Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen ở nấm sợi aspergillus bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Quá trình sinh sản hữu tính ở một số loài với sự tham gia của giao tử đực và giao tử cái trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân, dung hợp tế bào chất và quá trình giảm phân để hình thàn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trưởng Phòng

Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em cũng xin chân thành cảm ơn TS Trần Đức Long đã nhiệt tình góp ý, cố vấn cho em trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp

Em cũng vô cùng biết ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ em trong quá trình học tập

Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ

sở vật chất và môi trường làm việc để em có thể hoàn thành tốt nghiên cứu của mình Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới học viên cao học Đỗ Thị Bình Xuân Lộc

đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện các thí nghiệm

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các em, các anh chị Phòng Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017

Học viên

Trần Thị Phương

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

5-FOA 5 - fluoroorotic acid

A awamori Aspergillus awamori

A nidulans Aspergillus nidulans

A niger Aspergillus niger

A oryzae Aspergillus oryzae

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (biến

nạp trung gian/nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens)

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

GRAS Generally Recognized As Safe (được công nhận là an toàn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

IM Induction medium (môi trường cảm ứng)

LB Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trường LB)

NST Nhiễm sắc thể

OD Optical Density (mật độ quang)

ORF Open reading frame (khung đọc mở)

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

PSM Phytase-screening medium (môi trường sàng lọc sinh phytase)

RB Right border (biên phải)

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u)

Vir Virulence region (vùng độc lực)

WT Wild-type (chủng tự nhiên)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nấm sợi 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Vai trò của nấm sợi 5

1.1.3 Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus 5

1.2 Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae 6

1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A oryzae 6

1.2.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae 8

1.2.3 Vai trò của nấm sợi A oryzae 8

1.3 Giới thiệu chung về A niger 10

1.3.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A niger 10

1.3.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A niger 12

1.3.3 Vai trò của nấm sợi A niger 12

1.4 Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi 14

1.4.1 Chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 14

1.4.2 Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) 15

1.4.3 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15

1.5 Hệ thống marker dùng cho chuyển gen ở nấm sợi 25

1.5.1 Hệ thống marker chọn lọc các thể chuyển gen 25

1.5.2 Hệ thống marker chỉ thị dùng trong chuyển gen 28

1.6 Promoter biểu hiện gen ở nấm sợi 30

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 Nguyên liệu 33

2.1.1 Chủng vi sinh vật 33

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 34

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.1 Thu bào tử nấm 39

2.2.2 Tách chiết DNAtổng số 39

2.2.3 Thành phần của các phản ứng PCR 40

2.2.4 Xử lý enzyme giới hạn 41

2.2.5 Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen 43

2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens 44

2.2.7 Sàng lọc các thể chuyển gen 46

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen 48

3.1.1 Chủng nấm A niger N402được lựa chọn để xóa gen 48

3.1.2 Đặc điểm hình thái của chủng nấm A oryzae VS1 và RIB40 trợ dưỡng uridine/uracil 49

3.2 Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dưỡng uridine/uracil 50

3.2.1 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG 51

3.2.2 Xóa thành công gen pyrG ở A niger N402 52

3.3 Tối ưu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dưỡng uridine/uracil 58

3.3.1 Tạo vector pEX2A 58

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ uridine/ uracil đến sự phục hồi sinh trưởng của chủng xóa gen pyrG 59

3.3.3 Tối ưu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dưỡng uridine/uracil 61

3.3.4 Đánh giá hiệu quả chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A niger N402 trợ dưỡng 64

3.4 Biểu hiện gen DsRed ở A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A 65

3.4.1 Mức độ tương đồng của gen pyrG ở chi Aspergillus 65

3.4.2 Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi A oryzae 66

3.5 Biểu hiện gen huỳnh quang DsRed dưới sự kiểm soát của promoter glaA từ A niger 72

3.5.1 Tạo vector pEX2C 72

3.5.2 Biểu hiện gen DsRed dưới sự kiểm soát của promoter glaA thông qua vector pEX2C 73

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

Kết luận 79

Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật và các vector dùng trong nghiên cứu 33 Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái của một số loài nấm mốc trên đĩa petri 3

Hình 1.2 Hình thái và cấu trúc hiển vi của A oryzae 7

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc hiển vi của nấm A niger 11

Hình 1.5 Mô hình vi khuẩn A tumefaciens với hệ thống vector nhị thể 20

Hình 1.6 Biểu hiện gen huỳnh quang GFP ở nấm sợi A oryzae 29

Hình 1.7 Biểu hiện gen DsRed ở chủng nấm sợi A oryzae AUT1-PlD 30

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm A niger 47

Hình 3.2 Hình thái và cấu trúc hiển vi của 2 chủng A oryzae VS1 và

Hình 3.6 Kết quả xóa gen trên môi trường chọn lọc CD bổ sung 0,1%

uridine, 0,1% uracil và 0,2% 5-FOA

53

Hình 3.7 Kiểm tra khả năng sinh trưởng của chủng đột biến trên các môi

trường khác nhau

54

Hình 3.8 Xác nhận các chủng xóa gen pyrG 55

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ uridine/uracil đến khả năng sinh

trưởng của chủng đột biến xóa gen pyrG

Hình 3.14 Sự tương đồng của pyrG giữa các loài Aspergillus khác nhau 65

Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil 66

Hình 3.16 Kết quả chuyển gen DsRed vào A oryzae chủng RIB40 và VS1

Hình 3.20 Kết quả PCR kiểm tra 4 khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector

pEX2C theo thứ tự Ag1, Ag2, Ag3, Ag4

73

Hình 3.21 Kết quả chuyển gen DsRed sử dụng vector pEX2C vào A niger

MỞ ĐẦU

Aspergillus là chi nấm sợi phổ biến trong tự nhiên và có vai trò quan trọng

trong sản xuất thực tiễn Một số loài nấm thuộc chi này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (Generally Regarded as

Safe, GRAS) dùng trong sản xuất công nghiệp như A oryzae, A niger, A awamori,

A sojae, … Trong đó, hai loài A niger và A oryzae với khả năng tiết mạnh enzyme

vào môi trường nuôi cấy nên đã được sử dụng như nhà máy tế bào để sản xuất nhiều

loại enzyme thương mại cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp Gần đây, hệ gen của A niger và A oryzae đã được giải trình tự hoàn toàn và là tiền đề cho cải biến di

truyền nâng cao hiệu suất biểu hiện các gen mong muốn ở hai loài nấm này

Hiện nay, hai phương pháp chuyển gen phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen

thông qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần là khá phức tạp với chi phí

cao và hiệu quả không ổn định ở những lần lặp lại Phương pháp chuyển gen nhờ vi

khuẩn A tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,

ATMT) lần đầu tiên được áp dụng thành công cho nấm sợi vào năm 1998 với nhiều

ưu điểm như dễ thực hiện, chi phí thấp và hiệu suất ổn định Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen ATMT vẫn chủ yếu sử dụng các gen kháng kháng sinh nên khó áp dụng vào điều kiện sản xuất thực tế vì nguy cơ phát tán gen kháng thuốc vào môi trường Chính vì vậy, phát triển hệ thống chuyển gen sử dụng gen trợ dưỡng (marker trợ dưỡng) là hướng tiếp cận an toàn, hiệu quả về chi phí và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn

Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cao cho nấm sợi

Aspergillus sử dụng vi khuẩn A tumefaciens và marker trợ dưỡng, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gene ở nấm

sợi Aspergillus bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” với những nội dung

chính như sau:

- Tạo chủng A niger đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG

- Tạo một số vector nhị thể dùng để chuyển gen và biểu hiện gen ở cả hai loài

nấm sợi A niger và A oryzae

- Xây dựng quy trình chuyển gen tối ƣu cho nấm sợi A niger sử dụng chủng trợ dƣỡng uridine/uracil và marker trợ dƣỡng pyrG

- Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng gen chỉ thị huỳnh quang đỏ

DsRed

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm sợi

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Nấm sợi (nấm mốc) là những vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng tiết enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ có trong môi trường Chúng phân bố rộng khắp trên trái đất và đóng vai trò quan trọng trong

tự nhiên cũng như trong đời sống của con người Nấm thường sinh trưởng trên các

bề mặt cơ chất tạo thành các dạng sợi như lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông được

gọi là hệ sợi [23]

Hình 1.1 Hình thái của một số loài nấm mốc điển hình (A) Aspergillus fumigatus

(B) Penicillium rubens (C) Trichoderma sparsum (D) Aspergillus flavus (E)

Aspergillus oryzae (F) Aspergillus niger [41, 42, 45, 92, 100]

Từ một bào tử nảy mầm, sợi nấm sẽ phát triển và phân nhánh hình thành nên khuẩn lạc nấm Sợi nấm kéo dài theo hình thức sinh trưởng ở đỉnh sợi và phân nhánh liên tục để tạo nên hệ sợi nấm (mycelium) xù xì như bông Hệ sợi nấm cũng

có thể phát triển từ một đoạn sợi nấm sinh dưỡng Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt Tuy nhiên, ở một số loài, hệ sợi nấm tích lũy sắc tố khiến chúng có màu sắc đặc trưng hoặc hệ sợi tiết ra sắc tố làm đổi màu khu vực nấm phát triển Một số loài

có hiện tượng tiết ra các hợp chất hữu cơ tạo nên những tinh thể trên bề mặt hệ sợi

[3] Sợi nấm có cấu tạo đa bào, hình ống, được bao phủ bởi một lớp thành cứng, bên trong chứa nguyên sinh chất có khả năng di chuyển Chiều dài của sợi nấm thường không xác định, nhưng đường kính ống sợi tương đối ổn định từ 2µm - 30µm, tùy thuộc vào loài và điều kiện sinh trưởng Trên đĩa petri, hệ sợi nấm lan tỏa ra xung quanh, phủ trên bề mặt thạch với tốc độ ổn định tạo nên các khuẩn lạc nấm dạng tròn, đồng thời ăn sâu vào trong cơ chất [35]

Phần lớn nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên,

ở một số loài, ánh sáng lại là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành bào tử Nấm sợi có khoảng giới hạn nhiệt độ tương đối rộng Giới hạn dưới của một số loài nấm sợi là từ 2oC - 5oC, giới hạn trên là từ 47oC - 53oC Một số loài nấm có thể sống sót dưới điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt ở 0oC và 60oC Khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm sợi là từ 22oC - 37oC Nhìn chung, các loài nấm sợi có thể phát triển trong môi trường axit Một số loài phát triển tốt ở môi trường pH nhỏ hơn

3, một số ít loài phát triển được ở điều kiện pH lớn hơn 9, nhưng hầu hết các loài nấm sợi phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 5 - 6,5 Vì là nhóm sinh vật hiếu khí bắt buộc nên ôxi là yếu tố không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm sợi [23, 35]

Nấm sợi có hai hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Sinh sản vô tính bao gồm sinh sản sinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm và sinh sản bằng hình thành bào tử đính (conidia) Quá trình sinh sản hữu tính ở một số loài với sự tham gia của giao tử đực và giao tử cái trải qua ba giai đoạn gồm dung hợp nhân, dung hợp tế bào chất và quá trình giảm phân để hình thành bào tử đơn bội [3, 35] Ngoài ra, ở một số loài nấm sợi còn có hình thức sinh sản cận hữu tính (parasexual) Năm 1956, hình thức sinh sản này lần đầu tiên được mô tả bởi nhà di truyền học

người Ý Guido Pontecorvo trong các nghiên cứu về Aspergillus nidulans Chu trình

sinh sản cận hữu tính này được bắt đầu khi một nhân đơn bội dung hợp vào tế bào sinh dưỡng của hệ sợi sau đó tiếp tục phân chia Trong chu trình sinh sản cận hữu tính có thể xảy ra trao đổi chéo giữa các vùng tương đồng trên nhiễm sắc thể (NST)

Đặc điểm này được sử dụng để lập bản đồ gen hoặc gắn thêm những gen mới vào trong các nhóm gen liên kết của loài [18]

1.1.2 Vai trò của nấm sợi

Nấm sợi có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên và đời sống của con người Nhờ khả năng sinh trưởng tốt trên cả những môi trường nghèo dinh dưỡng và khả năng tổng hợp những hợp chất hữu cơ quan trọng, nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng sản xuất công nghiệp Các sản phẩm tạo ra từ nấm sợi vô cùng phong phú, từ axit hữu cơ đến các enzyme hay các chất chuyển hóa phức tạp được ứng dụng nhiều mặt trong cuộc sống Nấm sợi được coi là các nhà máy tế bào lý tưởng cho ngành công nhiệp sản xuất enzyme Khoảng 40% enzyme thương mại trên thị trường có nguồn gốc từ nấm sợi Chúng đóng vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp then chốt như công nghiệp thực phẩm, đồ uống, y dược, may mặc, thức ăn chăn nuôi [10, 15] Phần lớn các enzyme này được sản xuất

từ các loài thuộc chi Aspergillus và Trichoderma bởi chúng có khả năng tiết một

lượng lớn enzyme, protein vào môi trường Nhiều loài nấm mốc đã được công nhận

là an toàn tiêu biểu như A oryzae, A niger, A awamori, A sojae [9, 15, 34] Ngoài

các enzyme, nấm sợi còn được dùng làm nhà máy sản xuất các axit hữu cơ Các axit hữu cơ chủ yếu được sinh tổng hợp bởi nấm sợi là axit citric, axit gluconic, axit itaconic với sản lượng hàng nghìn tấn mỗi năm Các axit này được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, đồ uống, dệt may và y dược [15] Trong các hệ sinh thái, nấm sợi giúp phân hủy các hợp chất hữu cơ và không thể thiếu trong các chu trình chuyển hóa vật chất Ngoài ra, nấm còn được sử dụng làm sinh vật mô hình trong di truyền học, hóa sinh học và nhiều lĩnh vực khác Bên cạnh đó, cũng có

một số loài nấm gây hại như Aspergillus fumigatus gây bệnh cơ hội ở người, Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin, hay một số loại nấm sợi gây hỏng rau quả

sau thu hoạch và gây bệnh cây trồng [14]

1.1.3 Giới thiệu chung về chi nấm sợi Aspergillus

Aspergillus là một chi nấm sợi phổ biến phân bố trên toàn cầu Hiện Aspergillus có khoảng trên 250 loài với các đại diện tiêu biểu như A niger, A

oryzae, A nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus…[30] Các loài trong chi Aspergillus có mức độ tương đồng cao về hình thái nên khó để phân biệt một

cách chính xác và đều có khả năng sinh sản vô tính bằng hình thành bào tử Bào tử

Aspergillus nhẹ, xốp có khả năng phát tán dễ dàng trong không khí Khi gặp bề mặt

chất rắn hoặc lỏng, chúng được giữ lại và sẽ nảy mầm khi gặp điều kiện phù hợp Chính khả năng này khiến chúng phân bố rộng khắp trên thế giới [14] Hai đại diện

tiêu biểu của chi Aspergillus là A oryzae và A niger A oryzae được sử dụng rộng

rãi trong công nghiệp sản xuất tương, soyu, rượu sake ở các nước Châu Á, đặc biệt

là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Philippine và Việt Nam A niger được sử

dụng phổ biến trong sản xuất axit citric phục vụ cho các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, đồ uống, y dược, dệt may với sản lượng 1,6 triệu tấn mỗi năm Bên

cạnh đó, A oryzae và A niger cũng được sử dụng để khai thác enzyme protease,

amylase, phytase và một số sản phẩm chuyển hóa thứ cấp quan trọng khác [14, 15]

Các loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus rất phù hợp cho các nghiên cứu về kiểm soát

biểu hiện gen và quá trình tiết protein ở tế bào sinh vật nhân thực do có thể dễ dàng phân lập và tạo ra các chủng đột biến [16]

1.2 Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae

1.2.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A oryzae

Aspergillus oryzae hay còn có tên gọi khác là nấm Koji Đây là loài nấm phổ biến của chi Aspergillus được sử dụng lâu đời trong ngành công nghiệp lên men ở các nước châu Á tiêu biểu là Nhật và Trung Quốc Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus trong họ Trichocomaceae A oryzae khi nuôi cấy

trên môi trường thạch có dạng hệ sợi, màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh Hệ sợi phát triển mạnh, bao gồm những sợi mỏng, trong suốt, đường kính 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều Từ những sợi nằm ngang này hình thành nên những sợi khí sinh mang cuống sinh bào tử (cơ quan sinh sản vô tính)

Cuống sinh bào tử của A oryzae thường dài từ 1 - 2 mm, phía đầu cuống sinh bào

tử phình lên gọi là thể bình, từ thể bình này mọc lên những tế bào nhỏ, thuôn dài

được gọi là tế bào hình chai Đầu các tế bào chai này phân chia thành những bào tử

đính (conidia) Bào tử của A oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau tạo

thành màu đặc trưng của khuẩn lạc [43, 62] Hình thái và cấu trúc khuẩn lạc của nấm

mốc A oryzae được mô tả chi tiết ở Hình 1.2

Hình 1.2 Hình thái và cấu trúc hiển vi của A oryzae [41]

(A, B) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa CYEA, MEA (C) Cuống sinh bào tử

(D, E) Hình thái và cấu trúc hiển vi của cuống sinh bào tử (F) Bào tử A oryzae

A oryzae phân bố rộng khắp trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nhiệt

đới Vì là sinh vật hiếu khí bắt buộc nên A oryzae thường được tìm thấy ở những

nơi giàu ôxi, trên bề mặt nhiều loại cơ chất cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho

chúng Chúng có thể sinh trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất như

mảnh vụn thực vật, lá cây, gỗ mục, các loại hạt… Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng,

phát triển của A oryzae là 30oC - 40oC [49]

1.2.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae

Hệ gen đầy đủ của chủng quốc tế A oryzae RIB40 được công bố năm 2005,

gồm 8 nhiễm sắc thể (NST) và hệ gen ty thể, kích thước ước tính đạt 37,6 Mbp với khoảng 1207 gen, lớn hơn 25% - 30% so với hệ gen của một số loài thuộc cùng chi

Aspergillus So với loài chuẩn dùng trong nghiên cứu phòng thí nghiệm là A nidulans và loài gây bệnh cơ hội ở người A fumigatus thì hệ gen của A oryzae lớn

hơn lần lượt là 29% - 34% [63] Việc mở rộng kích thước hệ gen cũng diễn ra ở các

loài có quan hệ gần gũi với A oryzae là A niger và A flavus, đặc biệt là A flavus

có hệ gen tương đồng với A oryzae đến 99,5% Hệ gen của A oryzae lớn hơn là do

thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa [62, 87] Theo các nghiên cứu gần đây,

các loài A oryzae, A fumigatus và A nidulans chứa lần lượt 135, 99, 90 gen mã

hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% hệ gen (genome) Tất cả những gen mã hóa

cho protease có mặt trong hai loài A fumigatus và A nudilans đều có mặt trong A oryzae nhưng có những gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có mặt ở A oryzae mà không tồn tại ở hai loài còn lại Ngoài ra, A oryzae cũng sở hữu một số gen mã hóa

cho các protease có khả năng hoạt động trong môi trường axit mà theo dự đoán chúng có thể được hình thành trong quá trình thuần hóa của con người [62]

1.2.3 Vai trò của nấm sợi A oryzae

A oryzae được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc

biệt là công nghiệp thực phẩm lên men Ngay từ thời cổ xưa, các quốc gia châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản đã sử dụng chúng để tạo nên các sản phẩm lên men nổi

tiếng như nước tương, miso, soyu, rượu sake và nhiều sản phẩm khác [50, 104] A oryzae được sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm là do đặc tính sinh

trưởng nhanh, tiết lượng lớn enzyme thủy phân như amylase, glucoamylase, protease, … trong quá trình sinh trưởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho sản phẩm

Một ứng dụng đặc biệt của A oryzae trong công nghệ lên men truyền thống ở Nhật

là công nghệ lên men cơ chất rắn (gạo, đậu tương và cám gạo) tạo điều kiện cho sự

phát triển hiếu khí của A oryzae Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi

trường rắn giúp tăng khả năng tiết enzyme và các chất chuyển hóa mà thường sẽ không xảy ra trong quá trình lên men lỏng [50, 63] Ở Việt Nam, kỹ thuật làm tương

đã được hình thành từ xa xưa và cho đến ngày nay vẫn được sử dụng ở rất nhiều nơi đặc biệt là các tỉnh miền Bắc Phương pháp lên men truyền thống sử dụng nấm mốc

A oryzae được đánh giá là an toàn hơn so với phương pháp lên men sử dụng hóa

chất phân giải sinh ra nhiều độc tố đặc biệt là 3-MCPD diol) [5] Tuy nhiên, phương pháp lên men truyền thống cũng có mặt hạn chế do quá trình phơi mốc tự nhiên có thể không đảm bảo an toàn Trong quá trình phơi

(3-monochoropropane-1,2-mốc, ngoài chủng mốc an toàn là A oryzae thì các nguyên liệu có khả năng bị nhiễm mốc A flavus sinh độc tố aflatoxin - một trong những chất gây ung thư gan hàng đầu Hình thái của A flavus gần như giống hệt với A oryzae nên rất khó có

thể để phân biệt hai loài này trong tự nhiên Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại

diện cho hai loài, nhận thấy hệ gen của hai chủng A oryzae RIB40 và A flavus NRRL3357 có độ tương đồng 99,5% DNA và 98% protein [87] Nấm sợi A oryzae khác với A flavus ở việc mất khả năng sinh độc tố aflatoxin do trong quá trình tiến

hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan

đến sinh tổng hợp aflatoxin [20]

Không chỉ được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, A oryzae còn được

sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất enzyme, và các sản phẩm

chuyển hóa thứ cấp Các loại enzyme được sản xuất từ A oryzae như glucoamylase,

α-amylase và một số protease với giá trị kinh tế cao được sử dụng trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo và đồ uống [98] Đây cũng là loài cung cấp enzyme protease sản lượng lớn phục vụ cho các ngành công nghiệp thực phẩm và sản xuất các chất tẩy rửa [8]

Hiện nay, những hiểu biết về hệ gen của A oryzae cùng với sự phát triển

vượt bậc của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật di truyền, đã cho phép chúng ta nghiên cứu chi tiết vai trò của các gen và biểu hiện chúng một cách chủ động trong loài nấm sợi an toàn này

1.3 Giới thiệu chung về A niger

1.3.1 Phân loại và đặc điểm sinh học nấm sợi A niger

Năm 1867 nấm sợi A niger lần đầu tiên được phân lập bởi nhà thực vật học người Pháp Philippe Edouard Léon van Tieghem A niger thuộc phân nhóm Nigri (còn gọi là phân nhóm Aspergillus đen) của chi Aspergillus, họ Trichocomaceae Đây là loài điển hình và phổ biến nhất của chi Aspergillus phân bố rộng khắp các

vùng địa lý trên thế giới [30] Nấm phát triển nhanh, chịu nhiệt, chịu lạnh tốt nên có thể bắt gặp ở bất cứ nơi đâu, từ trong đất, nước, không khí, mảnh vụn thực vật, hoa quả thối rữa đến cả trên tường nhà [93] Dưới kính hiển vi có thể quan sát thấy sợi nấm trong suốt, có vách ngăn, phân nhánh liên tục, đường kính hệ sợi 2,5 - 8µm Cuống sinh bào tử dài 300 - 400µm, đường kính 40 - 70µm, không màu, một đầu gắn với bọng hình cầu có màu sẫm hơn Bọng cầu được bao phủ bởi thể bình sơ cấp

có màu trong suốt tới nâu, có vách ngăn Trên tầng thể bình sơ cấp là thể bình thứ cấp, đính bào tử hình cầu có gai nhọn với đường kính 3,5 - 5µm Sợi nấm mới phát triển có màu trắng, sau đó được bao phủ bởi bào tử có màu nâu hoặc đen tạo nên

màu sắc đặc trưng [23, 67] Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A niger được mô tả chi tiết trong Hình 1.3

Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc hiển vi của nấm A niger [45, 53]

(A) Hình thái khuẩn lạc trên đĩa môi trường Czapek-Dox, (B) Rìa ngoài khuẩn lạc, (C) Trung tâm khuẩn lạc, (D) Hình thái hiển vi của cuống sinh bào tử

(E) Bào tử của nấm sợi A niger Nấm sợi A niger sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ từ 28oC - 37oC, nhưng nó có khả năng chịu lạnh xuống tới 6oC và sống sót ở nhiệt độ lên đến 47oC Trong

khoảng nhiệt độ tối ưu, các bào tử của A niger dễ dàng nảy mầm và phát triển

mạnh Ở 30oC, bào tử trương nở, kết hợp với các vật liệu thành tế bào trên toàn bộ

bề mặt tập trung về một cực để hình thành nên đỉnh sợi nấm Sợi nấm tăng sinh ở đỉnh sợi, phát triển chiều dài rồi phân nhánh tạo ra các sợi nhỏ hơn Các sợi nhỏ lại tiếp tục phân nhánh để tạo nên mạng hệ sợi lan trên khắp bề mặt cơ chất Ở điều kiện bất lợi (> 40oC) các bào tử không nảy mầm mà trương nở tích nước, đồng thời tập trung các vật liệu thành tế bào trên khắp bề mặt tạo nên một lớp thành vững

chắc để bảo vệ bào tử khỏi điều kiện bất lợi bên ngoài Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử này sẽ nảy chồi và trực tiếp phát triển thành hệ sợi nấm Đặc điểm này giúp

cho bào tử của A niger được bảo vệ lâu dài dưới điều kiện khắc nghiệt [23]

Ngoài khả năng chịu lạnh, chịu nóng tốt, A niger còn có giới hạn pH rất

rộng từ 1,5 - 9,8 Điều này cho phép chúng sinh trưởng tốt ở cả môi trường có độ axit thấp dưới mức chuẩn của nhiều loài pH tối ưu cho loài nấm này phát triển là

khoảng 4 - 6,5 Độ ẩm tối thiểu cần thiết cho sinh trưởng của A niger là 23% Nấm mốc A niger không cần ánh sáng cho sự sinh trưởng và phát triển [23]

1.3.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A niger

Kích thước hệ gen của các chủng A niger dao động trong khoảng 33,9 đến

38,5 Mb với khoảng 13000 gen, trong đó 6000 - 8000 gen hoạt động [24] Năm

2007, trình tự hệ gen của A niger chủng CBS 513.88 đã được công bố Theo đó,

kích thước hệ gen của CBS 513.88 là 33,9 Mb, với 14165 khung đọc mở trong đó

có 55% gen tham gia mã hóa cho các sản phẩm protein Trong số 14165 khung đọc

mở có 3002 trình tự mã hóa cho các sản phẩm liên quan đến chuyển hóa Dữ liệu

này cho thấy A niger là một nhà máy đầy tiềm năng cho các ngành công nghiệp

sinh học [82]

1.3.3 Vai trò của nấm sợi A niger

Nấm sợi A niger giữ vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm,

đặc biệt là công nghệ lên men [23] Nó được đánh giá là vi sinh vật tiềm năng trong sản xuất amylase Amylase là một enzyme phổ biến chiếm 25 - 35% lượng enzyme thương mại trên thị trường được sử dụng cho quá trình thủy phân tinh bột trong sản xuất bánh mì, bia và trong việc loại bỏ keo từ vải Có nhiều nguồn cung cấp enzyme này như động vật, thực vật và vi sinh vật nhưng amylase có nguồn gốc từ nấm được ưa chuộng hơn cả do có khả năng hoạt động ở môi trường pH thấp Ngoài ra,

A niger còn có khả năng sản xuất invertase xúc tác sự thủy phân của sucrose tạo

thành glucose và fructose, pectinase được ứng dụng trong tiền xử lý các loại nước

ép trái cây để loại bỏ cặn cũng như làm giảm vẩn đục trong rượu vang,

α-galactosidase chống đầy hơi khó tiêu có trong thành phần thuốc dạ dày Các enzyme

protease có nguồn gốc từ nấm A niger được sử dụng để sản xuất các phụ gia

Clarity-FERM sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất bia để giảm hàm lượng gluten lúa mạch, sử dụng trong rã đông thịt và giảm độ đàn hồi của các protein

gluten trong bánh mì [84] Cellulase sản xuất bởi A niger được sử dụng trong công

nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh [6] Một enzyme khác có vai trò quan trọng trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi được sản xuất thương mại bởi nấm mốc

A niger là enzyme phytase Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic

(phytate) ở dạng khó tiêu có mặt trong ngũ cốc và hạt chứa dầu thành dạng photpho

vô cơ có thể sử dụng được Bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi có thể giúp vật nuôi dạ dày đơn dễ dàng hấp thụ phospho đồng thời làm giảm sự bài tiết phytate qua phân, từ đó hạn chế được ô nhiễm môi trường Phytase còn giúp giải phóng canxi và các nguyên tố vi lượng khác, giảm lượng phospho vô cơ sử dụng; do đó giảm chi phí thức ăn cho vật nuôi [1, 102]

Ngoài khả năng tiết ra một phổ rộng các loại enzyme công nghiệp, A niger còn được coi là một nhà máy tế bào chuyên sản xuất các loại axit hữu cơ A niger

lần đầu tiên trở thành sinh vật sản xuất axit citric năm 1919 Axit citric là chất phụ gia giúp tăng hương vị, giảm độ ngọt của các sản phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát Sắt citrate được sử dụng làm chất bảo quản máu trong công nghiệp dược phẩm Ngoài ra, axit citric còn được dùng trong thuốc tẩy, thuộc

da, mạ điện và nhiều ứng dụng khác Axit citric được sản xuất quy mô công nghiệp

chủ yếu nhờ sự lên men của các loài Aspergillus đặc biệt là A niger và A wentiti

do chúng tạo ra lượng lớn axit citric và rất ít tạo ra sản phẩm phụ không mong muốn Năm 2000, sản lượng axit citric toàn cầu đạt 900000 tấn Đến năm 2007, sản

lượng axit citric toàn cầu ước đạt 1,6 triệu tấn và được sản xuất chủ yếu bởi A niger Một axit hữu cơ khác cũng được sản xuất thương mại bởi nấm A niger là axit

gluconic Sản lượng axit gluconic ước tính toàn cầu hằng năm từ 50000 đến 100000 tấn, được sử dụng như một phụ gia thực phẩm [14, 88]

1.4 Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi

Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hoặc nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực vật, nấm, động vật nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất lượng sản phẩm Chuyển gen vào nấm sợi đã được thực hiện từ những năm cuối thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90 [22, 26, 66] Có nhiều phương pháp chuyển gen vào nấm sợi Các phương pháp này được chia thành hai loại: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp bao gồm chuyển gen bằng xung điện và chuyển gen bằng tế bào trần nhờ CaCl2/PEG, chuyển gen bằng súng bắn gen… Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có

thể thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

(ATMT) và đã thu được nhiều thành tựu quan trọng

1.4.1 Chuyển gen bằng xung điện (electroporation)

Chuyển gen bằng xung điện là một phương pháp cơ học đưa trực tiếp phân tử DNA vào trong tế bào vật chủ qua màng tế bào Cơ chế của phương pháp này là tạo

ra một xung điện cao thế trong khoảng thời gian ngắn (vài phần nghìn giây) để làm rối loạn cấu trúc lớp màng phospholipid kép, tạo ra lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai xâm nhập vào bên trong tế bào Cơ sở của phương pháp này

là tính thẩm thấu thuận nghịch của màng tế bào Khi có xung điện, các thụ thể trên màng tế bào tạm thời mất đi khả năng phục hồi, dẫn đến hình thành các lỗ thuận nghịch tức thời trên màng tế bào với kích thước đủ lớn cho phép các phân tử DNA, protein, phức hợp DNA-protein đi qua [39, 90] Chuyển gen bằng xung điện gồm ba pha Pha thứ nhất là tạo ra các lỗ trên màng, diễn ra trong vòng vài micro giây Pha thứ hai là sự mở rộng kích thước lỗ màng xảy ra trong vài trăm micro giây đến vài mili giây Pha cuối cùng là sự đóng lại của các lỗ màng, diễn ra trong vòng vài phút

sau khi kết thúc xung điện [47] Năm 1989, phương pháp xung điện lần đầu tiên được áp dụng vào nấm Bào tử nấm nảy chồi sau khi được xử lý với enzyme tạo tế bào trần sẽ được trộn chung với DNA, đưa vào máy xung điện để chuyển DNA vào trong tế bào nấm Phương pháp này mới chỉ áp dụng thành công với một số loài

nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình chuyển gen [19] 1.4.2 Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)

Phương pháp chuyển gen thông qua tế bào trần là phương pháp đưa trực tiếp đoạn DNA hoặc vector vào tế bào nấm hoặc thực vật đã được xử lý enzyme loại bỏ thành tế bào Quy trình của phương pháp gồm bốn bước cơ bản: tạo protoplast, hấp thụ DNA, phục hồi tế bào trần và chọn lọc các thể chuyển gen Có thể sử dụng bào

tử hoặc sợi nấm non để tạo tế bào trần Tế bào trần được giữ trong môi trường huyền phù với sự có mặt của chất ổn định thẩm thấu DNA được chuyển vào tế bào trần dưới sự có mặt của Ca2+, sau đó bổ sung thêm polyethylene glycol (PEG) nồng

độ cao, ủ ở nhiệt độ phòng 15-30 phút PEG có tác dụng tập hợp các tế bào đã được

xử lý lại và tạo điều kiện giữ DNA Tế bào trần chỉ được phục hồi khi duy trì được

sự ổn định tính thẩm thấu của môi trường cho tới khi thành tế bào phục hồi Các chất giúp duy trì sự ổn định thẩm thấu gồm sorbitol, NaCl, sucrose, … Các thể chuyển gen được chọn lọc nhờ marker kháng kháng sinh và marker trợ dưỡng [26, 90] Phương pháp chuyển gen này được đánh giá là khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài nấm mà các phương pháp chuyển gen khác không thể thực hiện được Tuy nhiên, quá trình tạo protoplast và các bước chuyển gen khá phức tạp, tốn công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm nên khó áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ như ở Việt Nam [59]

1.4.3 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.4.3.1.Vi khuẩn A tumefaciens

Trong tự nhiên, vùng cổ rễ của những loài thực vật hai lá mầm thường xuất hiện những khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức

Những tế bào này phân chia một cách liên tục không thể kiểm soát như tế bào ung thư ác tính ở động vật Hiện nay, loại khối u này đã được biết đến là mụn cây do

loài vi khuẩn A tumefaciens gây nên A tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, có khả

năng chèn các gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng Vi khuẩn

A tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, tạo

nên những mụn sần trên cây [70, 80] Cơ chế hình thành khối u cảm ứng này đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay và đã mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong

ứng dụng vi khuẩn A tumefaciens vào chuyển gen ở thực vật và nấm [31, 37]

Đến nay bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi

khuẩn A tumefaciens gây ra đã được làm sáng tỏ Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenolic thu hút các tế bào vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên,

vi khuẩn A tumefaciens không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển một

đoạn DNA nhỏ (T-DNA: tranferred DNA) vào bên trong tế bào Đoạn DNA này nằm trên một plasmid đặc biệt gọi là Ti plasmid (tumor inducing plasmid) [70] T-DNA sau khi chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ sẽ gây ra khối u ở thực vật Sự phát triển của khối u sau đó sẽ không còn phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn

Agrobacterium [37, 81]

1.4.3.2 Ti plasmid

Trong những năm 1970, các nhà khoa học đã tìm thấy trong những chủng vi

khuẩn A tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn kích thước từ 200 - 800 kb [22, 81] Từ những thí nghiệm trên những chủng A tumefaciens không có plasmid

này, người ta kết luận plasmid nói trên cần thiết cho tạo khối u Vì vậy, chúng được gọi là Ti plasmid (Tumor inducing plasmid) Cấu trúc của một Ti plasmid được thể hiện trên Hình 1.4

Hình 1.4 Cấu trúc của Ti plasmid [81]

Trên Ti plasmid chứa 2 yếu tố cần thiết cho quá trình chuyển gen: vùng gen

vir - virulence genes (vùng độc lực) và T-DNA Vùng gen vir chứa khoảng 25 gen

mã hóa cho các protein (virA, virG, virE và một số protein khác) có vai trò cắt, chuyển và chèn vùng T-DNA vào hệ gen của tế bào chủ Sự hoạt động của vùng

gen vir này được cảm ứng bởi một hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật có

tên là acetosyringone (AS) [70] Một vài Ti plasmid chỉ có một T-DNA, một số khác lại có thể có nhiều vùng T-DNA T-DNA là một đoạn DNA có kích thước khoảng 10 - 30 kb, chiếm tỷ lệ nhỏ hơn 10% kích thước của Ti plasmid, được chuyển vào trong hệ gen của tế bào chủ T - DNA được giới hạn bởi 2 vùng: biên trái (LB) và biên phải (RB) chứa trình tự lặp lại 25 bp có độ tương đồng cao và là vị trí nhận biết cho việc cắt T-DNA T-DNA mang các gen liên quan đến việc tạo khối u [69] Những gen này sau khi được gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia vào quá trình tổng hợp auxin và cytokinin Đây là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục dẫn đến hình thành khối u Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ các gen tạo khối u nằm trong hai đầu biên của T-DNA và thay vào đó bằng các gen mong muốn Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào chủ hoặc mô thực vật chuyển gen có thể phát triển bình thường Nếu không có trình tự tương đồng giữa

hệ gen của tế bào chủ và T-DNA được chuyển, T-DNA sẽ được chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của tế bào chủ Nếu những đoạn gen có độ tương đồng cao với hệ gen của tế bào chủ, sự tái tổ hợp tương đồng sẽ xảy ra Tần suất tái tổ hợp tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau [31] Ngoài các gen tạo khối u, trên T-DNA còn chứa một nhóm gen opine Những gen này mã hóa cho các enzyme giúp cho tế bào thực vật tổng hợp một số axit amin đặc biệt mà

vi khuẩn A tumefaciens có khả năng phân giải, được gọi là opine Đây là một nhóm các hợp chất hóa học được sử dụng như nguồn cũng cấp nitơ chính cho A tumefaciens [107]

1.4.3.3.Cơ chế lây nhiễm của vi khuẩn A tumefaciens

Vi khuẩn A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương

Thực vật bị thương tiết ra các hợp chất trong đó có đường và các axit vô cơ sẽ thu hút vi khuẩn xâm nhiễm theo cơ chế hóa hướng động Khi tiếp cận được vết thương, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp nên các sợi cellulose, đồng thời thực vất tiết

ra hợp chất phenolic (acetosyringone) hoạt hóa vùng gen vir của vi khuẩn Hệ thống điều hòa gen vir hoạt động thông qua 2 gen độc virA, virG VirA tổng hợp nên

protein VirA nằm trong màng tế bào, đáp ứng với sự trao đổi chất ở vết thương và nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Với nồng độ AS thích hợp, sự có mặt của

đường sẽ kích thích gen virA dẫn đến sự tự phosphoryl hóa của VirA Sự tự

phosphoryl hóa này dẫn đến hệ quả protein nội bào VirG được phosphoryl hóa bởi axit aspartic còn lại từ sự phosphoryl hóa của VirA và kích hoạt tất cả sự sao mã

của các gen vir Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển sự tạo thành sợi

đơn T-DNA trong vi khuẩn Quá trình này được thực hiện bởi protein VirD1 và VirD2 Sau đó, VirD2 sẽ gắn vào T-DNA tạo thành phức hợp sợi đơn T-DNA Phức hợp T-DNA-VirD2 và VirE sẽ được chuyển vào tế bào thực vật nhờ hệ thống

chuyển nạp được mã hóa bởi các gen virB Operon virB gồm 11 gen mã hóa cho

việc hình thành cầu nối pili, là con đường vận chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào trong

tế bào thực vật Các protein của vi khuẩn sẽ đưa T-DNA vào trong nhân tế bào nhờ

sự hỗ trợ của một số thành phần trong tế bào thực vật Ở trong nhân, T-DNA sẽ chèn một cách ngẫu nhiên vào hệ gen của vật chủ [70, 80, 22]

1.4.3.4 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Khi có mặt chất cảm ứng, vi khuẩn A tumefaciens sẽ chuyển T-DNA của nó vào tế bào thực vật Lợi dụng cơ chế này, A tumefaciens được dùng làm sinh vật

trung gian để chuyển gen vào thực vật từ những năm 1980 Năm 1998, vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm sợi Phương pháp này được đánh giá là phương pháp đơn giản để chuyển gen vào nấm sợi và đã được thực hiện thành công trên nhiều loại nấm sợi khác nhau [22, 69, 70, 96]

Chuyển gen thông qua A tumefaciens cần một hệ thống vector nhị thể Hệ

vector nhị thể đặc trưng bởi hai plasmid tái bản độc lập gồm vector nhị thể (binary vector) chứa T-DNA mang gen cần chuyển và Ti plasmid cải biến chỉ mang vùng

gen vir hỗ trợ cho việc chuyển T – DNA (còn gọi là helper plasmid) Vector nhị thể được thiết kế bao gồm các thành phần: điểm khởi đầu sao chép hoạt động ở cả E coli và A tumefaciens, MCS (multiple cloning site - vị trí cắt nối đa điểm), các

marker chọn lọc hoạt động được ở vi khuẩn và vật chủ, biên trái và biên phải của DNA Ti plasmid hỗ trợ (helper plasmid) được cải biến từ Ti plasmid bình thường

T-bằng cách loại bỏ các gen tạo khối u và giữ lại vùng gen vir để duy trì chuyển DNA

vào tế bào chủ [40] Hệ thống vector nhị thể được Michielse và các cộng sự mô tả trong Hình 1.5

Hình 1.5 Mô hình vi khuẩn A tumefaciens với hệ thống vector nhị thể [69]

Một hệ thống vector khác cũng từng được sử dụng trong phương pháp ATMT là vector đồng tích hợp (co - integrated vector) Vector đồng tích hợp hoạt động dựa trên cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa plasmid nhỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn và Ti plasmid Ti plasmid cũng được loại bỏ vùng gen tạo khối u và giữ

nguyên vùng gen vir hỗ trợ quá trình chuyển gen vào tế bào chủ Plasmid nhỏ của vi

khuẩn được thiết kế gắn gen cần chuyển vào giữa vùng biên trái (LB) và biên phải

(RB) Khi cả hai vector có mặt trong cùng một vi khuẩn A tumefaciens, quá trình

tái tổ hợp diễn ra khiến cho gen cần chuyển được tích hợp vào vùng T-DNA của plasmid [72] Ngày nay, hệ thống vector đồng tích hợp trở nên ít phổ biến hơn so với hệ thống vector nhị thể do khó khăn trong quá trình thiết kế [57] Hơn nữa, sử dụng vector nhị thể có nhiều thuận lợi hơn vector đồng tích hợp do không cần quá

trình tái tổ hợp in vivo Tốc độ chuyển gen khi sử dụng vector nhị thể nhanh hơn,

chỉ mất 2 - 3 ngày trong khi chuyển gen sử dụng vector đồng tích hợp phải mất 4 -

7 ngày Hơn nữa, hiệu quả chuyển gen khi sử dụng hệ thống vector nhị thể được chứng minh hiệu quả hơn rất nhiều so với khi sử dụng vector đồng tích hợp [72]

1.4.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) là

phương pháp đơn giản được sử dụng phổ biến hiện nay nhờ những ưu điểm vượt trội Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen vào nấm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau

Yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen nhờ A tumefaciens là

nguyên liệu dùng chuyển gen Nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen thành công vào nấm rất đa dạng, có thể là bào tử, tế bào trần, hệ sợi, … [37, 69] So với hai phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần và chuyển gen bằng xung điện yêu cầu nguyên liệu đầu vào bắt buộc là tế bào trần thì đây là một ưu điểm nổi bật do quá trình tạo tế bào trần khá phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và chi phí đắt đỏ Thời gian bảo quản bào tử nấm cũng có thể ảnh hưởng tới hiệu quả của chuyển gen Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ làm giảm hiệu quả chuyển gen trong quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn, hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của các bào tử chuyển gen so với bào tử mới [69]

Sự thành công của phương pháp ATMT cũng được quyết định bởi chủng vi

khuẩn A tumefaciens Các chủng vi khuẩn A tumefaciens đã được sử dụng thành

công để chuyển gen vào nấm sợi cũng rất đa dạng như AGL1, LBA4404, EHA105,

LBA1100, Hiệu suất chuyển gen khi dùng các chủng vi khuẩn A tumefaciens là

khác nhau với các vật chủ khác nhau nên Chủng LBA1100 và plasmid pTiB6 được

kết luận là cho hiệu quả chuyển gen cao vào A awamori và A niger Những chủng

vi khuẩn A tumefaciens khác cũng được sử dụng ở A awamori như A348,

LBA1119, LBA1126 … nhưng phải sử dụng Ti plasmid hỗ trợ khác mới cho hiệu

quả Phương pháp ATMT sử dụng chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 ở nấm A oryzae cũng được chứng minh là rất hiệu quả Với mỗi chủng vi khuẩn A tumefaciens cần phải điểu chỉnh các yếu tố của việc đồng nuôi cấy để thu được kết

quả tốt nhất [69, 77, 78]

Nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS) cũng là một yếu tố quan trọng

quyết định hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Trong hầu hết

các nghiên cứu trước đây, AS được bổ sung trong môi trường cảm ứng ở giai đoạn

đồng nuôi cấy nhằm cảm ứng hoạt động của gen vir [31, 69, 80] Ở một số trường hợp, AS còn được bổ sung trong giai đoạn nuôi lắc cảm ứng với A tumefaciens

nhưng không bắt buộc, thậm chí còn có thể làm giảm hiệu suất biến nạp với các vật

chủ như Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [69, 70]

Một yếu tố quyết định tới hiệu quả chuyển gen bằng phương pháp ATMT là

tỷ lệ đồng nuôi cấy giữa nguyên liệu nấm và vi khuẩn A tumefaciens Tăng tế bào

vi khuẩn A tumefaciens và nấm có thể làm tăng hiệu quả chuyển gen Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên có một giới hạn nhất định Nếu tăng lượng tế bào vi khuẩn A tumefaciens vượt quá nồng độ thích hợp sẽ dẫn đến hiện tượng cạnh tranh dinh

dưỡng, và gây khó khăn trong việc tiêu diệt vi khuẩn khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen Ngược lại, quá nhiều bào tử nấm sẽ dẫn đến tình trạng mọc nền hoặc việc phân lập thể chuyển gen sẽ rất khó khăn [69, 70]

Điều kiện đồng nuôi cấy vi khuẩn và nguyên liệu nấm cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp ATMT Điều kiện đồng nuôi cấy nấm và vi khuẩn gồm thời gian, nhiệt độ và loại màng lọc Nhiệt độ đồng nuôi cấy dao động từ 20°C - 28°C, nhưng nhiệt độ tối ưu thường là từ 22°C - 25°C, trong

thời gian từ 2 - 3 ngày [22, 80] Ở nấm A awamori, nhiệt độ thích hợp cho chuyển

gen là 20oC - 28 oC và thời gian đồng nuôi cấy kéo dài từ 16 - 96 giờ Tuy nhiên, điều kiện tối ưu là 22.5oC - 25oC trong thời gian 2 - 3 ngày [69] Ngoài ra, các loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, nylon cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [69]

Ngoài những yếu tố cơ bản trên, còn có một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng tới hiệu quả của việc chuyển gen như loài nấm, nồng độ kháng sinh, quy trình chuyển gen Vì vậy, muốn hiệu quả chuyển gen cao nhất cần tối ưu các điều kiện

để tìm ra quy trình phù hợp nhất với từng loài

1.4.3.6 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp ATMT

Chuyển gen vào nấm sợi bằng phương pháp ATMT được đánh giá là tốt hơn

so với các phương pháp chuyển gen truyền thống như chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng tế bào trần Thứ nhất, nguyên liệu được dùng để đồng nuôi cấy với

A tumefaciens vô cùng đa dạng Chúng có thể là bào tử, tế bào trần, sợi nấm, bào tử

nảy mầm, hoặc thậm chí là từ cặn tế bào [69, 70] Trong khi đó, phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần đòi hỏi nguyên liệu nấm phải là các tế bào trần hình thành từ khuẩn ty sau khi xử lý với phức hệ enzyme Mặc dù hiệu suất chuyển gen vào nấm bằng tế bào trần cũng rất cao nhưng trên thực tế tiến hành gặp nhiều cản trở Nguồn nguyên liệu tế bào trần được tạo ra sau khi sử dụng hỗn hợp enzyme loại

bỏ thành tế bào nấm phải được sử dụng ngay, nên các thí nghiệm cần hoàn thiện trong ngày Việc sử dụng các loại enzyme đắt tiền để loại bỏ thành tế bào nấm cũng

là một khó khăn với hầu hết các phòng thí nghiệm tại Việt Nam Chất lượng của tế bào trần phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi của hệ sợi nấm, loại enzyme dùng để loại bỏ thành tế bào, thời gian ủ giữa sợi nấm và enzyme, … Quy trình chuyển gen qua protoplast với nhiều bước phức tạp đòi hỏi người thực hiện phải có kỹ năng cao Chính vì vậy, hiệu suất chuyển gen thường không ổn định giữa những lần thực hiện khác nhau [59, 65]

Thứ hai, hiệu suất chuyển gen bằng phương pháp ATMT thường cao và ổn định hơn so với các phương pháp truyền thống Theo thống kê, hiệu quả chuyển gen bằng ATMT thường đạt được 300 - 900 thể chuyển gen với 107 bào tử, cao hơn 600 lần so với phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần nhờ polyethylene glycol (PEG)

[90] Chuyển gen vào A awamori nhờ A tumefaciens có hiệu suất cao hơn

phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG khoảng 400 lần [69] Với vật chủ là

Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5

- 10 lần so với chuyển gen nhờ tế bào trần Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như

Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium

tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [12, 21, 70]

Ưu điểm thứ ba là kích thước của đoạn DNA được chuyển vào tế bào chủ Với phương pháp chuyển gen bằng tế bào trần, kích thước của đoạn DNA ngoại lai

được đưa vào chỉ ở khoảng 40 kb Chuyển gen bằng phương pháp ATMT cho phép chúng ta đưa đoạn DNA ngoại lai có kích thước lên đến 150 kb vào trong hệ gen của tế bào nấm [13]

Một ưu điểm khác của phương pháp này là có thể tạo ra một bộ sưu tập những thể đột biến ngẫu nhiên do đoạn T-DNA có khả năng chèn vào các vị trí khác

nhau trong hệ gen của tế bào chủ Vi khuẩn A tumefaciens có xu hướng chỉ chèn

một bản T-DNA vào hệ gen nấm dẫn đến phá hủy một gen nào đó ở thể chuyển gen tương ứng Đặc tính này được ứng dụng để xác định chức năng của một số gen sinh tổng hợp các chất liên quan đến quá trình phát triển và gây bệnh của một số loài nấm khác nhau Việc xóa gen nhờ cơ chế trao đổi DNA tương đồng ở nấm sử dụng

phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens cũng đạt được hiệu suất rất

cao Khi sử dụng PEG thông qua protoplast, hiệu quả xóa gen chỉ vào khoảng 1% -

50%, tuy nhiên có thể đạt đến 97% khi sử dụng vi khuẩn A tumefaciens [21]

Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp này cũng có một số nhược điểm nhất định Thời gian thí nghiệm dài hơn so với các phương pháp khác do cần thời gian cho bước đồng nuôi cấy giữa nấm và vi khuẩn Ngoài ra, phương pháp này cũng không ưu thế để tạo nên những chủng sinh vật mang một số lượng lớn bản sao T-

DNA để tăng quá trình biểu hiện của gen, do vi khuẩn Agrobacterium có xu hướng

tích hợp chỉ một bản sao vào hệ gen nấm [69] Tuy nhiên, với những ưu điểm nổi

bật trên, có thể khẳng định chuyển gen vào nấm sợi thông qua vi khuẩn A tumefaciens là phương pháp đơn giản, ổn định và cho hiệu quả cao Thậm chí, với

một số loài nấm, việc chuyển gen chỉ khả thi khi sử dụng phương pháp này

1.4.3.7 Ứng dụng phương pháp ATMT trong cải biến di truyền ở nấm sợi

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã được chứng

minh là hiệu quả hơn các phương pháp chuyển gen thông thường khác, thậm chí ở

một số loài chỉ chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens mới khả thi Phương pháp

ATMT có thể giúp tạo một bộ sưu tập lớn các thể đột biến ngẫu nhiên do DNA chèn vào hệ gen của tế bào vật chủ [68, 74] Phương pháp này còn có khả năng tăng

cường quá trình trao đổi chéo DNA tương đồng nên được coi là công cụ hữu ích để xóa và điều tra vai trò của các gen mong muốn Để xác nhận chức năng của một gen nào đó thì phương pháp hiệu quả nhất là tạo đột biến xóa gen Xóa gen được thực hiện dựa trên cơ chế trao đổi chéo tương đồng Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xóa gen bao gồm: trình tự tương đồng, chiều dài của trình tự tương đồng, phương pháp chuyển gen và vị trí của gen đích trong hệ gen Cấu trúc vector xóa được thiết

kế với hai trình tự tương đồng với hai trình tự ở vùng 5’ và 3’ của gen đích Giữa hai trình tự này có thể là khung đọc mở của gen đích đã được cắt đi một đoạn, hoặc

bị loại bỏ hoàn toàn Ở nấm men Saccharomyces cerevisiae xóa gen đạt hiệu quả

cao chỉ với hai đoạn trình tự tương đồng nhỏ (50 bp) Tuy nhiên, ở nấm sợi và một

số loài nấm men khác đòi hỏi hai trình tự tương đồng với kích thước lớn hơn 1 kb

để thực hiện trao đổi chéo tương đồng Xóa gen bằng phương pháp ATMT đạt hiệu quả từ 14% – 75% cao hơn hẳn so với các phương pháp chuyển gen khác [70, 73, 103]

Chuyển gen vào nấm sợi theo phương pháp ATMT đang được nghiên cứu rộng rãi ở các nước trên thế giới với nhiều thành tựu lo lớn Tuy nhiên ở Việt Nam,

đây vẫn là một chủ đề còn khá mới với một số nghiên cứu chuyển gen vào A oryzae

mới được công bố gần đây Với những ưu điểm vượt trội đã nêu trên, phương pháp này nên được triển khai mạnh mẽ tạo nên bước tiến mới cho ngành công nghiệp tiềm năng ở Việt Nam

1.5 Hệ thống marker dùng cho chuyển gen ở nấm sợi

1.5.1 Hệ thống marker chọn lọc các thể chuyển gen

Để xác nhận các thể chuyển gen, người ta cần đến sự trợ giúp của các marker chọn lọc Marker chọn lọc giữ vai trò quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen Hai loại marker được sử dụng chủ yếu hiện nay là các gen kháng thuốc (gen kháng kháng sinh) và các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm

 Gen kháng kháng sinh

Có nhiều loại kháng sinh được sử dụng để chọn lọc thể chuyển gen ở nấm nhưng thông dụng nhất là ba loại hygromycin B, phleomycin và nourseothricin Hygromycin B là một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sinh ra bởi

xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus Kháng sinh này tiêu diệt được cả vi khuẩn,

nấm và các sinh vật nhân chuẩn dựa trên cơ chế ức chế tổng hợp protein [83]

Phleomycin được sinh ra bởi xạ khuẩn Streptomyces verticillus, thuộc nhóm kháng

sinh glycopeptide Kháng sinh này hoạt động theo cơ thế bám vào DNA và phá vỡ cấu trúc sợi kép của DNA dẫn đến tế bào dừng các hoạt động và chết Phleomycin

có hiệu quả đối với hầu hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, tế bào thực vật và

tế bào động vật [64] Kháng sinh nourseothricin có tên thương mại là clonNAT, là

kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces noursei Kháng sinh này gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã khiến cho protein

không được tổng hợp [51]

Gen kháng hygromycin B (hph) được tìm thấy ở vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus 5 và vi khuẩn Escherichia coli (E coli) mã hóa cho HmB

phosphotransferases bất hoạt hygromycin B theo cơ chế phosphoryl hóa Gen kháng

phleomycin (ble) được tìm thấy ở Streptoalloteichus hindustanus và E coli mã hóa

cho protein liên kết với kháng sinh và làm bất hoạt nó Gen kháng nourseothricin

(nat1) mã hóa cho nourseothricin acetyltransferase bất hoạt nourseothricin theo cơ chế acetyl hóa Cả ba gen hph, ble, nat1 hiện đang được sử dụng rộng rãi làm

marker chọn lọc thể chuyển gen ở vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và cả tế bào thực vật [51, 54, 86]

động-Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi hiện nay sử dụng các loại gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc Tuy nhiên, các loại kháng sinh này thường có giá thành rất đắt khiến chi phí cho các thí nghiệm tăng cao, gây hạn chế cho việc nghiên cứu chuyển gen Bên cạnh đó, nhiều loại nấm sợi có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ rất cao, tiêu

biểu là A oryzae khiến cho việc dùng gen kháng kháng sinh làm marker chọn lọc là

không khả thi [97] Vấn đề này đã được khắc phục bằng cách cải biến di truyền của một số loài nấm sợi để có thể dùng các gen trợ dưỡng làm marker chọn lọc

 Marker trợ dưỡng

Chủng đột biến trợ dưỡng là những chủng không có khả năng tự tổng hợp một loại axit amin hoặc một hợp chất cần thiết cho sinh trưởng Vì vậy các chủng này không thể sinh trưởng trên môi trường tối thiểu và yêu cầu bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng Các chủng đột biến trợ dưỡng được dùng để chuyển gen sử dụng marker chọn lọc là các gen trợ dưỡng tương ứng Gen trợ dưỡng được

sử dụng phổ biến nhất ở nấm sợi là pyrG Gen pyrG mã hóa sinh tổng hợp orotidine

5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase), một enzyme quan trọng của quá trình sinh tổng hợp uridine và uracil cần cho sinh trưởng của nấm Khi gen

pyrG bị xóa hoặc bị đột biến gây hỏng, các thể đột biến sẽ không còn khả năng tổng

hợp uridine (tiền chất của uracil) Do đó các chủng này sẽ không sinh trưởng được

trên môi trường tối thiểu thiếu uridine/uracil Khi gen pyrG được chuyển trở lại các

chủng đột biến thì các chủng này lại có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường

tối thiểu Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc

cho quá trình chuyển gen ở nấm [66, 89] Ở các chủng tự nhiên (wild type), enzyme OMP decarboxylase sẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluorooritic acid (5-FOA) không độc thành chất gây độc tế bào 5-flourouracil Ngược lại, ở các chủng đột biến sai hỏng

gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa 5-FOA nên chúng có thể sinh trưởng bình

thường trên môi trường có bổ sung 5-FOA Vì vậy 5-FOA thường được bổ sung vào môi trường trong quá trình sàng lọc các chủng vi nấm chuyển gen liên quan đến gen

pyrG [106]

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tạo ra các chủng nấm sợi trợ dưỡng uridine/uracil Phương pháp phổ biến nhất để tạo đột biến trợ dưỡng này là chiếu tia UV, sau đó sàng lọc trên môi trường chọn lọc có bổ sung 5-FOA, uridine

và uracil [38, 46] Các thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil còn được tạo ra bằng

phương pháp xóa gen pyrG theo cơ chế trao đổi chéo tương đồng Các vector xóa

gen pyrG được thiết kế và chuyển vào chủng nấm tự nhiên (wild type) Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG nguyên gốc trong hệ gen của nấm có thể được

thay thế bởi cấu trúc DNA tương đồng chuyển vào và mất đi khả năng hoạt động, từ

1.5.2 Hệ thống marker chỉ thị dùng trong chuyển gen

Môi trường chọn lọc dùng cho chuyển gen thường gây chết hoặc kìm hãm sự phát triển của các chủng tự nhiên Trong khi đó, các thể chuyển gen có thể phát triển bình thường do chứa các marker chọn lọc giúp bảo vệ chúng khỏi các yếu tố chọn lọc chuyển gen Trái ngược với marker chọn lọc, các marker chỉ thị chỉ làm thể chuyển gen có kiểu hình khác, dễ dàng phân biệt với chủng tự nhiên Vì vậy, chúng được sử dụng như một dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen Gen chỉ thị thường không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý và khả năng sinh trưởng của các thể chuyển gen Các gen chỉ thị có thể được biểu hiện cùng gen đích hoặc biểu hiện độc lập mà không cần gen đích đi kèm [7] Gen chỉ thị gồm các gen mã hóa cho protein huỳnh quang hoặc các gen mã hóa cho các enzyme chuyển hóa cơ chất không nhìn thấy thành các chất có màu hoặc phát sáng Các gen chỉ thị được dùng

phổ biến trong chuyển gen là GFP, DsRed, GUS (mã hóa enzyme β-glucuronidase),

LUC (mã hóa cho luciferase) , LacZ (mã hóa -galactosidase), … Trong đó DsRed

và GFP là hai gen chỉ thị được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen ở nấm sợi [52,

60, 75]

 Gen mã hóa protein huỳnh quang xanh GFP

Gen GFP lần đầu tiên được Osamu Shimomura phân lập từ loài sứa Aequoreavictoria Gen GFP có kích thước 720 bp, mã hóa cho protein kích thước

238 axit amin, trọng lượng 26,9 kDa Protein này hấp thụ mạnh ánh sáng có bước