Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ Chitin tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân Axit

Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài có các nội dung chính sau đây: 1 Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm; 2 Chuyển hóa chitin thành chitosan và xác định kích thước phân tử của chitin thông qua đo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRẦN THỊ HOA LÝ

NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ CHITIN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

THỦY PHÂN AXIT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Thiết

HÀ NỘI, 2011

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầyPGS TS Nguyễn Văn Thiết

đã giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận này

Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Nguyễn Thị Hạnh, người

đã cùng tôi làm đề tài và các thầy cô làm việc tại Phòng Hóa Sinh Thực Vật- Viện Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong khoa, các thầy, các cô trường THPT Lạng Giang số 3 nơi mà tôi đang công tác, các bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình và người thân

đã luôn bên tôi trong suốt thời gian qua!

Hà nội, ngày 26 tháng 5 năm 2011 Học viên

Trần Thị Hoa Lý

LỜI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

MỤC LỤC

Trang

1.2.2 Các biến đổi hóa học của monosaccharide dưới tác động của acid 10

1.3.1 Khả năng hấp phụ các kim loại nặng, các hợp chất hữu cơ 13

Chương 2: Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ đầu-vỏ tôm 23 2.2.2 Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitin bằng phương

pháp đo độ nhớt

24

2.2.6 Các phương pháp thu hồi và làm sạch sản phẩm 29 2.2.7 Phương pháp xác định sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid 30 2.2.8 Phương pháp xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 30

3.1.1 Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học 31

3.1.3 Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được 34 3.2 Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitin bằng acid khác nhau 38 3.2.1 Kết quả nghiên cứu sơ bộ khả năng thuỷ phân chitin bằng các acid

khác nhau

39

3.3.1.1 Đánh giá khả năng thủy phân chitin bằng các acid khác nhau thông

qua xác định lượng polysaccharide còn lại sau phản ứng

40

3.3.1.2 Đánh giá khả năng thủy phân chitin bằng các acid khác nhau thông

qua xác định lượng đường khử trong dịch phản ứng

41

3.3.1.3 Đánh giá khả năng thủy phân chitin thông qua xác định lượng sản

phẩm phụ của phản ứng

43

3.2.2 Nghiên cứu mối phụ thuộc của lượng đường khử tạo thành trong phản ứng thuỷ phân chitin bằng acid vào nhiệt độ thuỷ phân

47

3.2.3 Kết quả nghiên cứu thủy phân chitin bằng acid H2SO4 49

3.2.5 Kết quả thuỷ phân chitin bằng acid H3PO4 56 3.3 So sánh và đánh giá chung kết quả thuỷ phân chitin bằng các acid khác nhau

59

3.4 Nghiên cứu độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 62

MỞ ĐẦU 1.Lí do chọn đề tài

Chitin là biopolymer thứ 2 trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose về lượng Đây là loại vật liệu mới quý, không chỉ vì từ chitin có thể tạo ra được nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng cao để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống xã hội,

mà quan trọng hơn nữa là nguồn nguyên liệu này có thể được coi là vô tận, vì được tái sinh trong tự nhiên Polysaccharide này là một trong các thành phần quan trọng của khung xương ngoài ở nhiều động vật không xương sống, nấm và cả ở một số loài tảo, có chức năng sinh học chính là chức năng cấu trúc (nâng đỡ và xác định hình dạng cơ thể) và bảo vệ

Từ chitin dễ dàng nhận được chitosan – một polymer sinh học là dẫn xuất trực tiếp của chitin và cũng có mặt trong tự nhiên trong thành phần thành tế bào của một

số loại nấm Chitosan là dẫn xuất quan trọng nhất của chitin, hiện nay polysaccharide này đã được coi là polymer dược phẩm Cả chitin và chitosan đều không độc, dễ phân hủy và có tính dung nạp sinh học Các polysaccharide có các tính chất hấp phụ rất quí với phổ hấp phụ rất rộng: từ kim loại đế các chất hữu cơ Chitin là biosorbent rất tốt đối với các kim loại, có thể hấp phụ tất cả các kim loại, đặc biệt là các kim loại nặng, chỉ ngoại trừ các kim loại kiềm và kiềm thổ được sử dụng trong làm sạch nước thải chứa phóng xạ và các kim loại nặng [80] Các thử nghiệm invitro cho thấy chitin liên kết trên bề mặt của nó các phân đoạn có khối lượng phân tử trung bình, các oligopeptide, creatin, ure, cholesterin và triglyceride, nhưng không hấp phụ các protein có kích thước phân tử lớn, các ion Na và hấp phụ

ít K Các thí nghiệm trên động vật cho thấy trên nền phát triển của các trạng thái bệnh lí khác nhau, sử dụng chitin làm giảm lượng các oligopeptide độc và các chất khác trong máu có tác động âm tính đối với cơ thể, làm giảm 2 lần tỉ lệ chết của động vật so với nhóm động vật không được nhận biosorbent Hơn nữa, phân tích các kết quả thí nghiệm lâm sàng cho phép đưa ra giả định về sự tham gia của chitin trong hấp phụ các thành phần của huyết tương như cholesterin, triglyceride, ure, creatinin, serotonin, histamin và các chất khác, điều này có ý nghĩa rất lớn trong

điều trị một loạt các trạng thái bệnh lí liên quan tới các rối loạn kinh niên hoạt động của các cơ quan và hệ cơ quan tương ứng Các kết quả này mở ra triển vọng ứng

dụng chitin trong y học thông qua cái gọi là thẩm tích ruột để chữa các bệnh nhiễm

trùng kinh niên và cấp đường dạ dày-ruột, các tổn thương hệ thống gan-mật, các rối loạn kinh niên và cấp tính đồng hành với sự phát triển ngộ độc (viêm phổi, các biến chứng tính chất nhiễm trung mủ sau phẫu thuật, suy thận mãn và cấp…), các rối loạn dị ứng và trao đổi Ngoài ra chitin có thể được sử dụng để chữa bệnh trong thú

y, chăn nuôi… [82]

Trở ngại lớn nhất trong ứng dụng chitin là tính chất khó hòa tan của chúng trong nhiều dung môi, kể cả các dung môi hữu cơ Từ chitin và chitosan đã nhận được nhiều dẫn xuất khác nhau bằng các phương pháp hóa học để làm tăng tính tan của chúng, nhằm phát huy được các tiềm năng ứng dụng của các polysaccharide này Một trong các phương thức đơn giản và rẻ tiền nhất làm tăng tính phân tán của chitin và chitosan trong thể tích, về mặt nào đó cũng đồng nghĩa với làm tăng tính tan của chúng, là phương pháp thủy phân acid nhờ sử dụng các acid vô cơ làm tác nhân thủy phân Bằng phương pháp này có thể thu nhận nhiều loại sản phẩm có các tác dụng khác nhau từ chitin để phục vụ cho các mục đích ứng dụng khác nhau, bao gồm: (i) chitin và chitosan mạch ngắn (so với các phân tử ban đầu) và nanochitin; (ii) các chito-oligosaccharide (cả mạch ngắn và mạch dài, hay tan và không tan), và (iii) chito-monosaccharide (chủ yếu là glucosamine) Các sản phẩm thủy phân nhóm

1 ngoài các ứng dụng trong y học như nêu trên, trong vai trò biosorbent còn có thể

sử dụng để tạo ra thực phẩm chức năng phòng chống béo phì, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, tiểu đường, chống ngộ độc thực phẩm… Nhóm sản phẩm chito-oligosaccharide có triển vọng rất lớn trong vai trò các elicitor – các chất làm tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể và có tác dụng chống béo phì Glucosamine là thuốc chống viêm khớp tốt Chúng tôi quan tâm hơn cả tới 2 nhóm sản phẩm đầu, vì vậy đề tài luận văn thạc sĩ của tôi có tên là:

“Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitin tách chiết từ vỏ tôm

bằng phương pháp thủy phân acid”

Đề tài được tiến hành dựa trên cơ sở phương pháp hóa học nhằm tạo ra một số chế phẩm có giá trị gia tăng cao từ nguồn phụ phẩm dồi dào của ngành công nghiệp chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là vỏ tôm, phục vụ cho các ứng dụng khác nhau Tôi tin tưởng sự thành công của đề tài không chỉ có ý nghĩa thực tiễn về mặt kinh tế- xã hội, mà còn có ý nghĩa khoa học cơ bản sâu sắc

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo một số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm bằng phương pháp thủy phân acid

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài có các nội dung chính sau đây:

1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm;

2) Chuyển hóa chitin thành chitosan và xác định kích thước phân tử của chitin thông qua đo độ nhớt của chế phẩm chitosan nhận được;

3) Nghiên cứu động học của quá trình thủy phân chitin bằng các axit vô cơ khác nhau để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo ra một số chế phẩm sinh học từ chitin: nhóm sản phẩm SP1(bao gồm chitin mạch ngắn, nanochitin và các chito-oligosaccharide mạch dài không tan), nhóm sản phẩm SP2 (gồm các oligosaccharide mạch ngắn, tan trong acid) và nhóm sản phẩm SP3 (các chito-monosaccharide, chủ yếu là glucosamine)

4) Xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2 (OLIGOMER) trên chuột nhắt trắng

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu:

- Chitin, chitin mạch ngắn, nanochitin, chitooligosaccaride và glucosamine

* Phạm vi nghiên cứu:

- Nghiên cứu quá trình thủy phân chitin/chitosan bằng các acid khác nhau: HCl, H2SO4, H3PO4, HNO3 ở các nồng độ, nhiệt độ và thời gian khác nhau

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tách chiết chitin

- Phương pháp chuyển chitin thành chitosan

- Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitin bằng phương pháp đo độ nhớt

- Phương pháp thuỷ phân chitin bằng acid

- Các phương pháp xác định đường khử

- Phương pháp phân tách, thu hồi và làm sạch sản phẩm

- Phương pháp xác định sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid

- Phương pháp xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2

6 Dự kiến đóng góp mới

Chỉ ra bằng phương pháp thủy phân acid sẽ tạo ra được một số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về chitin/chitosan

Chitin có công thức phân tử: (C 8H13O5N)n (n thay đổi tùy thuộc từng loại nguyên liệu, chẳng hạn như tôm hùm: n = 700800 và ở cua n = 500600) Công thức cấu tạo của chitin xem hình 1 Phân tử lượng của chitin không dưới 1 000 000 Da

O CH2OH

CH2OH O

O OH

CH2OH O

n Chitin

n

O CH2OH

NH2

O CH2OH

NH2

NH2

O OH

CH2OH O

Chitosan

n

O CH2OH

CH2OH O

O OH

CH2OH O

n Cellulose

Hình 1 Sơ đồ cơ cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose

Trên hình 1 là sơ đồ cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose Từ sơ

đồ này ta thấy về mặt hóa học chitin có thể được coi là dẫn xuất của cellulose, nhưng điều này chỉ đúng về mặt hình thức, còn nếu xét về bản chất của quá trình sinh tổng hợp chitin và cellulose, thì 2 polysaccharide này được tạo thành trong cơ thể sống theo các đường trao đổi chất hoàn toàn khác nhau Hơn nữa, phân bố của 2 loại polysaccharide này trong tự nhiên cũng khác nhau hoàn toàn: nếu như cellulose

là biopolymer đặc trưng cho giới thực vật, thì chitin lại chỉ có ở các động vật không

có xương sống, nấm và một số loài tảo [29, 33, 74] Nói đúng hơn, đơn vị cấu trúc của chitin (N-acetylglucosamine) là dẫn xuất của glucose - đơn vị cấu trúc của cellulose Với chitosan vấn đề lại hoàn toàn khác: Chitosan thực sự là dẫn xuất của chitin, từ chitin có thể nhận được chitosan bằng các phương pháp khác nhau (xem phần sau)

Tính chất vật lý của chitin: Khi dùng kính hiểm vi điện tử quét để khảo sát

chitin cho thấy cấu trúc bề mặt của chitin khá chặt chẽ, phẳng lì Ở điều kiện thường chitin tồn tại ở thể rắn, vô định hình, không tan trong nước, acid loãng, kiềm loãng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường Chitin tan trong HCl đậm đặc, acid sulfuric đậm đặc, sự hòa tan này dẫn đến biến đổi khối lượng phân tử, độ deacetyl và năng suất quay cực của chitin [27]

Chitin có thể phân tán trong dung dịch các muối trung tính có khả năng hydrat hóa ở nồng độ cao

Tính chất hóa học của chitin:

- Phản ứng deacetyl hóa chitin xảy ra trong môi trường kiềm đặc

- Chitin bị thủy phân trong môi trường acid clohydric đặc ở nhiệt độ cao gây cắt mạch thu được glucosamine

Hình 2 Sơ đồ chuyển hóa chitin thành chitosan và glucosamine

- Phản ứng este hóa:

+ Chitin tác dụng với acid nitric đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

+ Chitin tác dụng với acid sulfuric đậm đặc trong pyridin, dioxan và N, dimethylamin cho sản phẩm chitin sulfate

N-+ Chitin tác dụng với acid cloacetic cho sản phẩm cacboxylmetylchitin [26] Nhìn chung các phản ứng hóa học của chitin là không đa dạng, điều này dễ dàng giải thích được do cấu tạo chitin có các nhóm chức tương đối trơ, hơn nữa cấu trúc bề mặt của chitin phẳng lì và rất chặt chẽ đã gây khó khăn cho sự tiếp xúc của

nó với các tác nhân phản ứng Tính không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nên chitin khó tham gia các phản ứng hóa học thông thường, vì điều này mà khả năng ứng dụng của chitin bị hạn chế rất nhiều Các nhà khoa học đã cố gắng nghiên cứu biến đổi hóa học tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitin để có thể hòa tan trong các dung môi thông thường tiện lợi hơn trong quá trình sử dụng Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan, một dẫn xuất thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2 [2], được coi là dẫn xuất quan trọng nhất Hiện nay người ta đã biết được chitosan có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng đa dạng trong thực tế

Về mặt cấu tạo chitosan là một polymer hữu cơ được cấu tạo bởi các đơn vị D-Glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1→4-glycoside [27]

Công thức lý thuyết của chitosan được biểu diễn trên hình 1, còn công thức phân tử là (C6H11O4N)n

Tính chất vật lý của chitosan: Chitosan ở điều kiện thường là thể rắn tinh thể

và rắn vô định hình có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi, không vị, không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong aceton và các dung môi hữu cơ thông thường khác Chitosan tan trong dung dịch acid loãng (pH = 6) tạo dung dịch keo trong suốt, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 311o C Độ nhớt của dung dịch chitosan trong dung dịch acid loãng có liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polymer) [81]

Do chitosan có –NH2 còn cặp electron tự do linh động trên nguyên tử (N), nên có khả năng tạo phức với ion kim loại, tạo liên kết với các acid hữu cơ, anhydrit hữu cơ

Tính chất hóa học của chitosan:

- Phản ứng Van-Wisselingh [28]: Chitosan tác dụng với dung dịch Ingol cho màu nâu, màu này chuyển sang màu tím khi có mặt acid sulfuric

- Chitosan tác dụng với dung dịch acid sulfuric tạo tinh thể hình cầu chitosan sulfate, chất này làm mất màu dung dịch Fucsin 1% hay dung dịch acid picric 1%

- Sự khử amine có thể gây ra bởi một số tác nhân oxy hóa như Ba(BrO)2; AgNO3; N2O3; HNO2…

- Chitosan có thể bị cắt mạch bởi acid, enzyme [2] hoặc bằng bức xạ để tạo oligomer

1.2.Các phương pháp tách chiết chitin

Như chúng ta đã biết rằng chitin được khoa học biết đến từ năm 1811, chitin

và chitosan và các sản phẩm nhận được từ chitin và chitosan (các charide dạng [GlcNAc]n và [GlcN]n) được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như nông nghiệp, y-dược, môi trường…, cho nên chitin đã được tách chiết từ rất nhiều nguồn tự nhiên như vỏ tôm, cua, mai mực… Trong vòng hơn một thế kỉ qua chitin được tách chiết đều bằng các phương pháp hóa học và cho đến nay

chitoologosac-có rất nhiều phương pháp hóa học khác nhau được sử dụng trong các phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như ở nước ta để tách chiết và làm sạch chitin, phục vụ cho các mục đích ứng dụng khác nhau [29, 31, 85, 95] Từ năm 2002 ở nước ta có

dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất một số sản phẩm chitin và chitosan nguồn gốc thiên nhiên từ phụ phẩm của ngành thuỷ, hải sản với quy mô công nghiệp”, với mục tiêu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất được 100 tấn chitin/1 năm do trường Đại học Thuỷ sản Nha Trang chủ trì, phương pháp được sử dụng để thu nhận chitin cũng là phương pháp hóa học

Trong thời gian gần đây do các bức xúc về vấn đề ô nhiễm môi trường, nên các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu áp dụng các phương pháp chế biến sinh học

(bioprocessing methods) trong sản xuất chitin để thay thế cho các phương pháp hóa học tiêu tốn nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trường Phương pháp sinh học đầu tiên và cũng là duy nhất cho đến nay được áp dụng trong sản xuất chitin là phương pháp lên men lactic [29, 51, 52, 82, 71, 100,], tuy còn ở quy mô rất nhỏ so với phương pháp hóa học Phương pháp này cũng đã được một số tác giả của nước ta áp dụng để thu nhận chitin từ vỏ tôm [41]

Như vậy, hiện nay có hai nhóm phương pháp sản xuất chitin từ vỏ giáp xác đó

là các phương pháp hóa học và các phương pháp sinh học, trong đó phương pháp hóa học tách chiết chitin là phương pháp đã có từ rất lâu và ngày nay vẫn là phương pháp chính được áp dụng trong sản xuất polymer sinh học này, còn phương pháp sinh học mới được nghiên cứu áp dụng trong thời gian gần đây với mục đích thay thế phương pháp hóa học truyền thống tiêu hao nhiều hóa chất và gây ô nhiễm môi trường

1.2.1 Thuỷ phân chitin và chitosan bằng acid

Thuỷ phân acid các polysaccharide, mà chủ yếu là thuỷ phân tinh bột và các nguyên liệu chứa tinh bột, là một phương pháp đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước giải khát và trong công nghiệp thực phẩn để sản xuất mạch nha, cũng như trong lĩnh vực sản xuất ethanol (cồn) nhiên liệu Điều này rất dễ hiểu vì tinh bột và một số polysaccharide khác trong nguyên liệu ban đầu đều là các polysaccharide với các liên kết glucoside ở cấu hình  rất dễ bị thuỷ phân bằng acid Với chitin và chitosan thì vấn đề thuỷ phân bởi acid lại hoàn toàn khác, bởi các liên kết glucoside trong 2 polysaccharide lại có cấu hình , do vậy chitin và chitosan cũng giống như cellulose, rất bền với thuỷ phân acid trong các điều kiện

“mềm”, tức là ở nồng độ acid thấp và nhiệt độ thấp Tuy nhiên ở điều kiện nhiệt độ

là 100oC các polysaccharide này được thuỷ phân dễ dàng bằng acid [71]

Về mặt lí thuyết, polysaccharide nói chung, chitin và chitosan nói riêng, có thể

bị thuỷ phân hoàn toàn bằng acid Về nguyên tắc có thể sử dụng các acid vô cơ khác nhau như HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4… để thuỷ phân, nhưng trên thực tế H2SO4

thường được sử dụng để thuỷ phân polysaccharide vì dư lượng của nó dễ bị loại

khỏi hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc thuỷ phân ở dạng bari sulfate, và H2SO4

cũng gây phá huỷ monosaccharide ít nhất (tạo thành dẫn xuất của furfurol) so với các acid vô cơ khác Ví dụ, để thuỷ phân cellulose, đầu tiên polysaccharide này được hoà trong H2SO4 72%, sau đó pha loãng bằng nước và đun sôi trường diễn ở

100oC Các điều kiện trung bình cho thuỷ phân polysaccharide là: Đun polysaccharide trong dung dịch H2SO4 2N ở 100oC trong 2-4h thì đa số các polysaccharide bị thuỷ phân [71]

Ở nước ta quá trình thuỷ phân chitin và chitosan bằng acid cũng đã được một

số tác giả quan tâm nghiên cứu với mục đích tạo chế phẩm GlcN để chữa bệnh viêm khớp [102] Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu này đều chỉ dừng lại ở trong phòng thí nghiệm

Phản ứng thuỷ phân polysaccharide nói chung và chitin, chitosan nói riêng trong acid có rất nhiều hạn chế, do tạo thành các sản phẩm phụ từ sản phẩm chính của phản ứng (monosaccharide hay đường khử) dưới tác động của acid, đặc biệt là ở các nồng độ acid cao và nhiệt độ cao (xem phần sau)

1.2.2 Các biến đổi hóa học của monosaccharide dưới tác động của acid

Các monosaccharide (đường khử) có thể bị biến đổi thành rất nhiều chất khác nhau trong các phản ứng hóa học dưới tác động xúc tác của kiềm và acid Nhìn chung các monosaccharide bền hơn nhiều với tác động của acid so với tác động của kiềm [71, 69,] Chẳng hạn trong các điều kiện thuỷ phân các polysaccharide trong dung dịch acid vô cơ 2 M thì glucose bị biến đổi rất chậm Tuy vậy, phụ thuộc vào một số điều kiện (trước tiên là nồng độ acid và thời gian mà monosaccharide bị tác động bởi acid) mà có thể xảy ra một loạt phản ứng [71]

Cả acid và kiềm đều xúc tác (kiềm mạnh hơn) phản ứng Lobrri de Bruin - Alberd van Ekenstein [71] Dưới tác dụng của kiềm và acid phản ứng enol hóa aldose thành endiol xảy ra theo các sơ đồ trên hình 6 Enol tạo thành có thể biến đổi theo nhiều hướng khác nhau Phản ứng này là cơ sở của hầu như tất cả các biến đổi hóa học của các monosaccharide dưới tác động của kiềm và acid Tuy nhiên trong

khuôn khổ đề tài này chúng tôi chỉ quan tâm tới các biến đổi hóa học của các monosaccharide dưới tác động của acid

HC

H

HO

O OH H R

R H O O HO

C H

H

HO

O OH H R

HO

H

H C H HO

OH+

OH H R R

H OH O HO

H

C H

+ H+

(B)

Hình 6 Sơ đồ phản ứng tạo thành dạng enol (1,2-endiol) dưới tác dụng của

kiềm (A) và acid (B)

Dưới tác động của acid xảy ra nhiều biến đổi hóa học của các monosaccharide, trong đó có aminosaccharide nói chung và GlcN nói riêng Trong số các biến đổi hóa học đó đáng kể nhất là:1) Các phản ứng isomer hóa và epimer hóa (ví dụ, từ glucose trong môi trường acid sẽ tạo thành fructose và mannose, và có thể cả psicose; 2) Đứt liên kết C–C hay phản ứng ngược với phản ứng trùng hợp aldol; 3)

Di chuyển liên kết đôi dọc mạch C; 4) Tách nước khỏi enol - phản ứng loại trừ  với sự tạo thành hợp chất dicarbonyl 3-deoxyhexosulese Trên thực tế cả 4 loại phản ứng trên có thể xảy ra cùng một lúc Ngoài ra, dưới tác động của acid còn xảy ra

phản ứng ngược với phản ứng thuỷ phân, tức là biến đổi các monosaccharide thành các oligosacchride khi tách nước Phản ứng này xảy ra trong các điều kiện khá

mềm Chẳng hạn D-Glc trong dung dịch 0,15 M H2SO4 bị biến đổi một phần thành isomaltose (6-O--D-glucopyranosyl-D-glucose) do tác động của nhóm OH rượu bậc I của một phân tử lên tâm anomer của phân tử thứ hai Cùng với chất này còn nhận được một lượng nhất định các oligosacchride khác, cấu trúc và tỉ lệ tương quan của chúng phụ thuộc vào bản chất của các monosaccharide ban đầu

Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi quan tâm hơn cả tới các biến đổi hóa học của monosaccharide dẫn tới tạo thành các hợp chất dicarbonyl Trong cả môi

trường kiềm và acid trong trường hợp glucose hợp chất hợp chất dicarbonyl được tạo thành từ endiol tương ứng là 3-deoxyglucosulese:

O

O C H

Hình 7 Sơ đồ phản ứng tạo thành hợp chất dicarbonyl từ glucose

Các 3-deoxyhexosulese là những chất không bền, các biến đổi tiếp theo của chúng trong môi trường kiềm và môi trường acid là khác nhau Trong môi trường acid xảy ra biến đổi các hợp chất dicarbonyl thành các dẫn xuất của furan: 3-deoxypentosulese (hay pentose) tạo thành furfurol, còn 3-deoxyhexosulose (hay hexose) - tạo thành 5-hydroxy-methylfurfurol (xem phần dưới) [71]

1.2.3 Tạo thành furfurol và các chất họ hàng

Trong số các sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid chitin và chitosan thì chúng tôi quan tâm nhất là furfurol và các chất họ hàng, bởi vì sự tạo thành các chất này ảnh hưởng rất nhiều lên hiệu suất của quá trình thuỷ phân Các chất này được tạo thành khi tác động lên monosaccharide các acid vô cơ mạnh Trong môi trường acid xảy ra sự biến đổi của các hợp chất dicarbonyl thành các dẫn xuất của furan: các pentose cho furfurol, còn các hexose - cho hydroxymethylfurfurol:

CH C

CH C

O

O C H

+ H+

OH

CH C

3,4-Dideoxy-Hydroxymethylfurfurol

Hình 8 Sơ đồ tạo thành các sản phẩm phụ là dẫn xuất của

furan khi thuỷ phân chitin và chitosan trong môi trường acid

Trong một chuỗi biến đổi hóa học từ 1 phân tử monosaccharide tách ra 3 phân

tử H2O (theo 3 giai đoạn), sau đó là quá trình vòng hóa và cuối cùng là tạo thành

hydroxymethylfurfurol Điều kiện quan trọng để sự vòng hóa diễn ra là cấu hình

trans của liên kết C2 - C3 của diendiol có hệ thống liên hợp dài với 3 liên kết đôi

Lượng sản phẩm phụ dạng các dẫn xuất của furan tạo thành trong quá trình thuỷ phân acid chitin và chitosan, có thể xác định bán định lượng được bằng đo hấp phụ của dịch thuỷ phân trong vùng bước sóng 270 - 300 nm (xem phần kết quả) 1.3 Các tính chất hấp phụ của chitin/chitosan

1.3.1 Khả năng hấp phụ các kim loại nặng, các hợp chất hữu cơ

Chitin và chitosan chứa một số nhóm chức – các nhóm hydroxyl, carbinol, amino, acetylamid và các cầu oxy, cho nên cơ chế hấp phụ các ion kim loại nặng và các chất khác bởi các polymer này mang tính chất khá phức tạp Phụ thuộc vào các điều kiện cơ chế này có thể bao gồm sự tạo phức, trao đổi ion và hấp phụ bề mặt, tuy nhiên trong thời gian cuối đa số các nhà nghiên cứu cho rằng sự tạo phức chelat (còng cua) chiếm ưu thế hơn cả, cơ chế này được nguyên nhân bởi khả năng cho electron cao của các nguyên tử N & O Nhờ vậy mà các chất hấp phụ chitin có phổ hấp phụ đặc biệt rộng Chúng có thể được sử dụng để làm sạch các dung dịch nước khỏi các chất bẩn rất khác nhau: thực tế là khỏi tất cả các kim loại nặng, nhiều nguyên tố phóng xạ (radionuclid), các vi khuẩn, nhiều tạp chất hữu cơ, các thuốc trừ sâu và nhiều chất khác [80]

Do đặc tính của nhóm amino tự do trong cấu trúc chitosan được tạo thành khi deacetyl hóa chitin, các tính chất tạo phức chelat của nó làm cho khả năng hấp phụ kim loại tăng gấp 5 đến 6 lần so với chitin Khi ghép một số nhóm chức vào khung cấu trúc của chitosan sẽ làm tăng khả năng hấp phụ kim loại của chitosan lên nhiều lần Để tạo điều kiện tốt cho quá trình chuyển khối, đồng thời tăng dung lượng hấp phụ kim loại của chitosan, một số nhà khoa học đã nghiên cứu biến tính chitosan, đồng thời đánh giá khả năng hấp phụ kim loại nặng trên mạng lưới liên kết mạch thẳng và chéo nhau của chitosan Kết quả là đã tạo ra được nhiều loại chitosan biến tính có dung lượng hấp phụ kim loại cao

Bên cạnh khả năng hấp phụ các kim loại nặng chitin/chitosan còn có khẳ năng hấp phụ các chất hữu cơ Người ta đã ứng dụng tính chất này để sản xuất thuốc

giảm béo, do chitosan mang điện tích dương, khi vào đến ruột được dịch tiêu hóa hòa tan tạo thành dạng gel và sẽ tìm hút những chất mang điện tích âm như: chất béo, cholesterol, lipid… Đây là giải pháp giảm cân an toàn nhờ tác dụng như nam châm hút mỡ, nhanh chóng hút lấy các acid béo, dầu mỡ có trong thức ăn tại ruột và thải trừ chúng ra khỏi cơ thể Sản phẩm này có khả năng hấp thu và thải trừ chất béo cao nhất mà ở chất xơ thực vật không có được

1.3.2 Tính kháng khuẩn của chitosan

Gần đây những nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm

chống lại E.coli, đã phát hiện thấy nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh

hưởng của chitosan đến vi khuẩn Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan không trực tiếp hoạt động ức

chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng

của vi khuẩn Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác

và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau

Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ và Ca2+ Nồng độ cao các ion kim loại có thể làm mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối

với hoạt động kháng Staphylococcus aureus Người ta cũng thấy rằng chitosan có

thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans Cả chitosan phân tử lượng 50 kDa và 5 kDa đều

kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50 kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ và ATP so với chitosan 5 kDa Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn

khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng Và nó tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+ Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.03-0.25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối kượng phân tử của chitosan Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào

Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan 470 kDa có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ

lactobacillus sp, trong khi với vi khuẩn Gram âm chitosan có khối lượng 1106 kDa

mới có ảnh hưởng Nhìn chung, chitosan ở nồng độ 0.1% có ảnh hưởng mạnh hơn

đến vi khuẩn Gram dương như Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B.cereus, Staphylococcus aureus, lactobacillus plantarum, L brevis và L bulgaris hơn là vi khuẩn Gram âm như E coli, Psedomonas fluorescens, Salmonella typmurium và Vibrio parahaemolyticus

Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt tính ức chế

vi khuẩn và nấm Một trong các đồng phân của chitosan là N- carboxybutyl chitosan

có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của

những loài này, ở nồng độ 0.1% và pH 5.6 chúng kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt tính kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên

thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin-ß-glucan

Ngược lại, sự ức chế và làm ngưng hoạt động của nấm men, nấm mốc lại phụ thuộc vào nồng độ chitosan, pH, và nhiệt độ Hoạt tính ức chế vi khuẩn của chitosan chịu ảnh hưởng của các nhân tố bên trong cũng như bên ngoài ví dụ loại chitosan, mức độ polymer hóa, đặc điểm dinh dưỡng của vật chủ, các chất hóa học thành phần dinh dưỡng và các điều kiện của môi trường như hoạt độ của nước…

Bảng 1.1 Chitosan và khả năng ức chế các vi sinh vật

(*)

c O 2 là có oxy; k O 2 là không có oxy

Ngoài ra các hợp chất chitosan lactate và chitosan hydroglutamate cũng được

sử dụng như là tác nhân ức chế E.coli, S aureus và Saccharomyces cerevisiae Nồng độ chitosan lactate trong nước cất có ảnh hưởng mạnh nhất đến E coli Chưa đến 1h, số lượng vi khuẩn này giảm khoảng 10^4, còn S aureus giảm đến 10^6

Đối với nấm men, chúng hoàn toàn ngừng hoạt động ở nồng độ 1mg/ml chitosan lactate sau chưa đến 17 phút

1.4 Các sản phẩm sinh học từ chitin/chitosan

- Chitin/chitosan mạch ngắn

- Nanochitin/nanochitosan

Nanochitin là gì? Tại sao lại phải tạo ra nanochitin? Như chúng ta biết rằng,

cả chitosan và chitin đều có khả năng hấp phụ nhiều chất khác nhau, đây là tính chất quan trọng nhất của chúng, làm cho chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Cả 2 polysaccharide này đều không tan trong nước, chitin chỉ tan trong một số dung môi hữu cơ, chitosan có tính tan tốt hơn, tan được trong một số dung dịch acid loãng Nguyên nhân chính tính khó tan của chitin là các mạch polysaccharide dài của nó tạo thành các dạng sợi với cấu trúc tinh thể Cho nên khi

sử dụng chitin có cấu trúc mạch dài sẽ không phát huy được hết tác dụng hấp phụ của nó (đối với chitosan cũng vậy), sự chuyển hóa thành nanochitin làm cho nó phân tán được tốt hơn (đồng nghĩa với làm tăng tính tan của chitin) và do đó phát huy được hết khả năng hấp phụ của chitin Đây chính là lí do cần phải chuyển hóa chitin thành nanochitin Tương tự, đối với chitosan cũng vậy Tuy tính tan của chitosan cao hơn nhiều so với chitin, nhưng khi được chuyển hóa thành nanochitosan thì tính tan của nó sẽ tăng lên nhiều, phân tán tốt hơn so với chitosan mạch dài và nanochitosan sẽ có các tính chất hấp phụ tốt hơn Như vậy có thể hiểu một cách đơn giản rằng nanochin là các đoạn mạch chitin có kích thước phân tử nhỏ vẫn giữ được các tính chất hấp phụ của chitin

Các hạt nanochitin và nanochitosan có kích thước khác nhau phụ thuộc vào phương pháp thu nhận và mục đích ứng dụng: 100 – 400 nm [97], ~ 350 nm [98, 99], 200 – 1000 nm [96], 400 – 500 nm [100], 180 nm [101] và 5 – 200 nm [102]

Cũng như chitin, nanochitin không độc, không gây dị ứng, có tính kháng vi sinh vật, có tính dung nạp sinh học rất tốt và khả năng phân hủy sinh học, được ứng dụng rộng rãi trong y học để làm lành vết thương và giải phóng thuốc có kiểm soát [76a] Theo những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nga chitin nhận được bằng phương pháp điện hóa và chế phẩm nanochitin tương ứng có khả năng hấp phụ nhiều chất như các peptide độc (thường tạo thành khi bị nhiễm khuẩn, nhiễm trùng) và các kim loại nặng, ure và creatitin (những chất thải tích tụ trong máu khi

bị suy thận), cholesterin và triglyceride, vì vậy chúng là những biosorbent rất tốt, có

thể sử dụng trong thẩm tích ruột (enterodialysis) để thải các chất độc trong ngộ độc

thực phẩm, để trợ giúp các bệnh nhân bị suy thận và làm giảm mỡ máu ở các bệnh nhân bị bệnh béo phì… [78a, 80, 82, 82a]

- Các oligochitosaccharide tan mạch ngắn (có mức độ polymer hóa CD < 10)

và các oligochitosaccharide mạch dài hơn tan được trong acid

- Glucosamine là một amino-mono-saccharide có trong mọi mô của cơ thể con người Glucosamine được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan Những phân

tử proteoglycan này hợp với nhau thành mô sụn Nguồn cung cấp để tổng hợp Glucosamine lấy từ glucose trong cơ thể Trong các khớp bị viêm, lớp mô sợi của bao khớp và màng hoạt dịch làm giảm sự khuếch tán glucose vào mô sụn Hơn nữa hiện tượng viêm trong khớp đã tiêu thụ lượng glucose có giới hạn của cơ thể Chính

vì thế có sự thiếu hụt Glucosamine Lúc này, glucosamine ngoại sinh là nguồn cung cấp tốt nhất cho sự sinh tổng hợp các proteoglycan Người ta thấy glucosamine sulfate có ái lực đặc biệt với các mô sụn Nó còn giúp ức chế các enzyme như stromelysin và collagenase gây phá hủy sụn khớp Trước đây glucosamine được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamine sulfate, Chondroitin sulfate và Diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp Hiện nay nó được cơ quan Dược phẩm châu Âu (EMEA) chấp nhận xét vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yêu cầu thực nghiệm lâm sàng Ðã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh với các loại thuốc kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)

Trong thời gian gần đây, người ta hay nhắc đến một loại thuốc có hiệu quả cao trong điều trị thoái hóa khớp rất an toàn, dễ dung nạp khi dùng lâu dài đó là Glucosamine Đó là thuốc tác dụng vào cơ chế bệnh sinh của thoái khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp tính và mãn tính, có đau hay không có đau, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp

Glucosamine đặc hiệu trong điều trị thoái hóa khớp là do nó có 3 tác dụng: kích thích sản sinh sụn, giảm đau khớp và chống viêm trong đó tác dụng kích thích sản sinh sụn đóng vai trò quan trọng nhất Glucosamine là thành phần chính của proteoglycan - 1 trong 3 thành phần (proteoglycan, collagen, tế bào sụn) cùng với nước cấu tạo nên sụn khớp Proteoglycan như sợi dây thừng xâu chuỗi với collagen,

có vai trò giữ nước để làm trơn và nuôi dưỡng collagen Khi sụn bị phá hủy, sợi dây yếu đi, proteoglycan mất khả năng gắn chặt với collagen, không giữ được nước, còn collagen bị mất chất nuôi dưỡng Kết cục là sụn bị thoái hóa, mất khả năng đệm với những va chạm, những cú nhảy, vặn xoắn Glucosamine bổ sung sẽ cung cấp nguyên liệu làm tăng tổng hợp proteoglycan và do vậy có tác dụng phục hồi sụn khớp, bình thường hóa quá trình chuyển hóa sụn Thuốc có tác dụng điều trị tận gốc nguyên nhân của bệnh chứ không chỉ dừng lại ở điều trị triệu chứng

Glucosamine có bản chất làm một aminomonosaccharide được tổng hợp trong cơ thể người, vì vậy thuốc gần như không có tác dụng phụ (trừ trường hợp quá mẫn cảm với thuốc) và được dung nạp tốt So sánh với các thuốc giảm đau, chống viêm trong điều trị thoái hóa khớp, glucosamine cho kết quả rất khả quan trên

cả thực nghiệm và lâm sàng Thuốc cải thiện tốt triệu chứng đau và viêm dài hạn, an toàn, ngoài ra còn có thể sử dụng phối hợp với các thuốc NSAID cho kết quả tốt hơn trong giảm đau cấp tính…

Glucosamine tham gia quá trình chuyển hóa tổng hợp nên thành phần của sụn khớp Nó là nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan, khi vào trong cơ thể nó kích thích tế bào ở sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường Kết quả của quá trình trùng hợp là mucopolysaccharide, thành phần cơ bản cấu tạo nên đầu sụn khớp Glusamine sulfate đồng thời ức chế các enzyme phá hủy

sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxide phá hủy các tế bào sinh sụn Glucosamine còn kích thích sinh sản mô liên kết của xương, giảm quá trình mất calcium của xương Do glucosamine làm tăng sản sinh chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, tăng khả năng bôi trơn của dịch khớp Vì thế glucosamine không những giảm triệu chứng của thoái khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển

1.5 Ứng dụng trong nông nghiệp, y học

Ứng dụng trực tiếp của chitin nói chung là không nhiều và thường chuyển sang dẫn xuất chitosan rồi tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng Nhờ đặc tính sinh học quý giá mà chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Nông nghiệp, Y học,

xử lí nước thải, công nghiệp nhuộm, mỹ giấy, thực phẩm… Hiện nay các nhà khoa học Việt Nam cũng đã và đang tập trung nghiên cứu nhiều về ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất của chúng trong y – dược học [1], trong nông nghiệp [1, 2] và bảo vệ môi trường

Trong nông nghiệp:

- Bảo quản hạt giống (thóc, hành): Khi bọc các hạt giống bằng vỏ bọc chitosan sẽ ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng

cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Các thí nghiệm thực tế cho thấy chitosan có khả năng ức chế hoạt động của một số loại vi

khuẩn như E.Coli Một số dẫn xuất của chitosan diệt được một số loại nấm hại dâu

tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài Có thể bảo quản các loại thực phẩm tươi sống, đông lạnh khi bao gói chúng bằng các màng mỏng dễ phân hủy sinh học và thân môi trường Thông thường người ta hay dùng màng PE để bao gói các loại thực phẩm khô Nếu dùng PE để bao gói các thực phẩm tươi sống thì có nhiều bất lợi do không khống chế được độ

ẩm và độ thoáng không khí (oxy) cho thực phẩm Trong khi bảo quản, các thực phẩm tươi sống vẫn "thở", nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển Màng bao bọc bằng chitin và chitosan sẽ giải quyết được các vấn đề trên Trong thực tế người ta đã

dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả như đào, dưa chuột, đậu, bưởi v.v Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói Một ứng dụng nữa của chitosan là làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của quinon Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn Ở Việt Nam mới đây PGS TS Trần Thị Luyến – Trường đại học thủy sản Nha Trang đã phối chộn chitosan với polymer khác và một số chất phụ gia để hình thành một polymer mới đạt các yêu cầu của vật liệu có khả năng bao gói sản phẩm [3]

- Kích thích sinh trưởng, tăng năng suất: Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý – sinh hóa của mạ lúa

ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục tổng số và hàm lượng nitơ, đồng thời hàm lượng các enzyme như amylase, catalase hay peroxidase cũng tăng lên, vì vậy làm tăng năng suất cây trồng Ngày nay chitosan còn được làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm,

cá, cua để kích thích sinh trưởng

Trong y học

- Tạo da nhân tạo: Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin được gọi là Beschitin

W, nó giống như một tấm vải và được bọc lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Tấm Beschitin W bị phân hủy sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới

Nó có tính chất kháng khuẩn, lành da, tạo biểu bì mới, giảm đau, giúp cho các vết sẹo phục hồi nhanh chóng [1] Ở trong lĩnh vực này nước ta cũng trở thành quốc gia thứ hai sau Nhật Bản chế tạo thành công màng da nhân tạo chữa các tổn thương về

da từ chitin Sản phẩm được mang tên Vinachitin do tập thể các nhà khoa học thuộc Viện Hóa Học (Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia) và Đại Học Y Hà Nội [4]

- Tạo chỉ khâu phẫu thuật, tự hủy: (Trường Đại Học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu từ chitin nhờ phát hiện ra một dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ thường mà không làm phá hủy cấu trúc polymer) [1]

- Chống sự phát triển khối u

- Sản xuất thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng từ chitosan Mới đây Viện Vacxin Nha Trang đã sản xuất thành công hai sản phẩm chitosan chữa béo phì và Glusivac điều trị thoái hóa khớp Hai loại thuốc này đã được Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào đầu tháng 6/2005 [84] Hay đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình deacetyl và cắt mạch chitin để điều chế glucosamine” (2005) của tác giả Trần Thái Hòa – Trường Đại Học Khoa Học, Đại Học Huế

Chitin có khả năng hấp phụ các thành phần của huyết tương như cholesterin, triglyceride, ure, creatinin, serotonin, histamin và các chất khác, điều này rất có ý nghĩa trong điều trị một loạt các rối loạn bệnh lí liên quan tới những rối loạn kinh niên hoạt động của các cơ quan và hệ thống tương ứng [82] Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thương kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo từ chitosan So với các loại băng thường, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần Và từ lâu, một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện, chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ.[4]

Lĩnh vực này hiện còn rất nhiều cơ sở đang nghiên cứu và hứa hẹn đưa ra nhiều những ứng dụng quý giá từ chitin, chitosan và các sản phẩm được tạo ra từ

Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu ban đầu cho tách chiết chitin là phụ phẩm đầu-vỏ tôm khô Chuột thí nghiệm được mua ở Học viện quân y 103

2.1.2 Hóa chất

NaOH, HCl, HNO3, H2SO4, H3PO4, ferricianide, ZnSO4… và acid oxalic của Trung Quốc, KMnO4 của Việt Nam, mark công nghiệp, ethanol tuyệt đối của Việt Nam và Trung Quốc, các mẫu chitosan chuẩn của Hàn Quốc, antron của hãng Sigma Các hóa chất khác đều đạt tiêu chuẩn hóa chất phân tích (P)

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu: meter, máy li tâm lạnh, máy quang phổ UV-Visable Spectrophotometer SIMADZU UV-1601, Termostat, bếp cách cát, tủ hút, tủ sấy vô trùng, máy lắc…

pH-2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ đầu-vỏ tôm

Chitin - nguồn nguyên liệu ban đầu cho sản xuất nanochitin/nanochitosan, được tách chiết và làm sạch bằng phương pháp hóa học truyền thống - là phương pháp chính được sử dụng rộng rãi từ trước tới nay trên thế giới cũng như ở nước ta

để nhận chế phẩm chitin từ phế liệu đầu-vỏ tôm và các nguồn nguyên liệu chứa chitin khác

Các công đoạn của phương pháp hóa học tách chiết và tinh chế chitin được thực hiện theo trình tự sau:

Bước 1: Xử lí nguyên liệu với acid

Cho một lượng thích hợp dung dịch acid HCl 11,2N vào nguyên liệu đã được rửa

sơ bộ bằng nước máy để loại bớt thịt, ngâm trong 1 giờ, sau đó rửa cặn bằng nước máy đến pH trung tính; lặp lại việc xử lí như vậy 2 lần nữa (đến khi cho acid vào không thấy

sủi bọt khí nữa là được) Bước xử lí này loại được hết các chất khóang và một phần đáng

kể protein trong vỏ tôm

Bước 2: Xử lí với kiềm

Ngâm sản phẩm thu được ở bước 2 với dung dịch NaOH 4% ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (thường là 1530 phút, hoặc có thể ngâm qua đêm), sau đó đun sôi 1 giờ rồi rửa sạch bằng nước máy đến pH trung tính Việc xử lí kiềm này được lặp lại thêm 2 lần nữa Trong công đoạn này tất cả các protein cấu trúc (liên kết bền vững) của vỏ tôm đều bị loại, sản phẩm thu được là chế phẩm chitin thô còn chứa các chất màu

Bước 3: Loại bỏ các chất màu (tẩy mầu sản phẩm)

Các chất màu trong chế phẩm chitin thô được tẩy đầu tiên bằng xử lí với dung dịch KMnO4 (thuốc tím) nồng độ 0,1% (ngâm trong 15 phút sau đó rửa sạch bằng nước máy), sau đó là với dung dịch acid oxalic (C2H2O4) nồng độ 1% [10]: ngâm từ

1 đến 2 giờ cho đến khi sản phẩm có màu trắng thì lấy ra rửa sạch bằng nước máy, phơi khô (hoặc sấy ở nhiệt độ dưới 50oC) sẽ thu được chế phẩm chitin sạch

Chúng tôi đã tiến hành tách chiết và tinh chế chitin từ bột đầu-vỏ tôm theo quy trình trên ở 3 quy mô thí nghiệm với khối lượng mẫu là 100g, 500g và 1kg Toàn bộ quá trình tách chiết được tiến hành trong 1 ngày Chế phẩm chitin thu được được sấy hoặc phơi khô đến trọng lượng không đổi để tính hiệu suất thu hồi chitin

2.2.2 Xác định trọng lượng phân tử trung bình của chitin bằng phương pháp đo độ nhớt

a) Cơ sở lí thuyết: Có nhiều phương pháp đo phân tử lượng (Mr) của polymer, trong đó phương pháp đo độ nhớt là một phương pháp khá đơn giản về mặt thực nghiệm Theo phương pháp này phân tử lượng của polymer được tính theo công thức Mak - Euvin:

[] = KMr 

trong đó [] là độ nhớt đặc trưng, K và  là các hằng số phụ thuộc vào bản chất của của dung môi và nhiệt độ,  có giá trị trong khoảng 0,5  0,8 Độ nhớt đặc trưng -

theo định nghĩa - là giới hạn của độ nhớt rút gọn khi nồng độ của dung dịch tiến tới 0:

[] = lim rút gọn

C  0

= lim

C  0

và độ nhớt riêng (riêng) liên quan với độ nhớt tương đối (tương đối) như sau:

tương đối = dung dịch

Hình 2.1 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc của độ nhớt rút gọn vào

nồng độ (A) của polymer trong dung dịch được đo trên nhớt kế

Otvan (B) Trên thực nghiệm độ nhớt đặc trưng được xác định như sau: Pha một loạt dung dịch chất polymer có nồng độ phần trăm từ rất bé rồi tăng dần lên (nồng độ cao nhất không quá 1 g/ 100 ml), sau khi đo độ nhớt của mỗi dung dịch và dung môi, tính độ nhớt rút gọn cho mỗi dung dịch rồi xây dựng đồ thị chuẩn biểu diễn mối phụ thuộc của tỉ số riêng/C đối với một loạt dung dịch polymer có nồng độ tăng

C

riêng

dần vào nồng độ C của dung dịch (tính bằng g/ 100 ml), rồi ngoại suy giá trị của tỉ

số này khi C  0 (xem hình 2.1 A)

b) Cách tiến hành

Độ nhớt của các dung dịch chitosan được đo bằng nhớt kế Otvan (xem hình 2.1 B) ở nhiệt độ phòng có điều hoà nhiệt độ là 250C Quá trình đo độ nhớt được tiến hành theo các bước sau:

- Pha một loạt dung dịch chitosan trong acid acetic 1% (hoặc 0,5% hay 0,2%) với các nồng độ 0,01; 0,03; 0,05 và 0,1%, đi từ dung dịch 1% đã được chuẩn bị từ trước

- Tráng nhớt kế vài lần bằng dung dịch acid acetic 1%

- Dùng pipet hút 5 ml dung dịch acid acetic cho vào nhánh phải của nhớt kế, rồi dùng quả bóp cao su hút lên ngập quá mức A một chút rồi tháo quả bóp cao su cho dung dịch acid acetic chảy tự nhiên và dùng đồng hồ bấm giây đo thời gian dung dịch chảy từ ngấn A đến ngấn B Đo 45 lần, lấy giá trị trung bình Giá trị đo được là thời gian t0

- Tiến hành đo các dung dịch còn lại như đã làm ở trên Cứ mỗi lần đo dung dịch mới, phải tráng nhớt kế bằng chính dung dịch ấy ít nhất 2 lần

Khi làm xong thí nghiệm, các kết quả thí nghiệm được ghi vào bảng mẫu dưới đây:

K = 5,910-4, trong khi các giá trị tương ứng của  đối với 3 trường hợp này là 0,62; 0,67 và 0,67), Do không có một thông tin cụ thể về các giá trị của K và  trong

trường hợp tính độ nhớt của chitosan do vậy trong phần kết quả chúng tôi tính với các giá trị K và  khác nhau

2.2.3 Phương pháp chuyển chitin thành chitosan

Chitin được chuyển thành chitosan bằng phương pháp hóa học: ngâm chitin trong dung dịch kiềm (NaOH) 4060%, sau đó đun sôi trong thời gian 4060 phút, rồi rửa bằng nước máy đến pH trung tính, thu được chế phẩm chitosan có độ deacetyl hóa cao

2.2.4 Phương pháp thuỷ phân chitin bằng acid

Chitin được thuỷ phân trong các dung dịch acid HCl, H2SO4, HNO3 và H3PO4

có nồng độ từ 1N đến 6N hoặc 8N ở các nhiệt độ 25, 50, 75 và 100oC, nồng độ chitin và chitosan từ 1% đến 5% Thời gian thuỷ phân phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm Trong trường hợp nghiên cứu động học thuỷ phân chitin theo thời gian thì mẫu dịch thuỷ phân được lấy vào các thời điểm 1; 2; 4; 6; và 8 h kể từ khi bắt đầu phản ứng Sau đó hàm lượng đường khử được đo bằng phương pháp với antron và ferricianide

2.2.5 Các phương pháp xác định đường khử [19]

2.2.5.1 Phương pháp xác định đường khử với antron

Nguyên lí của phương pháp: Các dẫn xuất của monosaccharide dạng furfurol tạo thành khi đun glucose hay đường khử nói chung với acid sulfuric đặc, phản ứng với antron và tạo thành các chất màu:

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng của antron với đường khử Cường độ màu tỉ lệ thuận với lượng glucose hay đường khử trong phạm vi từ

10 đến 100 g glucose trong một mẫu, vì vậy có thể xác định được lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu theo đồ thị chuẩn được xây dựng từ trước với glucose hay glucosamine

Húa chất: Dung dịch dịch antron 0,2%, chuẩn bị trờn dung dịch H2SO4 95%, dung dịch được chuẩn bị vào ngày đo 2) Dung dịch chuẩn glucose (chứa 40 g glucose/ml)

Cỏch tiến hành: Đặt cỏc ống nghiệm vào bồn đỏ, sau đú lần lượt cho cỏc thành phần phản ứng vào theo trỡnh tự sau: 2,5 ml dung dịch mẫu nghiờn cứu chứa lượng đường khử tương đương với từ 10 đến 100 g glucose, 5 ml dung dịch antron (dung dịch sử dụng 1 lần, chuẩn bị trước khi dựng) Chỳ ý: khi cho dung dịch antron vào phải lắc mạnh Đun sụi cỏch thuỷ 10 phỳt rồi làm lạnh trong bồn đỏ, sau đú so màu

ở bước súng 620 nm (dung dịch của hỗn hợp phản ứng cú màu xanh) Kết quả xõy dựng đồ thị chuẩn với glucose để xỏc định đường khử được dẫn trờn hỡnh 2.3

Đồ thị chuẩn xác định đường khử

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

K3Fe(CN)6 + Glc K3 Fe(CN)6 + Glcox + K 3 Fe(CN)6

2K4Fe(CN)6 + 2ZnSO4 K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3K2SO4

Protein được tủa bởi hydrate của kẽm oxit (hoặc cadimi)

Hóa chất: 1) Na2S2O3 (hyposulfite) - dung dịch 0,005 N (chuẩn bị trước lúc xác định từ dung dịch 0,1 N), kiểm tra bằng phép chuẩn độ 2) K3Fe(CN)6 - dung dịch 0,005 N: Hoà tan 1,65 g K3Fe(CN)6 đã được tinh thể hóa lại trong 1 l nước cất chứa 10,6 g Na2CO3 được nung kĩ hay không chứa nước 3) Glc, 4) NaOH - các dung dịch 0,1N và 1,1N 5) ZnSO47H2O - dung dịch 0,45%; 6) CdSO4 - dung dịch 1,3% (13 g CdSO4, 63,5 ml H2SO4, dẫn nước đến 1000 ml); 7) H2SO4 - dung dịch 1N; 8) CH3COOH - dung dịch 3%; 9) Tinh bột tan - dung dịch 1%, chuẩn bị trên NaCl bão hoà 10) Dung dịch 3 thành phần: Hoà tan 5 g KI, 10 g ZnSO4 và 50 g NaCl trong 200 ml nước cất Chất phản ứng này không bền, bởi vì KI dễ bị phân huỷ ngoài ánh sáng Vì vậy nên chuẩn bị trước dung dịch không có KI, và KI chỉ được cho thêm vào ngay trước khi tiến hành phân tích

2.2.6 Các phương pháp thu hồi và làm sạch sản phẩm

Sau khi kết thúc phản ứng thuỷ phân (8 h) tiến hành xác định định lượng và thu hồi 3 nhóm sản phẩm từ dịch thủy phân acid

Nhóm sản phẩm SP1 được tách khỏi dịch thủy phân bằng lọc hay li tâm, sau

đó rửa sạch bằng ethanol 96%, rửa sạch và sấy hay phơi khô, sau đó xác định khối lượng trên cân điện tử

Nhóm sản phẩm thứ ba được xác định theo phương pháp xác định đường khử,

từ đó dự đoán lượng đường khử tạo thành của các mẫu chitin bị thủy phân Lượng

của nhóm sản phẩm SP2 được tình bằng cách lấy lượng chitin sử dụng cho thủy phân trừ đi lượng sản phẩm SP1 và SP3

Nhóm sản phẩm SP2 và SP3 được thu hồi từ dịch thủy phân bằng phương pháp tủa phân đoạn với ethanol 96% Đầu tiên trung hòa dịch thủy phân acid bằng NaOH, sau đó cho từ từ 0,4 thể tích ethanol 96% vào, có khuấy, để trong lại 30 phút, sau đó li tâm thu cặn, được chế phẩm SP2 Cho tiếp 0,2 thể tích ethanol 96% vào và làm tương tự như bước tủa thứ nhất, thu được căn tiếp theo là chế phẩm SP3 chứa chủ yếu là glucosamine

Cặn được rửa nhiều lần bằng ethanol 96% cho đến khi dịch rửa ethanol có màu trắng là được

2.2.7 Phương pháp xác định sản phẩm phụ của phản ứng thuỷ phân acid

Các chất thuộc nhóm furan dạng furfurol là sản phẩm phụ của quá trình thuỷ phân chitin và chitosan bằng các acid khác nhau được xác định bằng phương pháp

đo hấp phụ của các dịch thuỷ phân trong vùng bước sóng từ 270 đến 300 nm (chi tiết xem phần kết quả nghiên cứu)

2.2.8 Phương pháp xác định độ độc cấp tính của chế phẩm SP2

Do bằng phương pháp thủy phân acid SP2 là nhóm sản phẩm thu được nhiều nhất, đây cũng là nhóm sản phẩm có nhiều triển vọng ứng dụng không chỉ trong y học để làm thực phẩm chức năng chống béo phì, mà còn được ứng dụng trong bảo

vệ thực vật trong vai trò elicitor để làm tăng khả năng miễn dịch của cây trồng đối với các loại dịch bệnh khác, cho nên chúng tôi đã xác định độ độc cấp tính của nhóm sản phẩm này trên chuột nhắt trắng

Chi tiết tiến hành xem phần “Kết quả và thảo luận”

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm

3.1.1 Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học

Nếu xét bản chất của các quy trình tách chiết và làm sạch chitin thì chúng ta thấy cả 2 nhóm phương pháp hóa học và sinh học tách chiết chitin (từ vỏ tôm nói riêng và từ các nguồn nguyên liệu khác nói chung) đều bao gồm các bước (giai đoạn) xử lí nguyên liệu để đạt được các mục đích cụ thể là loại bỏ 3 nhóm chất sau: 1- Các chất khoáng; 2- Protein; 3- Pigment và các chất màu khác, tuy trình tự các giai đoạn có thể phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể Điểm khác nhau căn bản của 2 nhóm phương pháp này là ở các loại protein: Trong các phương pháp sinh học protein bị loại trong những điều kiện rất “mềm” nhờ sử dụng các enzyme proteolytic (protease hay proteinase), chỉ các protein cấu trúc liên kết rất bền vững mới bị loại bỏ bằng đun với kiềm ở nhiệt độ cao, còn trong các phương pháp hóa học protein bị loại bằng kiềm

Trong phạm vi luận văn này tôi chọn phương pháp hóa học để tách chiết chitin

từ vỏ tôm, bởi vì phương pháp này đơn giản, mất ít thời gian, và đây cũng là phương pháp thông dụng nhất tách chiết chitin hiện nay, toàn bộ lượng chitin thương phẩm trên thế giới ngày nay đều được sản xuất bằng phương pháp hóa học Dưới đây là các kết quả tách chiết chitin bằng phương pháp này

Chitin được tách chiết từ đầu-vỏ tôm bằng phương pháp hóa học theo quy trình gồm 3 công đoạn như đã mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu

Quy trình tách chiết chitin theo phương pháp hóa học đã được thực hiện ở 3 quy mô thí nghiệm là 100 g, 500 g và 1 kg nguyên liệu (đầu vỏ tôm khô)/ 1 lần tách chiết Kết quả các thí nghiệm này ở tất cả 3 quy mô tách chiết về tiêu hao hóa chất (acid và xút) và hiệu suất thu hồi chitin được tóm tắt trong bảng 3.1

Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, hiệu suất thu hồi chitin ở cả 3 quy mô tách chiết (tính trung bình theo 3 thí nghiệm ở mỗi quy mô) là 7,47,5%, tức là khoảng 7475 g chitin/1 kg nguyên liệu đầu-vỏ tôm Kết quả này thấp hơn rất nhiều so với các

số liệu của các tác giả khác đã công bố đối với phương pháp hóa học: Theo các tài liệu

đã công bố trước đây mà chúng tôi có được thì hàm lượng của chitin trong vỏ tôm là 1327% [27, 103] Sở dĩ có sự chênh lệch lớn như vậy có lẽ là do nguyên liệu (đầu-vỏ tôm) mà chúng tôi sử dụng để tách chitin có chứa rất nhiều thịt

Bảng 3.1 Tiêu hao hóa chất và hiệu suất thu hồi chitin tách chiết bằng

100 g vỏ tôm 500 g vỏ tôm 1 kg vỏ tôm

Kết quả tách chitin từ mẫu nguyên liệu vỏ tôm sạch bằng phương pháp hóa học

mà chúng tôi tiến hành, cho hiệu suất thu hồi chitin là 28,6% (thu được khoảng 28,6 g chitin từ 100 g vỏ tôm đã được rửa sạch khỏi phần thịt dính bám) - một giá trị tương đương với giá trị mà các tác giả khác đã công bố về hàm lượng chitin trong vỏ tôm là 1327% Như vậy, hiệu suất thu hồi chitin phụ thuộc vào mẫu nguyên liệu đó chứa nhiều hay ít protein

So sánh kết quả tách chiết chitin ở cùng một quy mô 100 g từ 2 mẫu nguyên liệu khác nhau cho thấy khi sử dụng nguyên liệu là vỏ tôm đã được rửa sạch thịt lượng hóa chất tiêu tốn giảm đi nhiều lần so với trường hợp sử dụng nguyên liệu là đầu-vỏ tôm còn chứa nhiều thịt (bảng 3.2)

Hình 3.1 Ảnh sản phẩm chitin thu được

Bảng 3.2 So sánh tiêu hao hóa chất cho 1 g sản phẩm chitin tách chiết từ 2 mẫu nguyên liệu khác nhau Hóa chất Lượng hóa chất tiêu hao 1 g chitin sản phẩm Tỉ lệ

sử dụng Mẫu đầu-vỏ tôm (m1) Mẫu vỏ tôm sạch thịt (m2) m1/m2

so với trường hợp tách chiết chitin từ mẫu đầu-vỏ tôm thông thường

3.1.2 Chuyển hóa chitin thành chitosan

Chuyển hóa chitin thành chitosan bằng phương pháp hóa học là một trong các nội dung của đề tài này Quá trình chuyển hóa chitin thành chitosan đã được thực hiện bằng phương pháp hóa học thông thường, đây là phương pháp duy nhất hiện nay để sản xuất chitosan từ chitin Như chúng ta biết rằng, dưới tác động của dung dịch kiềm (NaOH) đặc (nồng độ từ 40 đến 60%) ở nhiệt độ cao [103, 104, 105,

106], chitin dễ dàng bị deacetyl hóa thành chitosan Quá trình này cũng có thể thực hiện ở cả nhiệt độ thường [25]

Trong nghiên cứu này các mẫu chitin được chuyển hóa thành chitosan bằng phương pháp thông dụng đã được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng là: Đầu tiên các mẫu chitosan được ngâm 1 h trong dung dịch NaOH 50-60%, rồi đun sôi 1 h trong dung dịch kiềm này, sau đó rửa sạch kiềm bằng nước máy đến giá trị pH trung tính

sẽ thu được các mẫu chitosan tương ứng

Các mẫu chitosan nhận được theo phương pháp hóa học xử lí với kiềm đặc ở nhiệt độ cao như trên tan được trong acid acetic loãng 0,2-1% sẽ có độ deacetyl hóa (DD) cao Theo một số tác giả khi xử lí chitin từ mai mực với NaOH 40% hoặc 50%

ở nhiệt độ thường trong 48 h, thì nhận được các chế phẩm chitosan có độ deacetyl hóa tương ứng là 92 và 96%; còn khi xử lí chế phẩm chitin với NaOH 30% ở nhiệt độ thường trong 96 h, lại nhận được chế phẩm chitosan với độ deacetyl hóa tới 98% [25] Do vậy chúng tôi có cơ sở để cho rằng chế phẩm chitosan nhận được khi xử lí với NaOH 50-60% ở nhiệt độ cao sẽ có DD > 90%

3.1.3 Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được

Sau khi tách chiết được chitin từ các mẫu nguyên liệu khác nhau ở các quy mô khác nhau, chúng tôi đã tiến hành đánh giá chất lượng của các chế phẩm chitin thu được theo các chỉ tiêu về cảm quan (như màu sắc của chế phẩm) và một số chỉ tiêu quan trọng như độ nhớt, khối lượng phân tử và khả năng tạo gel, độ tan trong acid acetic

Đo độ nhớt của các dung dịch polymer thẳng nói chung là một trong các phương pháp quan trọng trong nghiên cứu các polymer, bởi vì thông qua giá trị

độ nhớt của các dung dịch polymer, có thể đánh giá được khối lượng phân tử trung bình của các mẫu (chế phẩm) polymer đó Khối lượng phân tử trung bình (Mr) của các chế phẩm chitin nhận được ở các quy mô khác nhau và các mẫu chitosan tương ứng đã được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt, thông qua khối lượng phân tử trung bình của mẫu chitosan có thể đánh giá được khối lượng phân tử trung bình của mẫu chitin tương ứng Để đạt được mục đích này đầu tiên