ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN XUÂN VŨ Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” trung thực, thực Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Ngun Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực nội dung khác đề tài Học viên ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn T.S Nguyễn Xuân Vũ ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm cán bộ, quý đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020 Học Viên iii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật ngữ Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ viết tắt (cả tiếng Anh tiếng Việt) CT Công thức LSD Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ có ý nghĩa CV Coeficient of Variation – Hệ số biến động MT Môi trường TN Thí nghiệm AS Acetosyringone LB Left border- ranh giới trái RB Right border-ranh giới phải MS Murashige Skoog iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Diện tích lúa gieo trồng từ năm 2015 - 2019 .9 Bảng 1.2 Sản lượng lúa từ năm 2015 - 2019 .9 Bảng 2.1 Danh mục giống nghiên cứu 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng NaOCl 3% tới hiệu khử trùng mẫu (sau ngày nuôi cấy) 29 Bảng 3.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo số giống lúa 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng 2,4-D đến tỷ lệ tái sinh mô sẹo số giống lúa (sau 14 ngày) .33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa 34 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kinetin đến khả tái sinh số giống lúa .35 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tuổi mô sẹo đến khả tiếp nhận gen GUS số giống lúa 37 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến hiệu chuyển gen số giống lúa 39 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ AS đến khả tiếp nhận gen GUS số giống lúa 40 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 42 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 43 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc mô sẹo chuyển gen 44 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tình hình sản xuất diện tích lúa tồn cầu năm 2018 [16] Hình 1.2 Tỷ trọng sản xuất lúa theo vùng năm 2018 Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens 10 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 Hình 1.5 Cấu trúc Ti-plasmid 11 Hình 1.6 Cấu trúc T-DNA 12 Hình 1.7 Cơ chế phân tử việc chuyển gen thông qua A tumefaciens 13 Hình 2.1 T-DNA plasmid pCambia3301 mang gen bar gen gus, gen điều kiển CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải) 20 Hình 3.1 Mơ sẹo tái sinh môi trường N6 (A) MS (B) giống lúa Bao thai sau ngày nuôi cấy 31 Hình 3.2 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa (sau 14 ngày) A- Nếp 87; B- Bao thai; C- Khang dân; D- Đồn kết 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) A-Đoàn kết; B- Nếp 87 ; C-Khang dân; D- Bao thai 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng kinetin đến khả tái sinh chồi số giống lúa (sau 28 ngày) A-Nếp 87; B- Đoàn kết; C-Khang dân; D- Bao thai 35 Hình 3.5 Biểu gen GUS mô sẹo ngày tuổi giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) .38 Hình 3.6 Biểu gen GUS nồng độ AS 100 µM giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) .40 Hình 3.7 Biểu gen GUS sau phút lây nhiễm với vi khuẩn giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 41 Hình 3.8 Biểu gen GUS sau ngày đồng nuôi cấy giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) .43 Hình 3.9 Chọn lọc tế bào chuyển gen môi trường hygromycin 10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) 25 mg/l (D) 44 vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu 3 Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò lúa 1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất lúa giới 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa giới .5 1.2.2 Tình hình sản xuất lúa giới 1.3 Tình hình nghiên cứu vẩn xuất lúa Việt Nam 1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa Việt Nam 1.3.2 Tình hình sản xuất lúa Việt Nam .8 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens chế chuyển gen vào thực vật 10 1.4.1 Đặc điểm chung vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 10 1.4.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid T-DNA 11 1.4.3 Cơ chế biến nạp gen thông qua vi khuẩn A.tumerfaciens vào thực vật 12 1.5 Hệ thống gen thị sử dụng để biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng nghiên cứu 14 1.5.1 Gen gusA 14 1.5.2 Gen bar 14 vii 1.6 Một số phương pháp biến nạp gen lúa 14 1.6.1 Phương pháp vi tiêm 14 1.6.2 Chuyển gen xung điện 15 1.6.3 Chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) 15 1.6.4 Chuyển gen súng bắn gen 15 1.7 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 16 1.8 Tình hình nghiên cứu tái sinh in vitro lúa giới Việt Nam 16 1.9 Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen lúa giới Việt Nam 17 Chương ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.1.2 Vật liệu sử dụng phạm vi nghiên cứu 19 2.1.3 Thiết bị sử dụng 20 2.2 Địa điểm thời gian tiến hành 20 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa 21 2.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả chuyển gen số giống lúa 23 2.4 Điều kiện bố trí thí nghiệm 26 2.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 26 2.5.1 Các tiêu theo dõi 26 2.5.2 Các tiêu đánh giá 26 2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết nghiên cứu khả tái sinh invitro số giống lúa 29 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng NaOCl đến hiệu vô trùng mẫu nuôi cấy 29 3.1.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tạo mô sẹo .30 3.1.3 Ảnh hưởng 2,4D đến khả tạo mô sẹo số giống lúa 32 3.1.4 Ảnh hưởng BAP đến khả tái sinh chồi số giống lúa .33 viii 3.1.5 Ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi số giống lúa Việt Nam .35 3.2 Kết nghiên cứu khả tiếp nhận gen 36 3.2.1 Ảnh hưởng tuổi mô sẹo đến hiệu biến nạp gen 36 3.2.2 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến hiệu biến nạp gen .38 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ AS đến hiệu chuyển gen số giống lúa 39 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen 41 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen 42 3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc chuyển gen 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 Kết luận 45 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 41 A B C D Hình 3.6 Biểu gen GUS nồng độ AS 100 µM giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 3.2.4 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen Thời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn Agrobacterium tumefacien tiến hành giống lúa sử dụng chủng LBA4404 gen thị GUS Vi khuẩn sau hịa lỗng với mơi trường biến nạp lây nhiễm với mô sẹo khoảng thời gian từ đến phút Kết nghiên cứu cho thấy thời gian biến nạp dài tỷ lệ mô sẹo chết cao Tỷ lệ mô sẹo sống cao khoảng thời gian từ đến phút, dao động từ 83,9 đến 97,3% sau giảm dần tăng thời gian biến nạp phút, tỷ mẫu sống đạt 47,3 đến 82,3% (Bảng 3.9) Hiệu biến nạp gen GUS cao lây nhiễm khoảng phút, tỷ lệ GUS+ đạt 90,2 đến 94,2% tùy giống lúa (Bảng 3.9, hình 3.7) Kết nghiên cứu cho thấy thời gian lây nhiễm thích hợp giống lúa Khang dân, Đồn kết, Bao thai Nếp 87 khoảng phút A B C D Hình 3.7 Biểu gen GUS sau phút lây nhiễm với vi khuẩn giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 42 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến hiệu chuyển gen Giống Thời gian Số mẫu lây nhiễm phút Khang dân Bao thai Đoàn kết Nếp 87 Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu GUS+ (mẫu) 150 89,6 42,3d 97,3 43,6e 86,3 23,3d 96,3 31,2e phút 150 91,6 53,7c 87,7 48,3d 97,2 89,7a 95,7 97,3a phút 150 83,9 91,3a 92,9 89,7a 92,3 90,2a 89,3 94,2b phút 150 75,2 83,3b 82,3 77,3b 84,7 75,3b 69,3 87,7c phút 150 65,1 84,7b 78,9 69,6c 77,3 39,2c 47,3 55,3d Ghi chú: a, b, c nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích oneway ANOVA Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,01 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen Thời gian đồng nuôi cấy thời gian sau mẫu lây nhiễm với vi khuẩn tiếp tục nuôi mơi trường đặc có bổ sung chất dẫn dụ AS để kích thích vi khuẩn xâm nhiễm vào tế bào mô Thời gian đồng nuôi cấy từ đến ngày, sau mẫu chuyển sang mơi trường loại bỏ vi khuẩn chọn lọc tế bào chuyển gen Hiệu chuyển gen xác đinh thông qua gen thị GUS Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ GUS+ cao dao động từ 78,2 đến 90,8% sau ngày đồng ni cấy Trong giống Nếp 87 có tỷ lệ GUS+ đạt 90,8%, giống Khang dân, Bao Thai Đoàn kết đạt 80,3; 78,2 87,3% (Bảng 3.10, hình 3.8) Tuy nhiên kết cho thấy tỷ lệ mẫu chết giảm mạnh ngày đồng nuôi cấy thứ Điều chứng tỏ thời gian đồng nuôi cấy ngày cho hiệu chuyển gen cao giống lúa nghiên cứu 43 Bảng 3.10 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen Thời gian đống nuôi cấy Giống Số Khang dân Bao thai Đoàn kết Nếp 87 mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ lây mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu nhiễm sống GUS+ sống GUS+ sống GUS+ sống GUS+ (%) (mẫu) (%) (mẫu) (%) (mẫu) (%) (mẫu) ngày 150 96,7 26,5e 92,4 46,5d 97,2 33,7d 98,0 43,1e ngày 150 95,7 48,7d 98,7 68,7c 94,3 57,9c 96,3 78,3c ngày 150 92,3 80,3a 91,3 78,2a 89,1 87,3a 95,6 90,8a ngày 150 84,7 75,6b 86,7 73,1b 76,5 77,4b 88,7 84,5b ngày 150 74,1 57,3c 44,2 67,2c 65,8 77,2b 76,6 70,5d Ghi chú: a, b, c nhóm khác có ý nghĩa theo phương pháp phân tích oneway ANOVA Tukey HSD, mức ý nghĩa α=0,01 A B C D Hình 3.8 Biểu gen GUS sau ngày đồng nuôi cấy giống Khang dân (A), Bao thai (B), Đoàn kết (C) Nếp 87 (D) 3.2.6 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc chuyển gen Để chọn lọc tế bào chuyển gen, mô sẹo sau biến nạp chuyển sang môi trường chọn lọc tế bào mang gen Mẫu mơ sẹo chọn lọc mơi trường có chứa chất chọn lọc hygromycin nồng độ khác Sau 28 ngày chọn lọc tỷ lệ mô sẹo kháng hygromycin thống kê bảng 3.11 Kết cho thấy nồng độ hygromycin thấp (5 mg/l) tỷ lệ mơ sẹo sống sót cao (78 đến 96,3%, bảng 3.10 hình 3.9) Tỷ lệ mơ sẹo kháng hygromycin giảm dần tăng nồng độ từ 10 đến 44 25mg/l Ở nộng độ cao (25mg/l) tỷ lệ mô sẹo sống sót (4,1 đến 14,5%, Bảng 3.11, hình 3.9) Tỷ lệ kháng từ 20,7 đến 28,7% nồng độ hygromycin 20 mg/l nồng độ thích hợp để chọn lọc tế bào chuyển gen giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết Nếp 87 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ hygromycin đến hiệu chọn lọc mô sẹo chuyển gen Tỷ lệ kháng hygromycin giống lúa Nồng độ Số mẫu hygromycin chọn lọc Khang dân Bao thai mg/l 90 86,7 96,3 82,1 78,0 10 mg/l 90 75,7 47,6 64,3 66,3 15 mg/l 90 52,3 42,1 29,7 35,6 20 mg/l 90 20,7 25,4 26,2 28,7 25 mg/l 90 4,1 14,5 5,2 6,6 Đồn kết (A) (C) Nếp 87 (B) (D) Hình 3.9 Chọn lọc tế bào chuyển gen môi trường hygromycin 10mg/l (A), 15 mg/l (B), 20 mg/l (C) 25 mg/l (D) 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu khả tái sinh in vitro khả chuyển gen giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết Nếp 87 cho thấy: Về khả tái sinh in vitro - Nồng độ NaOCl 3% thích hợp để khử trùng hạt lúa thời gian 25 phút Tỷ lệ khử trùng mẫu từ 81 đến 92% tùy giống: Đoàn kết 81%; Bao thai 84%; Khang dân 87%; Nếp 87 92% - Môi trường MS + 30g đường/l + 7g agar/lít + 2mg 2,4-D/l, pH 5,6 cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao giống lúa từ 78 đến 92% Trong Nếp 87 (92%), Khang Dân (91%), Bao Thai (82%), Đồn kết (78 %) Mơ sẹo có màu vàng, độ đồng cao - Khả tái sinh in vitro từ mô sẹo môi trường MS + 100 mg/l myoinostol + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,5 mg/l kinetin cho tỷ lệ tái sinh chồi cao giống Nếp 87 (70%), tiếp đến giống Bao Thai (63%), Đoàn Kết (62%) Khang Dân (58%) - Khả tái sinh in vitro từ mô sẹo môi trường MS + 100 mg/l myoinostol + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar bổ sung 1,0 mg/l BAP cho tỷ lệ tái sinh chồi cao giống Nếp 87 (83%), tiếp đến giống Khang dân (79%), Bao Thai (79%), Đoàn Kết (78%) Về khả chuyển gen - Mô sẹo sau ngày tuổi thích hợp cho chuyển gen giống lúa Bao thai, Khang dân, Đoàn kết Nếp 87 - Chủng vi khuẩn LBA4404 cho hiệu chuyển gen tốt giống lúa nghiên cứu Tỷ lệ mẫu sống từ 89,9% đến 95,7%, hiệu biến nạp gen GUS 84,3 đến 91,7% - Môi trường biến nạp bổ sung AS 100µM cho hiệu cao giống lúa với tỷ lệ từ 36,7 đến 51,3%, mức độ biểu gen tốt - Hiệu biến nạp gen GUS cao lây nhiễm khoảng phút, tỷ lệ GUS+ đạt 90,2 đến 94,2% 46 - Thời gian đồng nuôi cấy ngày cho tỷ lệ GUS+ cao dao động từ 78,2 đến 90,8% Trong giống Nếp 87 có tỷ lệ GUS+ đạt 95,6%, giống Khang dân, Bao Thai Đoàn kết đạt 80,3; 78,2 87,3% - Nồng độ hygromycin 20mg/l thích hợp để chọn lọc tế bào chuyển gen giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết Nếp 87, hiệu chọn lọc 20,7 đến 28,7% Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả tiếp nhận gen tiến hành chuyển gen vào giống lúa nghiên cứu 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nhà xuất Nông nghiệp 72-74 Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003) Chuyển gen thơng qua Agrobacterium tumefaciens vào giống lúa C71 Tạp chí CNSH, 1(2): 219-226 Nguyễn Xuân Dũng (2015) Kết nghiên cứu chọn tạo giống lúa nếp thoem ngắn ngày N31 Hội thảo quốc gia khoa học trồng lần thứ Phan Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà (2017) Quy trình chuyển gen ex vitro vào đoạn thân mía thơng qua Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15 (4A): 1-8, 2017 Phan Thị Hương (2014) Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro lúa Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1249-1257 Hoàng Thị Giang cộng (2015), Hoàn thiện quy trình chuyển gen cho giống lúa taichung 65 thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, tập 13, số 5: 764-773 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Tràng Hiếu, Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Thuỳ Linh (2013) Thiết kế vector mang miRNA nhân tạo ức chế đặc hiệu biểu gen MPG1 nấm đạo ôn (Magnaporthe grisea) gây bệnh lúa Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 6: 857-867 Nguyễn Đức Thành, (2003), Chuyển gen thực vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Tổng cục thống kê (2018): https://www.gso.gov.vn II Tài liệu Tiếng Anh 10 Cao, Duan, McElroy, D and Wu, R 1992 Regeneration of herbicide resistant transgenic rice plants following microprojectile-mediated transformation of suspension culture cells Plant Cell Reproduction 11:586-591 48 11 Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H (1992) Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens Plant Cell Physiol., 33: 577-583 12 Cheng M, Fry JE, Pang SZ, Zhou HP, Hironaka CM, Duncan DR, Conner TW, Wan YC (1997) Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens Plant Physiol 1997, 115:971-980 13 Chopita Sakulsingharoj, Poonsri Inta, Roypim Sukkasem, Saengtong Pongjaroenkit, Srimek Chowpongpang, Varaporn Sangtong (2014) Overexpression of OSB2 gene in transgenic rice up-regulated expression of structural genes in anthocyanin biosynthesis pathway Thai J Genet., 7(3): 173182 14 Christou P., Ford, T.L and Kofron, M 1991 Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos Bio/Technology 9:957- 962 15 Datta, K., Tu, J.M., oliva, N., Ona, L., Velazhahan, R., Mew, T.W., Muthukrishnan, S & Datta, S.K (2001) Enhanced resistance to sheath blight by consititutive expression of infection-related rice chitinase in transgenic elite indica rice cultivars Plant Sci 160, 405-414 16 Diah Rachmawati1,2, Hiroyuki Anzai1,* (2006) Studies on callus induction, plant regeneration and transformation of Javanica rice cultivars Plant Biotechnology 23, 521–524 17 Enrico Scarpella, Saskia Rueb and Annemarie H Meijer (2003) The RADICLELESS1 gene is required for vascular pattern formation in rice Development, 130: 645-658 18 FAOSTAT | © FAO Statistics Division 2014| 07 February 2014 19 Fujimura T, Sakurai M, Akagi H, Negishi T, Hirose A (1985) Regeneration of rice plants from protoplasts Plant Tissue Culture Lett 2:74–75 20 Gould, J., Devery, M., Heeegawa, O., Ulian, E.C., Peterson, G and Smith, R.H (1991) Transformation of Zea mays L using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex Plant Physiol 95, 426-434 49 21 Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T- DNA Plant J., 6: 271-282 22 Hiei Y., Komari T (2008) Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed Nat Protocols, 3: 824-834 23 Hong, S.-W., Aoki, T., Kitano, H., Datoh, H and Bagato, Y (1995) Phenotylic diversity of 188 rice embryo mutants Dev Genetics 16, 298-310 24 Hoa T.T.C., Bahagiawati A and Hodges T.K (1999) Agrobacterium - mediated transfomation of Indica rice cultivars grown in Vietnam Omonrice, 7: 70-79 25 Inukai Y., Sakamoto T., Ueguchi-Tanaka M., Shibata Y., Gomi K., Umemura, I., Hasegawa Y., Ashikari M., Kitano H., and Matsuoka M (2005) Crown rootless1, which is essential for crown root formation in rice, is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling Plant Cell, 17:1387-1396 26 Juliano BO (2003) Rice chemistry and quality Manila Philippines: Philippine Rice Research Institute 27 Li, X.-Q., Liu, C.-N., Ritchie, S.W., Peng, J.-Y., Gelvin, S.B and Hodges, T.K (1992) Factors influencing Agrobacteriummediated transient expression of gusA in rice Plant Mo/ Biol 20, 1037-1048 28 Y J Lin, Qifa Zhang (2005) Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice Plan Cell Rep 2005 jan; 23(8);540-7 29 Murashige T, Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture Physiol Plant 1962, 15: 473-497 30 Namiko Satoh, Soon-Kwan hong, Asuka Nishimura, Makoto Matsuoka, Hidemi Kitano and Yasuo Nagato (1999) Initiation of shoot qpical meristem in rice: characterization of four SHOOTLESS genes Development 126 3629-3636 (1999) 31 Ozawa K (2009) Establishment of a high efficiency Agrobacterium - mediated transformation system of rice (Oryza sativa L.) Plant Science 176: 522-527 50 32 Rained, D M., Bottino, P., Gordon, M P and Nester, E W (1990) Agrobecterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.) Bio/Techno/ogy, 8, 33-38 33 Ramesh, T., Snehalatha, Y., Sankar, K and Qamar Qureshi (2009) Food habits and prey selection of tiger and leopard in Mudumalai Tiger Reserve, tamil Nadu, India J Sci Trans Environ Technology 2(3): 170-181 34 Z.Rahman, Z A.Seman, S.Roowi, N.Basirun and S Subramaniam (2010) Production of transgenic Indica rice (Oryza sativa L.) Cv MR 81 via particle bombardment system Emir J Food Agric 2010 22 (5): 353-366 35 Prasad B.D., Jha S and Chattoo B.B (2008) Transgenic indica rice expressing Mirabilis jalapa antimicrobial protein (Mj-AMP2) shows enhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe oryzae Plant Science 175: 364-371 36 Shimamoto K, Terada R, Izawa T, Fujimoto H Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts Nature 1989; 338 (6212):274–6 37 Verma Rohit, Yatan Pal Singh Balhara, Chandra Shekhar Gupta (2011) Gender differences in stress response: Role of developmental and biological determinants Industrial Psychiatry Journal, Volume: 20, 4-10 38 Asanori Yara, Motoyasu Otani, kensuke Kusumi, Osamu Matsuda, Takiko Shimada and Koh IBA (2001) Production of Transgenic Japonica Rice (Oryza sativa) Cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium – Mediated Method Plant Biotecnology, 18(4), 305-310 39 Zhang HM, Yang H, Rech EL, Gold TJ, Davis AS, Mulligan BJ, Cocking EC, Davey MR (1988) Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplast Plant Cell Rep 7: 379–383 (1988) 40 Zhong-xun Luo and Ray Wu (1989) A Simple Method for the Transformation of Rice Via the Pollen-Tube Pathway Plant Molecular Biology Reporter Volume 7(1) 1989 : 69-77 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH MƠ TẢ QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY LÚA IN VITRO PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG NI CẤY Mơi trường N6 STT Thành phần N6 Macro 20x N6 Micro 1000X FeSO4 EDTA Iron 100x N6 Vitamins 100x(mg/l) Lượng lấy g/l (ml) KNO3 56,6 NH4NO3 9,26 KH2 PO4 8,00 MgSO4.7H2O 3,70 CaCl2.2H2O 3,32 MnSO4.4H2O 4,40 H3 BO3 1,60 ZnSO4.7H2O 1,50 KI 0.80 FeSO4.7H2O 2,78 Na2EDTA 3,72 Myo-inositol 10 Glycine 200 Thiamine-HCl 100 Nicotinic acid 50 50 10 10 Môi trường MS STT Thành phần g/l Lượng lấy (20x) (ml) KNO3 1900 20 NH4NO3 1650 20 KH2 PO4 170 10 MgSO4.7H2O 370 10 CaCl2.2H2O 440 10 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 H3 BO3 0,3 MnSO4.H2O 0,76 ZnSO4.7H2O 0,2 KI 0,075 Na2MoO4.2H2O 0,025 CuSO4 0,0025 CoCl2.6H2O 0,0025 Myo-inositol 10 Nicotinic acid 0,1 Pyridoxin-HCl 0,1 Thiamin-HCl 10 10 20 PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG NUÔI VI KHUẨN YEP Thành phần Khối lượng (g/l) Bacto-peptone 10 Yeast-extract NaCl Agar 12 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG X – GLUC (100ml) Hoá chất Lượng lấy K3(Fe(CN)6 0,0165g K4(FeCN)6 0,211g X - Gluc 100mg Na3PO4 115 mM ... ? ?Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? ?? Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa xây. .. tài tạo sở lý luận cho vi? ??c nghiên cứu khả tái sinh in vitro số giống lúa, xây dựng hồn thiện quy trình nghiên cứu chuyển gen số giống lúa Vi? ??t Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. .. NGUYỄN VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số ngành: 42 02