1.4 Những biến đổi sinh hóa lên men hạt ca cao 2.2 Vi khuẩn lactic .8 2.2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 2.2.2 Lactobacillus fermentum .10 2.3 Vi bao phương pháp sấy phun 11 2.3.1 Giới thiệu .11 2.3.2 Phương pháp sấy phun 12 2.3.2.1 Nguyên lý trình sấy phun 12 2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun 12 2.3.2.3 Ưu điểm nhược điểm phương pháp sấy phun 14 2.3.3 Một số vật liệu vi bao 15 2.3.3.1 Gelatin .15 iii 2.3.3.2 Alginate 15 2.3.3.3 Xanthan gum 16 2.3.3.4 Tinh bột acetate .16 2.3.3.5 Maltodextrin 17 2.3.3.6 Whey protein 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu nghiên cứu 19 3.2.1 Nguyên liệu 19 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 19 3.2.3 Hóa chất sử dụng 20 3.3 Nội dung thí nghiệm 21 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp 22 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất vi bao dung dịch sấy phun đến khả sống sót L fermentum sau sấy phun .23 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào đến sống sót L fermentum sau sấy phun .24 3.4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót L fermentum thời gian bảo quản chế phẩm 25 3.4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả sinh acid lactic chế phẩm 25 3.5 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 26 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp cho vi khuẩn L fermentum 27 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất vi bao dung dịch sấy phun đến khả sống sót L fermentum sau sấy phun 28 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào đến sống sót L fermentum sau sấy phun .30 4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót L fermentum thời gian bảo quản chế phẩm 32 4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả sinh acid lactic chế phẩm 33 4.6 Kích cỡ cấu trúc bề mặt hạt chế phẩm 34 iv Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC .43 v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv Cộng tác viên PTNT Phát triển nông thôn LM Lên men TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TN Thí nghiệm TNHH Trách nhiệm hữu hạn TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh MD Maltodextrin TB Tinh bột rpm Tốc độ ly tâm (vòng/phút) μm micromet mg miligam ml mililit g gam hecta vi DANH SÁCH HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây cao cao Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa lên men hạt ca cao Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc kết nhuộm gram L fermentum 10 Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo máy sấy phun 13 Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic 14 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm sấy phun dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum 21 Hình 4.1 Tỉ lệ sống sót L fermentum, ẩm độ của, hiệu suất thu hồi chế phẩm sử dụng TB acetate MD làm chất vi bao 27 Hình 4.2 Tỉ lệ sống sót L fermentum, ẩm độ, hiệu suất thu hồi chế phẩm thay đổi tỉ lệ MD bổ sung vào dịch sấy phun 29 Hình 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào khả sống sót L fermentum sau sấy phun, ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm 31 Hình 4.4 Mật độ vi khuẩn L fermentum chế phẩm sau 30 ngày bảo quản lạnh 32 Hình 4.5 Vi ảnh SEM Maltodextrin, chế phẩm sấy 100 oC ngày thứ ngày thứ 30 bảo quản lạnh 35 Hình 4.6 Vi ảnh SEM mẫu chế phẩm sấy 100 oC 130 oC 36 Hình PL Mật độ vi khuẩn L fermentum nuôi cấy môi trường MRS lỏng 32 44 vii DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các thành phần hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Bảng 4.1 Kết hàm lượng acid lactic sau ngày lên men ca cao 33 Bảng PL 6.1.1 Mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun thay đổi vật liệu vi bao 47 Bảng PL 6.1.2 Ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm vi bao thay đổi vật liệu vi bao 47 Bảng PL 6.2.1 Mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun thay đổi tỉ lệ maltodextrin bổ sung 48 Bảng PL 6.2.2 Ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm vi bao thay đổi tỉ lệ maltodextrin bổ sung 49 Bảng PL 6.3.1 Mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun thay đổi nhiệt độ sấy đầu vào 50 Bảng PL 6.3.2 Ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm vi bao thay đổi nhiệt độ sấy đầu vào 51 Bảng PL 6.4.1 Kết chuẩn độ acid hạt ca cao lên men (% acid lactic) 52 viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, ca cao trở thành trồng chuyên canh nhiều vùng nước ta Tuy nhiên, nông hộ tập trung nghiên cứu kỹ thuật nâng cao suất trồng, vấn đề kỹ thuật lên men nhằm nâng cao ổn định chất lượng hạt ca cao cịn nhiều hạn chế Hiện nay, q trình lên men cao cao diễn cách tự nhiên, điều kiện thời tiết, khí hậu hệ vi sinh vật trình lên men mà thành phần, chất lượng hạt ca cao bị thay đổi, q trình lên men khơng ổn định: hạt ca cao lên men thường có hàm lượng acid cao, chất lượng liquor (nguyên liệu làm chocolate) bị đánh giá chua Trong nghiên cứu Schwan Wheals (2004); Vương Thanh Tùng (2006) có kết luận ảnh hưởng lớn điều kiện thời tiết trình lên men đến chất lượng hạt ca cao sau lên men chất lượng sản phẩm chế biến từ ca cao Hạt ca cao lên men điều kiện tự nhiên có chất lượng chấp nhận khơng đồng lớp khối ủ mẻ lên men Quá trình lên men ca cao phân hủy lớp cơm nhầy ca cao phức hợp vi sinh vật Quá trình ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng hạt ca cao sản phẩm sau giống nấm men: Hanseniaspora, Saccharomyces Brettanomyces; giống nấm mốc: Rhizopus Aspergillus; giống vi khuẩn acid lactic: Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus Lactobacillus; giống vi khuẩn acid acetic: Acetobacter diện trình lên men ca cao định danh Ngô Thị Phương Dung ctv (2012) Trong vi khuẩn lactic xác định có mặt suốt thời gian lên men ca cao Đã có nhiều nghiên cứu ngồi nước điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men ca cao tự nhiên việc bổ sung giống khởi động lên men ca cao Tuy nhiên, nghiên cứu nước việc bổ sung giống khởi động q trình lên men ca cao cịn hạn chế, đặc biệt bổ sung vi khuẩn lactic Việc bổ sung giống khởi động sản phẩm lên men ứng dụng cách rộng rãi Các giống khởi động chủng vi sinh vật tươi chế phẩm có chứa vi sinh vật Tuy nhiên, để thuận tiện cho việc lưu trữ, bảo quản chủng vi sinh vật thuận tiện cho việc ứng dụng quy mô sản xuất lớn, người ta thường sử dụng loại chế phẩm sản xuất từ trước Vi bao công nghệ thuận lợi cho việc lưu trữ cung cấp chủng vi khuẩn Trong số kỹ thuật vi bao, sấy phun dường lựa chọn tốt cho sản xuất quy mô lớn chế phẩm dạng bột có chứa chủng vi khuẩn với độ ẩm thấp Tính ổn định chủng vi khuẩn chế phẩm cao chủng đông lạnh tươi (Zhao ctv, 2008; Peighambardoust ctv, 2011) có khả lưu trữ nhiệt độ phòng (Chávez Ledeboer, 2007; Oliveira ctv, 2007) Nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng giống khởi động, hỗ trợ, nâng cao hiệu trình lên men ca cao, đề tài “Nghiên cứu chế phẩm vi bao vi khuẩn Lactobacillus fermentum phương sấy phun nhằm hỗ trợ trình lên men ca cao” tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Nghiên cứu tạo chế phẩm vi bao chứa vi khẩn Lactobacillus fermentum phương pháp sấy phun Từ đó, bước đầu khảo sát ảnh hưởng chế phẩm đến hạt ca cao lên men nhằm định hướng lâu dài việc ứng dụng chế phẩm hỗ trợ việc bổ sung giống khởi động giúp trình lên men ca cao đạt hiệu 1.3 Nội dung đề tài Để hoàn thành mục tiêu đề ra, trình thực đề tài bao gồm nội dung: - Xác định vật liệu chất mang thích hợp vi khuẩn L fermentum tỉ lệ chất mang thích hợp - Khảo sát nhiệt độ đầu vào thích hợp vi khuẩn L fermentum trình sấy phun - Thử nghiệm khả sinh acid lactic chế phẩm hạt ca cao lên men quy mơ phịng thí nghiệm Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan ca cao 2.1.1 Giới thiệu Cây ca cao có tên khoa học Theobroma cacao thuộc chi Thebroma cacao L họ Sterculiaceae, có nguồn gốc từ cánh rừng mưa Amazon Tuy nhiên ca cao hoang dại phát cách khoảng 3000 năm Trung Mỹ Mexico Hình 2.1 Cây cao cao Theo báo điện tử Bộ Nông nghiệp PTNT (2015), từ năm 2004, nước ta có chương trình phát triển diện tích trồng ca cao 50.000 đến năm 2020, diện tích cho trái 42.000 với xuất trung bình 1,2 tấn/ha Từ có chủ chương Nhà nước, diện tích trồng ca cao tăng từ 1.218 (năm 2004) lên 20.000 (năm 2011), thu hút tổng số nông dân tham gia khoảng 35.000 người Theo ông Nguyễn Vinh Thành, chuyên gia phân tích ca cao tập đồn Cargill Hà Lan, sản lượng ca cao toàn cầu năm qua không tăng nhiều bất ổn nước sản xuất ca cao hàng đầu Bờ Biển Ngà bị giảm sản lượng khoảng 38%, Ghana giảm khoảng 19% Trong đó, nhu cầu sử dụng hạt ca cao giới tăng, dẫn đến tình trạng cung không đủ cầu, đặc biệt nước Brazil, Nga, Ukraina… Có thể nói, hội cho Việt Nam phát triển diện tích sản lượng ca cao Ơng Nguyễn Văn Hồ, phó cục trưởng cục trồng trọt (Bộ Nông nghiệp PTNT) cho biết, ca cao Việt Nam khôi phục phát triển từ có hỗ trợ dự án quốc tế Success alliance từ vài chục năm 2000 tăng lên 7.320 năm 2006, tăng lên 11.400 vào cuối năm 2007 dự kiến đến 2015 đạt 60.000 Trong đó, có gần 1.000 cho thu hoạch, suất ban đầu đạt bình quân 0,8 tấn/ha, ước tính sản lượng đạt 773 Nhiều mơ hình trồng ca cao đạt suất từ 1,5 đến hạt khô/ha như: hộ ông Trần Hùng Sơn, xã Phú Đức, huyện Châu Thành (Bến Tre), hộ ông Đào Văn Tuấn, xã Dăk Rla, huyện Đăkmil (Đăk Nơng) 2.1.2 Thành phần hóa học hạt ca cao tƣơi Thành phần cấu tạo ca cao gồm có: vỏ cùi trụ chiếm 60% hạt tươi chiếm 40% khối lượng quả, khoảng 0,2% lớp cơm nhầy bao quanh hạt ca cao Bảng 2.1 thể thành phần hạt ca cao tươi Bảng 2.1 Các thành phần hạt ca cao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Thành phần Nước Chất béo (bơ ca cao) Carbohydrate + Cellulose + Tinh bột + Pentosan + Sucrose + Glucose + Fructose Nitrogen + Protein + Theobromine + Enzyme Polyphenol Acid citric, acetic, oxalic Muối khoáng Tổng số Chất nhầy (Mucilage/Sweating) 84,5 - Vỏ hạt (Shell/Testa) 9,4 3,8 Phôi nhũ (Cotyledon/Kernel) 35 31,3 2,7 0,7 10,0 13,8 46,0 - 3,2 4,5 4,9 1,1 0,6 0,7 18,0 0,8 - 8,4 2,4 0,8 5,2 0,6 0,8 100 8,2 100 2,6 100 (Hardy, 1960) Nhìn chung, nước glucose chiếm chủ yếu lớp cơm nhầy ca cao Thành phần chủ yếu vỏ hạt tinh bột Trong phôi nhũ, chứa nhiều thành phần Bao gồm theobromine, polyphenol enzyme mà phần cơm nhầy vỏ hạt 2.1.3 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men Trong quy trình sản xuất hạt ca cao lên men, lên men giai đoạn quan trọng nhất, nhằm thủy phân phần cơm bao bọc xung quanh hạt làm chết mầm hạt ca cao Tại giai đoạn phản ứng sinh hóa diễn mãnh liệt để giảm vị đắng, chát, tạo tiền chất cho hương vị chocolate (amino acid, đường khử, polyphenol…), bên cạnh cịn tạo ngun liệu cho q trình biến đổi sinh hóa chất lượng giai đoạn phơi sấy, bảo quản, rang chế biến chocolate Hình 2.2 mơ tả khái qt quy trình sản xuất hạt ca cao lên men tự nhiên Quả ca cao Bỏ vỏ Tách hạt Ủ hạt ca cao Lên men Làm khô Phân loại Hạt ca cao LM Hình 2.2 Quy trình sản xuất hạt ca cao lên men Theo Schwan ctv (2004), lớp cơm nhầy hạt ca cao mơi trường thích hợp cho phát triển vi sinh vật chứa 82-87% nước, 10-15% đường, 2-3% pentosan, 1-3% acid citric, 1-1,5% pectin Chính vậy, từ bóc vỏ quả, lớp cơm nhầy nhiễm nhiều loại vi sinh vật Nhìn chung, trình lên men hạt ca cao chuỗi trình lên men nối tiếp thể qua biến động mật độ số nhóm vi sinh vật mà chủ yếu nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic 2.1.4 Những biến đổi sinh hóa lên men hạt ca cao Lên men ca cao xảy qua hai giai đoạn chính:  Giai đoạn 1: lên men lớp nhầy bao quanh hạt làm cho đường chuyển thành rượu acid Trong giai đoạn lớp nhầy lên men nhờ vào vi sinh vật làm cho lớp nhầy bị phân hủy, từ khơng khí xâm nhập vào khối ca cao  Giai đoạn 2: lượng acid tạo thành thấm vào bên hạt ca cao gây phản ứng sinh hóa, làm giảm vị đắng chát, tạo thành tiền chất, hương vị cho ca cao Hình 2.3 Biến đổi sinh hóa lên men hạt ca cao Bắt đầu trình lên men q trình phân giải yếm khí lớp cơm nhầy chứa 10-15% đường, 1,5% peptin pH thấp, tạo điều kiện cho nấm men phát triển mạnh Trong 48 đầu q trình lên men yếm khí khơng bắt buộc, phản ứng sinh hóa chủ yếu chuyển hóa đường cơm nhầy thành C2H5OH, CO2, lượng số sản phẩm khác nhờ nấm men Sự chuyển hóa tạo điều kiện yếm khí cho phép phát triển vi khuẩn Lactobacillus, chủ yếu L plantarum, L collinoides L fermentum, vi khuẩn tham gia vào trình phân hủy đường cơm nhầy Sản phẩm tạo thành acid lactic (theo đường lên men đồng hình), tạo acid lactic, acid acetic số acid hữu khác (theo đường lên men dị hình) Vi khuẩn acetic oxy hóa C2H5OH tạo acid acetic Các acid sinh nhiều, nồng độ C2H5OH cao nhiệt độ cao ức chế phát triển nấm men, phá vỡ thành tế bào, diệt chết phôi mầm Sau phôi mầm chết số enzyme lipase, protease…, có phôi mầm di chuyển vào bên nội nhũ, nội nhũ có loại tế bào quan trọng tế bào dự trữ chất béo, protein tế bào chứa hợp chất polyphenolic methylxanthine (là kết hợp theobromine caffeine) Khi thành tế bào bị phá vỡ, hợp chất bên có điều kiện tiếp xúc với nhau, tác dụng enzyme phản ứng sinh hóa xảy ra, sản phẩm q trình sinh hóa amino acid, đường khử, polyphenol, sau hợp chất kết hợp với thông qua phản ứng Maillard, phản ứng Caramel hóa hình thành hương vị đặc trưng chocolate (Stephen, 2009 - Trích dẫn Nguyễn Tiến Thành, 2014) Trong q trình lên men, polyphenol bị oxy hóa tạo sắc tố nâu ca cao Các anthocyanin nhanh chóng thủy phân tạo cyanidin đường tác dụng enzyme glucosidase để tạo nên màu nâu quinnon Theo Schwan ctv (1995), sau lên men hợp chất cịn lại 20%, có lợi sức khỏe người 2.2 Vi khuẩn lactic 2.2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh việc lên men sữa kết hoạt động nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi vi khuẩn lactic Năm 1887, Joseph Lister phân lập thành cơng lồi vi khuẩn lactic khiết đặt tên Bacterium lactic (hiện gọi Streptococcus lactis) Vi khuẩn lactic gặp đất nước, thường phát triển mơi trường có chất hữu phức tạp sữa sản phẩm từ sữa, thịt sản phẩm từ thịt, bia, rượu vang rau muối chua Ngồi vi khuẩn lactic cịn tìm thấy da, nước bọt, niêm mạc hệ tiêu hóa người số động vật Theo Kiều Hữu Ảnh (2010), loài vi khuẩn thuộc 12 chi xếp vào nhóm vi khuẩn lactic khả tạo thành lượng lớn acid lactic từ hydrate carbon Trong đó, lồi thuộc chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus sử dụng làm giống khởi động trình lên men thực phẩm Một số đặc điểm chi mô tả Vos ctv (2009):  Lactobacillus: gồm nhóm khơng đồng vi khuẩn hình que Gram dương, tế bào thay đổi từ trực khuẩn ngắn đến dài, thường không di động, không sinh bào tử, kỵ khí bắt buộc Nhiệt độ sinh trưởng dao động từ 2-50 oC, nhiệt độ tối ưu thường 30-40 oC pH tối ưu thường từ 5,5-6,2  Leuconostoc: tế bào có hình cầu thường kéo dài, xếp thành cặp chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, khơng sinh bào tử, kỵ khí khơng bắt buộc Mặc dù sinh trưởng pH 4,5 lồi thuộc chi khơng ưa acid, thích pH trung bình ban đầu 6,5 Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 20-30 oC, phát triển oC  Pediococcus: vi khuẩn Gram dương Các tế bào đại diện điển hình khơng di động, có hình trứng chia thành cặp chia theo hai hướng vng góc tạo thành bốn tế bào không xếp thành chuỗi Tăng trưởng pH không tăng trưởng pH 9, ngoại trừ Pediococcus stilesii Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 25-35 oC, phụ thuộc vào lồi  Streptococcus: tế bào thường có hình cầu hình bầu dục, có đường kính μm, xếp theo chuỗi theo cặp nuôi môi trường lỏng Các tế bào vi khuẩn Gram dương, kỵ khí khơng bắt buộc Nhiệt độ tối ưu thường khoảng 37 oC, nhiệt độ tối đa tối thiểu khác loài  Lactococcus: tế bào có hình cầu hình trứng trịn, đứng riêng lẻ, thành cặp chuỗi thường kéo dài chuỗi Đây vi khuẩn Gram dương, không di động, từ kỵ khí khơng bắt buộc đến kỵ khí bắt buộc Tăng trưởng 10 oC không tăng trưởng 45 oC Lên men lactic q trình chuyển hóa carbohydrate thành acid lactic nhờ hoạt động sống vi sinh vật, điển hình vi khuẩn lactic Có kiểu lên men lactic lên men lactic đồng hình lên men lactic dị hình - Lên men lactic đồng hình trình lên men vi khuẩn lactic đồng hình, có khả phân hủy đường theo đường đơn giản cho sản phẩm chủ yếu acid lactic (80-90%) - Lên men lactic dị hình trình lên men vi khuẩn lactic dị hình Chúng phân hủy đường thành acid lactic hàng loạt sản phẩm khác chiếm tỉ lệ cao: acid lactic (40%), ethanol (20%), acid acetic (10%), chất khí cịn lại (20%) (Yuan, 1999 - Trích dẫn Trần Thị Ái Liên, 2011) 2.2.2 Lactobacillus fermentum Lactobacillus fermentum thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus Là vi khuẩn Gram dương, có hình que, kích thước thường thay đổi, thường ngắn, 0,5-1,0 x 3,0-15,0 μm, xếp thành cặp chuỗi a b Hình 2.4 Hình ảnh khuẩn lạc (a) kết nhuộm gram (b) L fermentum Nhiệt độ phát triển: nhiệt độ tối ưu từ 37-42 oC, nhiệt độ thấp từ 15-18 oC, nhiệt độ cao từ 48-50 oC Theo Wood Holzapfel (1995), L fermentum xếp vào loại lên men dị hình bắt buộc Thường lên men tạo acid từ D-Ribose, D-Galactose, D-Glucose, D-Fructose, 10 D-Maltose, D-Lactose, D-Melibiose, D-Sucrose, D-Trehalose, D-Raffinose (Abramov, 2014 – Trích dẫn Lehri ctv, 2017) Nghiên cứu Võ Thị Mỹ Lộc ctv (2013) cho thấy, điều kiện lên men tự nhiên, mẫu có chất lượng hạt ca cao tốt sau lên men mẫu có số lượng vi khuẩn lactic cao Trong nhóm vi khuẩn lactic chiếm chủ yếu L fermentum phân lập định danh 2.3 Vi bao phƣơng pháp sấy phun 2.3.1 Giới thiệu Vi bao phương pháp cố định tế bào sử dụng rộng rãi Đây phương pháp sử dụng chất tạo màng polymer có nguồn gốc tự nhiên gelatin, alginate, chitosan… có nguồn gốc nhân tạo polyamide, polyester, polyethylene glycon (PEG)… để bao gói tế bào Vi sinh vật sống nang nhỏ Điều giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm tổn thất số lượng tế bào (Lê Quan Nghiệm ctv, 2007 - Trích dẫn Đỗ Quốc Cường, 2009) Một số phương pháp vi bao bao gồm: sấy phun, sấy lạnh đông, ép đùn, giọt tụ,… Tất phương pháp có ưu khuyết điểm riêng Sấy phun kỹ thuật đóng gói lâu đời sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp thực phẩm Sự phát triển thiết bị kỹ thuật sấy phun phát triển qua thời gian vài thập kỷ, từ năm 1870 đến năm 1900 Trong ngành công nghiệp thực phẩm, sấy phun phương pháp vi bao phổ biến nhất, coi có hiệu cao chi phí hợp lý (Gharsallaoui ctv, 2007) Đây trình liên tục Quá trình sản xuất loại bột tinh khiết tốt với độ vô trùng cao (Menshutina ctv., 2010) Kỹ thuật sấy phun áp dụng rộng rãi đóng gói vi khuẩn probiotic, nơi vi sinh vật vượt qua thành công điều kiện nhiệt độ đột ngột (Riveros ctv 2009; Boza ctv, 2004 - Trích dẫn Duong Thi Ngoc Diep, 2013) Theo Anadharamakrishnan ctv (2015), thông thường, tiến hành vi bao chủng vi sinh vật, phải chọn tế bào giai đoạn tăng trưởng giai đoạn cân Điều góp phần tăng khả sống sót vi sinh vật q trình vi bao 11 2.3.2 Phƣơng pháp sấy phun 2.3.2.1 Nguyên lý trình sấy phun Sấy phun phương pháp sấy giúp chuyển trạng thái nguyên liệu từ dạng lỏng sang dạng bột khơ Trong q trình sấy phun, dịch nguyên liệu hệ thống vòi phun phân tán thành hạt ẩm cho tiếp xúc với luồng không khí nóng buồng sấy với thời gian ngắn (Patel ctv, 2009) Theo Lê Văn Việt Mẫn (2011), trình sấy phun gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn 1: chuyển nguyên liệu cần sấy thành dạng sương mù (các hạt lỏng phân tán mơi trường khơng khí) nhờ cấu phun sương thiết bị sấy phun Kích thước giọt lỏng sau giai đoạn phun sương dao động khoảng 10-200 μm - Giai đoạn 2: hòa trộn sương mù với tác nhân sấy buống sấy Đây giai đoạn tách ẩm khỏi nguyên liệu Do nguyên liệu phun sương nên diện tích tiếp xúc bề mặt giọt lỏng tác nhân sấy lớn Nhờ đó, ẩm nguyên liệu bay nhanh chóng Sản phẩm tạo thành dạng bột mịn Thời gian tách ẩm diễn khoảng từ vài giây đến vài chục giây - Giai đoạn 3: tách sản phẩm khỏi dòng tác nhân sấy Người ta sử dụng hệ thống “Cyclon”, túi lọc phương pháp kết tủa môi trường tĩnh điện, phổ biến sử dụng “Cyclon” 2.3.2.2 Cấu tạo hệ thống sấy phun Các hệ thống sấy phun bao gồm: tác nhân sấy (khơng khí sấy), caloriphe để gia nhiệt cho tác nhân sấy, vòi phun, buồng sấy, hệ thống cyclon thu hồi sản phẩm, quạt hút 12 Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo hệ thống sấy phun (Masters, 1991)  Tác nhân sấy Thường sử dụng khơng khí nóng có nhiệt độ thay đổi tùy thuộc vào vật liệu sấy  Vòi phun Theo Trần Văn Phú (2008), vòi phun vừa giúp đưa vật liệu sấy vào buồng sấy, vừa tạo sương mù uá trình phun sương định kích thước hạt ẩm phân bố chúng buồng sấy, ảnh hưởng đến hiệu suất trao đổi nhiệt tốc độ sấy Hiện có dạng vịi phun vịi phun áp lực, vịi phun khí động vịi phun ly tâm (Westergaard, 2004)  Buồng sấy Buồng sấy nơi vật liệu sấy (các hạt ẩm) tiếp xúc với tác nhân sấy (khơng khí nóng) Buồng sấy có nhiều dạng khác phổ biến buồng sấy hình trụ đứng, buồng sấy hình với góc (2α) 50-60o Kích thước buồng sấy thiết kế phụ thuộc vào kích thước quỹ đạo chuyển động hạt từ cấu phun sương tạo (Westergaard, 2004)  Hệ thống thu hồi sản phẩm Các hạt bột sau sấy khô buồng sấy bị hút theo dịng khơng khí đến hệ thống “Cyclon” tác dụng quạt hút Hệ thống “Cyclon” thiết kế để hướng dịng khơng khí di chuyển theo kiểu xoáy ly tâm Các hạt bột va chạm với thành thiết bị rơi xuống thu hồi Dịng khơng khí quạt hướng dòng đến phận gia nhiệt, tách ẩm tuần hoàn lại vào buồng sấy 13  Quạt Hệ thống sấy phun trang bị hai quạt uạt đặt sau hệ thống “Cyclon” thu hồi sản phẩm, có tác dụng tạo lực hút dịng khơng khí có chứa sản phẩm bột sấy qua hệ thống “Cyclon” để phân tách khí thải thu hồi sản phẩm uạt phụ đặt trước thiết bị gia nhiệt khơng khí trước vào buồng sấy, có tác dụng tạo lực đẩy khơng khí đến thiết bị gia nhiệt vào buồng sấy Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic (Hình 2.3) có cấu phun sương dạng vịi phun khí, hoạt động nhờ áp lực khí nén, sử dụng nghiên cứu Hình 2.6 Máy sấy phun Lab Plant SD – Basic 2.3.2.3 Ưu điểm nhược điểm phương pháp sấy phun Theo Keshani ctv (2015); Roustapur ctv (2006), phương pháp sấy phun có ưu nhược điểm  Ưu điểm - Thời gian sấy nhanh so với phương pháp sấy tạo sản phẩm bột khác - Ẩm độ hoạt độ nước sản phẩm thấp, có khả bảo quản tốt - Thòi gian tiếp xúc hạt lỏng tác nhân sấy thiết bị ngắn, làm giảm tác động nhiệt thành phẩn có mẫu sấy 14  Nhược điểm - Khơng thể sử dụng cho mẫu ngun liệu có độ nhớt cao - Tính linh động sản xuất thấp thiết bị sấy phun thường thiết kế để sản xuất số sản phẩm với tính chất tiêu đặc thù riêng 2.3.3 Một số vật liệu vi bao 2.3.3.1 Gelatin Gelatin sản phẩm thu từ thủy phân có giới hạn collagen, chứa 18 loại amino acid khác trừ tryptophan cysteine Gelatin chất rắn dạng miếng, bột, vảy… khơng mùi, có màu từ vàng nhạt đến trắng Chúng hấp thu lượng nước gấp 5-10 lần khối lượng Khi gia nhiệt, gelatin hydrate hóa nhanh chóng chuyển thành dạng dung dịch Gelatin có khả tạo màng phim bền màng phim mỏng đến 100 μm Trong công nghiệp thực phẩm, gelatin loại keo ưa nước dùng làm tác nhân tạo gel, tạo độ đặc hay ổn định cấu trúc Khả tạo gel tính chất chức quan trọng gelatin phụ thuộc vào nhiệt độ Độ bền gel biểu thị độ Bloom, số cao độ bền gel lớn Ngồi ra, gelatin biết đến mơi trường nuôi cấy giữ giống vi sinh vật Đây vật liệu rẻ tiền, dễ dàng tạo gel bao quanh tế bào, không độc, dễ dàng bị thủy giải mơi trường dày-ruột giải phóng tế bào Tuy nhiên, gelatin dễ tan chảy 40 oC gây ảnh hưởng đến q trình sấy khơ vi bao (Lê Quan Nghiệm ctv, 2007 - Trích dẫn Đỗ Quốc Cường, 2009) 2.3.3.2 Alginate Alginate muối acid alginic, polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh chiết suất từ tảo nâu Cấu tạo hóa học alginate gồm hai phân tử β-D-mannuronate α-L-guluronate liên kết với liên kết 1,4 glucozit Alginate có tính acid yếu, khơng màu, khơng mùi, có tính ưa nước tính tương hợp sinh học cao, rẻ tiền Tính chất quan trọng alginate độ nhớt khả tạo gel Ứng dụng thương mại alginate thực phẩm địi hỏi hình thành mạng gel liên tục Các cation Ca2+, Na+ thúc đẩy hình thành gel mà khơng cần gia nhiệt Đồng thời điểm nóng chảy gel tăng theo độ mạnh ion Khi Na thay Ca, ion Ca2+ phối hợp với hai chuỗi alginate, liên 15 kết chúng lại với Cấu trúc linh hoạt linh hoạt tạo thành mạng lưới liên kết khổng lồ - loại gel 2.3.3.3 Xanthan gum Xanthan gum polysaccharide tự nhiên polymer sinh học công nghiệp quan trọng Nó phát vào năm 1950 phịng thí nghiệm nghiên cứu khu vực phía Bắc Bộ Nơng nghiệp Hoa Kỳ (Margaritis Zajic, 1978) Đây heteropolysaccharide với cấu trúc gồm đơn vị pentasaccharide lặp lặp lại hình thành hai đơn vị glucose, hai đơn vị mannose, đơn vị acid glucuronic Dung dịch xanthan thu cách hịa tan nhiệt độ trung bình có xu hướng có độ nhớt cao Nhiệt độ hịa tan ảnh hưởng lớn đến độ nhớt cách kiểm soát cấu tạo phân tử xuất cấu trúc yêu cầu Các phân tử xanthan dường có hai hình dạng, xoắn cuộn ngẫu nhiên, tùy thuộc vào nhiệt độ hòa tan (Horton ctv, 1985) Xanthan gum hịa tan cao nước lạnh nóng Dung dịch xanthan có độ nhớt cao nồng độ polymer thấp Các tính chất hữu ích nhiều ứng dụng công nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp thực phẩm, nơi xanthan sử dụng chất làm đặc, để ổn định huyền phù nhũ tương (GarcíaOchoa ctv, 2000) 2.3.3.4 Tinh bột acetate Thành phần tinh bột bao gồm amylose amylopectin Tỉ lệ amylose thường khoảng 15-25% Ngồi amylose amylopectin, hạt tinh bột cịn chứa số thành phần nhỏ protein, lipid, chất vô polysaccharides khơng tinh bột Phân tử amylose có xu hướng tự định hướng theo kiểu song song chặt chẽ đủ phép liên kết hydro chuỗi liền kề Điều dẫn đến việc giảm lực polymer cho nước, dung dịch trở nên mờ đục Amylopectin khơng có tính di động tốt dung dịch kích thước lớn tính chất phân nhánh (Liu, 2005 - Trích dẫn Duong Thi Ngoc Diep, 2013) Tinh bột tự nhiên không thuận lợi cho ứng dụng thực phẩm nhiều hạn chế không tan nước lạnh, nhớt dày lên sau nấu ăn Để khắc phục thiếu sót này, tinh bột bị biến đổi mặt hóa học vật lý Các trình biến đổi phổ biến xử lý acid, tạo liên kết ngang, oxy hóa thay 16 bao gồm ester hóa ether hóa Tinh bột biến tính acid có độ bền màng cao, thích hợp việc ứng dụng đặc tính tạo gel, tạo màng cho sản phẩm Độ bền gel tinh bột tăng lên cách hiệu chỉnh điều kiện sản xuất Vì điều kiện thường mà biến đổi tiến hành với H2SO4 0,1N tạo thành tinh bột biến tính có độ bền gel lớn (Chen ctv, 1999) Tinh bột acetate tạo cách cho phản ứng tinh bột với acetic anhydride vinyl acetate Tinh bột báo cáo có khả tạo thành liên kết tuyệt vời, thích hợp cho ứng dụng tạo màng bao Hiện nay, tinh bột acetate tổng hợp, mô tả đánh tác nhân vi bao (Chowdary ctv, 2011) 2.3.3.5 Maltodextrin Theo định nghĩa quan thực phẩm thuốc Hoa Kỳ, maltodextrin polysaccharide thu cách thủy phân phần tinh bột (bằng enzyme acid), dạng bột màu trắng, dễ hút ẩm, thường hòa tan nước Cấu trúc bao gồm nhiều đơn vị glucose liên kết liên kết α: → glycosidic Số lượng đơn vị glucose biến định mức đương lượng dextrose (DE) Thơng thường maltodextrin có đương lượng dextrose từ đến 20 Nhìn chung, maltodextrin xác nhận chất vi bao tốt prebiotic vừa phải cho tồn cao chế phẩm sinh học (Cortés-Arminio ctv, 2010) Protein (đạm đậu nành whey protein) thường sử dụng chất phụ trợ với maltodextrin theo tỷ lệ quy định để cải thiện vi bao vi sinh vật lựa chọn (Chavez Ledeboer, 2007) Năm 1991, Reineccius rằng, dịch tạo màng chứa maltodextrin có DE cao có khả thẩm thấu oxi thấp hơn, bảo vệ tốt thành phần vi bao Năm 2011, Anekella đã sử dụng maltodextrin làm vật liệu vi bao Lactobacillus acidophilus Lactobacillus rhamnosus bột mâm xôi phương pháp sấy phun Kết cuối cho thấy, tỉ lệ sống sót vi khuẩn sau sấy phun lên đến 84,33% Kumalaningsih cộng (2011) thành công vi bao Lactobacillus sp với dịch chiết chùm ngây cho thực phẩm bổ sung Trong dịch sấy phun, maltodextrin bổ sung 15% làm chất hỗ trợ vi bao 17 2.3.3.6 Whey protein Whey protein thuật ngữ mơ tả protein sữa cịn lại huyết sau kết tủa casein pH 4,6 khoảng 20 oC Nó chủ yếu hỗn hợp β-lactoglobulin, α-lactalbumin, albumin huyết globulin miễn dịch với điểm đẳng điện pH gần 5,0 (Fitzsimons ctv, 2007) Whey protein tìm thấy có đặc tính đóng gói tuyệt vời cao tác nhân thường sử dụng (Young ctv 1993) Một số nghiên cứu whey protein hiệu việc đóng gói chất dễ bay hơi, không bay hơi, phân cực không cực, chất lỏng tinh thể cho thực phẩm dược phẩm, sử dụng cho vi bao hịa tan nước khơng tan nước Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng whey protein làm chất vi bao phương pháp sấy phun Trong nghiên cứu vào năm 2015, Khem đề xuất whey protein sử dụng yếu tố cấu trúc chất mang probiotic Sau trình sấy phun (nhiệt độ đầu vào 110 oC, nhiệt độ đầu gần 70 oC), sống Lactobacillus plantarum A17 B21 đạt 109 cfu/g sau tuần bảo quản Liêu Mỹ Đông ctv (2015) kết luận: chế phẩm vi bao phương pháp sấy phun với 10% whey protein % maltodextrin cho hiệu bảo vệ Lactobacillus casei cao 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 Phịng Thí Nghiệm Vi Sinh, phịng Kỹ Thuật Thực Phẩm khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Nguyên liệu Giống vi khuẩn Lactobacillus fermentum 3872 phân lập từ hạt ca cao lên men cung cấp phịng Thí Nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM Giống vi khuẩn hoạt hóa bảo quản ống thạch nghiêng để phục vụ đề tài Sau tháng, vi khuẩn giữ giống lại để đảm bảo chất lượng giống suốt trình nghiên cứu Maltodextin DE 12 (Ấn Độ) mua cửa hàng hóa chất Bách Khoa, đường Tô Hiến Thành, quận 10, TP HCM Tinh bột acetate cơng ty TNHH xuất nhập Nam Bảo Tín, 23/6 đường 26, khu phố 7, phường Linh Đông, quận Thủ Đức, TP.HCM sản xuất cung cấp Trái ca cao cung cấp công ty ca cao Nguyên Lộc, huyện Cẩm Mỹ, thị xã Long Khánh, tỉnh Đồng Nai 3.2.2 Dụng cụ thiết bị  Dụng cụ Dụng cụ Hãng sản xuất Bình định mức loại Duran, Đức Bình tam giác loại Duran, Đức Micropipette Vitlab Đĩa Petri Duran, Đức 19  Thiết bị Thiết bị Hãng sản xuất Cân điện tử số lẻ Ohaus Corp.pine Brook Tủ sấy Contherm Scientific, New Zealand Nồi tiệt trùng ALP, Nhật Bản Kính hiển vi Olympus Máy ly tâm MSE Máy sấy phun LabPlant SD – Basic, Anh Máy phân tích ẩm hồng ngoại SHS, Nhật Bản 3.2.3 Hóa chất sử dụng  Mơi trường MRS agar, MRS broth ( Biokar, Pháp)  Dung dịch NaOH 0,1N ( ống chuẩn NaOH 0,1 N, Việt Nam)  Phenolphtalein 1%  Dung dịch nước muối NaCl (0,85%) 20 3.3 Nội dung thí nghiệm Quy trình tạo chế phẩm phương pháp sấy phun nghiên cứu mơ tả sơ lược Hình 3.1 Bao gồm sơ đồ thực tiến trình thí nghiệm Dịch vi sinh vật Dịch tạo màng TN1: Khảo sát vật liệu vi bao TN2: Khảo sát tỉ lệ bổ sung vật liệu vi bao Phối trộn Khuấy từ Sấy phun TN3: Khảo sát nhiệt độ sấy đầu vào Sản phẩm chế phẩm TN4: Theo dõi thời gian bảo quản chế phẩm TN5: Thử nghiệm hoạt tính chế phẩm sau thời gian bảo quản Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm sấy phun dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum 21 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp Mục đích thí nghiệm tìm vật liệu vi bao thích hợp cho vi khuẩn L fermentum, đảm bảo khả sống sót cao vi khuẩn sau q trình sấy phun Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm yếu tố vật liệu vi bao với loại vật liệu tinh bột acetate maltodextrin Chuẩn bị mẫu: - Dịch tạo màng: sau vài lần sấy phun thử nghiệm dung dịch tinh bột acetate, tỉ lệ tinh bột acetate lựa chọn đưa vào thí nghiệm 10% (w/v) Tỉ lệ maltodextrin lựa chọn 15% (w/v) (Kumalaningsih ctv, 2011) Cả hai loại chất vi bao hòa tan 400 ml nước cất vô trùng - Dịch vi sinh vật: tế bào vi khuẩn L fermentum tăng sinh môi trường MRS lỏng thu hoạch giai đoạn tăng trưởng muộn pha log (Phụ lục 2) phương pháp ly tâm 6000 rpm phút Sinh khối thu được làm nước muối NaCl 0,85% trước đưa vào dịch tạo màng Tiến hành thí nghiệm: - Sinh khối vi khuẩn cho vào dịch tạo màng khuấy máy khuấy từ Rút ml hỗn dịch để tiến hành xác định mật độ vi sinh vật trước sấy phun Sau tiến hành sấy phun phần cịn lại Trong trình sấy phun, hỗn dịch vi khuẩn chất tạo màng phải khuấy liên tục để vi khuẩn phân bố hỗn dịch Dịch sấy phun đưa vào máy sấy phun nhờ bơm nhu động với tốc độ bơm 8-10 ml/phút Áp suất khơng khí cố định 0,4 MPa Nhiệt độ khơng khí đầu vào hệ thống 120 ± oC, nhiệt độ đầu 65 ± oC Thực cho loại dịch tạo màng - Định lượng tế bào vi khuẩn sau vi bao: để xác định mật độ vi khuẩn chế phẩm sau sấy phun g chế phẩm cho vào ml nước muối NaCl 0,85% Sau pha lỗng, dịch pha lỗng cấy mơi trường thạch MRS ủ 37 oC Sau 24 giờ, tiến hành đếm khuẩn lạc 22 Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun, độ ẩm chế phẩm, hiệu suất thu hồi bột chế phẩm Dựa vào tỉ lệ sống sót vi khuẩn sau sấy phun để chọn loại vật liệu vi bao thích hợp (tỉ lệ sống sót cao hơn) 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất vi bao dung dịch sấy phun đến khả sống sót L fermentum sau sấy phun Mục đích thí nghiệm xác định nồng độ chất vi bao thích hợp để vi bao vi khuẩn hiệu Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm yếu tố nồng độ chất vi bao với mức 10%, 15%, 20% 25% (w/v) Chuẩn bị mẫu: - Dịch tạo màng: dựa vào kết Thí nghiệm 1, chất vi bao thích hợp L fermentum lựa chọn hịa tan 400 ml nước cất vơ trùng với mức 10%, 15%, 20% 25% (w/v) - Dịch vi sinh vật chuẩn bị tương tự Thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm: - Sinh khối vi khuẩn cho vào dịch tạo màng khuấy máy khuấy từ Rút ml hỗn dịch để tiến hành xác định mật độ vi sinh vật trước sấy phun Sau tiến hành sấy phun phần cịn lại Trong q trình sấy phun, hỗn dịch vi khuẩn chất tạo màng phải khuấy liên tục để vi khuẩn phân bố hỗn dịch Dịch sấy phun đưa vào máy sấy phun nhờ bơm nhu động với tốc độ bơm 8-10 ml/phút Áp suất khơng khí cố định 0,4 MPa Nhiệt độ khơng khí đầu vào hệ thống 120 ± oC, nhiệt độ đầu 65 ± oC Thực cho nồng độ chất tạo màng khác - Định lượng tế bào vi khuẩn sau vi bao: để xác định mật độ vi khuẩn chế phẩm sau sấy phun g chế phẩm cho vào ml nước muối NaCl 0,85% Sau pha lỗng, dịch pha lỗng cấy mơi trường thạch MRS ủ 37 oC Sau 24 giờ, tiến hành đếm khuẩn lạc Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun, độ ẩm chế phẩm, hiệu suất thu hồi bột chế phẩm So sánh, chọn mức nồng độ chất vi 23 bao có tỉ lệ sống sót vi khuẩn sau sấy phun cao để làm yếu tố cố định cho thí nghiệm 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đầu vào đến sống sót L fermentum sau sấy phun Mục đích thí nghiệm xác định nhiệt độ đầu vào thích hợp sống sót vi khuẩn L fermentum sau trình sấy phun Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm yếu tố nhiệt độ đầu vào trình sấy phun 100 oC, 110 oC, 120 oC 130 oC (mức nhiệt độ thí nghiệm lựa chọn dựa theo sở thí nghiệm tối ưu Anekella, 2011) Chuẩn bị mẫu: - Dịch tạo màng: loại nồng độ chất vi bao thích hợp cho L fermentum xác định Thí nghiệm yếu tố cố định cho Thí nghiệm Hịa tan loại chất vi bao theo nồng độ xác định hai thí nghiệm 400 ml nước cất vơ trùng - Dịch vi sinh vật chuẩn bị tương tự Thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm: - Sinh khối vi khuẩn cho vào dịch tạo màng khuấy máy khuấy từ Rút ml hỗn dịch để tiến hành xác định mật độ vi sinh vật trước sấy phun Sau tiến hành sấy phun phần cịn lại Trong q trình sấy phun, hỗn dịch vi khuẩn chất tạo màng phải khuấy liên tục để mật độ vi khuẩn phân bố hỗn dịch Dịch sấy phun đưa vào máy sấy phun bơm nhu động với tốc độ bơm 8-10 ml/phút Áp suất khơng khí cố định 0,4 MPa Nhiệt độ khơng khí đầu vào hệ thống thay đổi 100 ± oC ,110 ± oC, 120 ± oC, 130 ± oC, nhiệt độ đầu 65 ± oC Thực cho giá trị nhiệt độ đầu vào khác trình sấy phun - Định lượng tế bào vi khuẩn sau vi bao: để xác định tồn vi khuẩn sản phẩm sấy phun g chế phẩm cho vào ml nước muối NaCl 0,85% Sau pha loãng, dịch pha loãng cấy môi trường thạch MRS ủ 37 oC Sau 24 giờ, tiến hành đếm khuẩn lạc 24 Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L fermentum trước sau sấy phun, độ ẩm chế phẩm, hiệu suất thu hồi bột chế phẩm Nhiệt độ sấy phun đầu vào thích hợp lựa chọn dựa kết tỉ lệ sống sót cao vi khuẩn 3.4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót L fermentum thời gian bảo quản chế phẩm Mục đích: xác định tỉ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm sau 30 ngày bảo quản lạnh (4 ± oC) Tiến hành: chế phẩm tối ưu từ thí nghiệm bảo quản lạnh lạnh (4 ± oC) 30 ngày Chỉ tiêu theo dõi: mật độ vi khuẩn L fermentum g chế phẩm sau 10, 20 30 ngày bảo quản 3.4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả sinh acid lactic chế phẩm Mục đích thí nghiệm so sánh khả sinh acid lactic vi khuẩn L fermentum chế phẩm sau 30 ngày bảo quản bổ sung vào trình lên men ca cao với việc bổ sung sinh khối tươi ca cao lên men tự nhiên Tiến hành thí nghiệm: thí nghiệm tiến hành bình lên men 250 ml với bình chứa khoảng 50 g hạt ca cao Bình lên men 50 g hạt ca cao tươi khơng bổ sung vi khuẩn Bình lên men 50 g hạt ca cao tươi bổ sung dịch vi khuẩn L fermentum với tỉ lệ giống 0,1% khối lượng hạt ca cao (107 cfu/ml) Bình lên men 50 g hạt ca cao tươi bổ sung chế phẩm với tỉ lệ 0,1% khối lượng hạt ca cao (107 cfu/g) uá trình lên men mô theo phương pháp Stoll (2010) - Trích dẫn Nguyễn Minh Hùng (2016), lên men theo thông số nhiệt độ ngày tăng Nhiệt độ 30 oC vào ngày thứ nhất, sau tăng lên 35 oC ngày thứ 2, tiếp tục tăng lên 40 oC ngày thứ trì 50 oC ngày thứ thứ Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng acid lactic ca cao sau ngày lên men 25 3.5 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu Mật độ vi sinh vật xác định dựa phương pháp định lượng vi sinh vật cách đếm khuẩn lạc đĩa Petri (Phụ lục 4) Ẩm độ chế phẩm xác định nhờ máy phân tích ẩm hồng ngoại Hiệu suất thu hồi chế phẩm tính tốn dựa hàm lượng chất khô chế phẩm thu so với hàm lượng chất khô chất vi ban đầu (Phụ lục 3) Các thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại Thơng số tối ưu thí nghiệm yếu tố cố định cho thí nghiệm sau Các số liệu thu thập xử lý vẽ đồ thị phần mền Excel 2010, JMP 10 26 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Xác định vật liệu vi bao thích hợp cho vi khuẩn L fermentum Vật liệu vi bao yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sống sót vi khuẩn sau sấy phun Nó tạo thành lớp màng bao bọc vi sinh vật, làm giảm tác động yếu tố ảnh hưởng trình sấy phun, đảm bảo sức sống vi khuẩn Hai loại chất vi bao sử dụng nghiên cứu tinh bột acetate maltodextrin Kết thí nghiệm trình bày Bảng 6.1.1, Bảng 6.1.2 (Phụ lục 6) thể Hình 4.1 % 70 60 50,34a 50,34a 50 Tỉ lệ sống sót Ẩm độ 40 33,33b Hiệu suất thu hồi 30 20 10,27b 13,23A 7,23a 10 0,96B -10 TB acetate MD Loại chất vi bao Hình 4.1 Tỉ lệ sống sót L fermentum sau sấy phun, ẩm độ, hiệu suất thu hồi chế phẩm sử dụng tinh bột acetate maltodextrin làm chất vi bao (Trong thông số, số có ký tự khác có khác ý nghĩa mặt thống kê, p < 0,05) Khi sử dụng maltodextrin làm vật liệu vi bao, tỉ lệ sống sót L fermentum sau sấy phun 13,23% cao so với tinh bột acetate 0,96% (khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, p < 0,05) Như hiệu vi bao maltodextrin tốt nhiều so 27 với tinh bột acetate Mặc dù tinh bột acetate đánh giá tác nhân vi bao tốt, thích hợp tạo màng bao (Chowdary ctv, 2011) Tuy nhiên, với khả làm giảm nhiệt độ hồ hóa tinh bột tăng tính giữ nước, điều khiến tinh bột acetate khơng thích hợp với phương pháp sấy phun Trong đó, maltodextrin có khả hình thành lớp vỏ với tốc độ nhanh điều coi thuận lợi cho việc gia tăng lưu trữ bảo vệ vi sinh vật bên (Najafi ctv, 2013 - Trích dẫn Anandharamakrishnan, 2015) Đối với chế phẩm sử dụng tinh bột acetate làm chất vi bao có ẩm độ cao (10,27%) so với sử dụng maltodextrin (7,23%) Như vậy, điều kiện sấy phun nhiệt độ đầu vào, áp suất khơng khí, tốc độ bơm, chúng tơi nhận thấy tinh bột acetate có khả giữ nước cao nên tách ẩm diễn chậm hơn, ẩm độ cuối chế phẩm cao, hạt chế phẩm nặng hơn, dễ dàng lưu lại buồng sấy làm giảm hiệu suất thu hồi Điều phù hợp với kết thu được, hiệu suất thu hồi chế phẩm có tinh bột acetate 33,33%, thấp so với chế phẩm có maltodextrin – hiệu suất thu hồi đạt 50,34% Kết xử lý JMP cho thấy, ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm có maltodextrin chế phẩm có tinh bột acetate có khác biệt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Từ kết trên, maltodextrin chọn làm vật liệu vi bao, yếu tố cố định cho thí nghiệm 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất vi bao dung dịch sấy phun đến khả sống sót L fermentum sau sấy phun Dựa vào kết thí nghiệm 1, maltodextrin lựa chọn sử dụng cho thí nghiệm Kết thí nghiệm trình bày Bảng 6.2.1, Bảng 6.2.2 (Phụ lục 6) thể Hình 4.2 28 % Tỉ lệ sống sót 60 Ẩm độ Hiệu suất thu hồi 53,81a 50,46ab 47,87bc 50 43,39c 40 30 20,71A 20 13,12B 10 6,97D6,28b 11,86C 7,11a 6,30b 5,97b 15% 20% Tỉ lệ maltodextrin bổ sung 25% 10% Hình 4.2 Tỉ lệ sống sót L fermentum, ẩm độ, hiệu suất thu hồi chế phẩm thay đổi tỉ lệ maltodextrin bổ sung vào dịch sấy phun (Trong thơng số, số có ký tự khác có khác ý nghĩa mặt thống kê, p < 0,05) Tỉ lệ sống sót L fermentum đạt cao nhất, 20,71% bổ sung 20% maltodextrin Khi tỉ lệ maltodextrin giảm xuống 15% 10% tỉ lệ sống sót giảm 13,12% 6,97% Tuy nhiên, với 25% maltodextrin bổ sung tỉ lệ sống sót lại thấp 15% 20% Cả nghiệm thức có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) Theo Anekella (2011), tăng tỉ lệ maltodextrin, hiệu vi bao tăng nên sống sau sấy phun vi khuẩn tăng Tuy nhiên, tỉ lệ sống sót vi khuẩn giảm bổ sung 25% maltodextrin tỉ lệ maltodextrin đạt mức cao, độ nhớt dịch sấy phun tăng, áp suất khơng khí hệ thống máy sấy phun cung cấp không đủ để tán chúng thành hạt nhỏ Các hạt chế phẩm lớn hơn, thời gian lưu lại buồng sấy lâu hơn, vi khuẩn chịu tác động nhiệt nhiều nên dẫn đến giảm khả sống sót sau q trình sấy Khi tỉ lệ maltodextrin tăng từ 10% đến 25% hiệu suất thu hồi giảm từ 53,81% xuống 43,39% Với tỉ lệ 10% 25%, hiệu suất thu hồi có khác biệt ý nghĩa 29 mặt thống kê (p < 0,05) Nhưng 20% 25% tỉ lệ bổ sung khơng có khác biệt ý nghĩa nhiều mặt thống kê (p < 0,05) Theo Anekella (2011) việc giảm tỉ lệ maltodextrin bổ sung làm tăng hiệu suất thu hồi, nhiên ảnh hưởng đến sống cịn tế bào vi khuẩn hiệu vi bao giảm Kết thí nghiệm điều tương tự Dự kiến ẩm độ chế phẩm tăng với gia tăng tỉ lệ maltodextrin bổ sung Tuy nhiên, bổ sung 25% maltodextrin vào dịch sấy phun giá trị ẩm độ thấp 5,97% Trong với tỉ lệ maltodextrin bổ sung 10% 15% giá trị ẩm độ đạt 6,28% 7,11% Khơng có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) tỉ lệ maltodextrin bổ sung tăng dần từ 15-25% Nhưng ba mức tỉ lệ có khác biệt mặt thống kê tỉ lệ 10% Có thể kết luận tỉ lệ maltodextrin không làm ảnh hưởng đến ẩm độ chế phẩm Sự tương quan tỉ lệ maltodextrin bổ sung với ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm tương tự với kết nghiên cứu Anekella vào năm 2011 Vậy, 20% chọn làm tỉ lệ bổ sung maltodextrin thích hợp cho vi bao L fermentum phương pháp sấy phun Đây yếu tố cố định cho thí nghiệm 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đầu vào đến sống sót L fermentum sau sấy phun Nhiệt độ sấy phun đầu vào yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến khả sống sót vi khuẩn sau q trình sấy phun Kết thí nghiệm trình bày Bảng 6.3.1, Bảng 6.3.2 (Phụ lục 6) thể Hình 4.3 30 Tỉ lệ sống sót % 60 50 Hiệu suất thu hồi 48,03a 47,17a 44,92b 42,56c Ẩm độ 40 30 25,76A 22,30B 20,54C 20 10 7,22a 6,84b 6,07c 18,71D 5,88c 100 110 120 Nhiệt độ sấy đầu vào (oC) 130 Hình 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào khả sống sót L fermentum sau sấy phun, ẩm độ hiệu suất thu hồi chế phẩm (Trong thông số, số có ký tự khác có khác ý nghĩa mặt thống kê, p < 0,05) Qua Hình 4.3, cho thấy nhiệt độ đầu vào có ảnh hưởng đến khả sống sót L fermentum Tại 100 oC tỉ lệ sống sót vi khuẩn sau sấy đạt cao 25,76% giảm 18,71% 130 oC Khi tăng nhiệt độ đầu vào, nhiệt độ đầu trình sấy tăng theo, hai yếu tố tác động mạnh mẽ đến sống vi khuẩn sau sấy phun Nhiệt độ cao, sức sống vi khuẩn giảm Tuy nhiên, nhiệt độ đầu máy sấy phun khó dự đốn, kiểm sốt số điều kiện hoạt động định Đồng thời, gia tăng nhiệt độ đầu vào tỉ lệ nghịch với ẩm độ chế phẩm tỉ lệ thuận với hiệu suất thu hồi chế phẩm Khi nhiệt độ sấy đầu vào đạt 130 oC ẩm độ chế phẩm thấp 5,88% Trong 100 oC ẩm độ chế phẩm 7,22% Hàm lượng ẩm cuối chế phẩm giảm đáng kể nhiệt độ đầu máy sấy phun tăng theo dự kiến (Ananta ctv, 2005) Tuy nhiên, nghiên cứu này, tỉ lệ sống sót L fermentum sau trình sấy phun ưu tiên hết nên 100 oC nhiệt độ sấy đầu vào chọn Bên cạnh đó, nhiệt độ sấy thấp hạn chế tác 31 động nhiệt độ cao đến sức sống vi khuẩn, tăng tỉ lệ sống song q trình bảo quản sau 4.4 Thí nghiệm 4: Sự sống sót L fermentum thời gian bảo quản chế phẩm Sự sống sót vi khuẩn chế phẩm sau q trình sấy phun khơng thiết phải tương quan đảm bảo sống sót trình bảo quản chế phẩm Việc kết hợp điều kiện tối ưu cần thiết để đảm bảo sống cịn q trình sấy q trình bảo quản (Ying ctv, 2010a) Tuy khơng phải tiêu chí sống sót tế bào tiêu chí xem xét đánh giá việc lưu trữ loại chế phẩm vi sinh Khả sống sót L fermentum chế phẩm đánh giá nghiên cứu 30 ngày bảo quản lạnh (4 ± 1oC) thể Hình 4.4 7,5 log cfu/g 6,5 5,5 10 20 30 Thời gian (ngày) Hình 4.4 Mật độ vi khuẩn L fermentum chế phẩm sau 30 ngày bảo quản lạnh Sau 30 ngày bảo quản lạnh tỉ lệ sống sót tế bào vi khuẩn 76,71% Mặc dù từ ngày đến ngày 10 có giảm mạnh tỉ lệ sống sót tế bào vi khuẩn (17,12%), nhiên từ ngày 10 đến ngày 30 tốc độ giảm chậm lại Điều trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác động yếu tố nhiệt độ, áp suất làm ảnh hưởng đến sức sống nhiều tế bào Sau chế phẩm chuyển vào môi trường lạnh, chưa kịp thích ứng nên tế bào vi khuẩn yếu chết nhanh chóng Tuy nhiên, sau thích nghi, tỉ lệ chết vi khuẩn chậm lại ổn định 32 4.5 Thí nghiệm 5: Thử nghiệm khả sinh acid lactic chế phẩm Chế phẩm sau thời gian bảo quản cần xác định xem hoạt tính có cịn tốt vi khuẩn ban đầu hay không Đặc biệt ảnh hưởng chế phẩm ca cao lên men, nhằm định hướng lâu dài việc thay việc bổ sung giống khởi động sinh khối tươi chế phẩm Vai trò vi khuẩn lactic trình lên men ca cao tạo acid lactic thúc đẩy phản ứng sinh hóa Bên cạnh đó, L fermentum vi khuẩn lên men dị hình, acid lactic sản phẩm tạo thành lên men cịn có acid acetic ethanol tạo điều kiện cho vi khuẩn acetic phát triển tiếp tục Bảng 4.1 Kết hàm lượng acid lactic sau ngày lên men ca cao Nghiệm thức Hàm lượng acid lactic (%) ĐC SK CP 0,60b ± 0,03 0,69a ± 0,03 0,68a ± 0,05 Trong hàng, số có ký tự khơng có khác ý nghĩa mặt thống kê, (p