TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN

Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007. Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát triển các phƣơng pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã đƣợc phát triển nhƣ những phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trƣờng. Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Nội dung nghiên cứu 1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu. 2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. 3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS LÊ ĐÌNH ĐƠN TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09 / 2007 LỜI CẢM ƠN Thành kính ghi ơn ơng bà, cha mẹ nuôi nấng, dạy bảo trƣởng thành nhƣ ngày hôm nay, ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt q trình học tập trƣờng Tơi xin chân thành cám ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trƣờng Thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn động viên thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Thầy Zhang Liqun Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc cung cấp mẫu vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 tài liệu phục vụ cho thí nghiệm Ban giám đốc anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh hƣớng dẫn chia sẻ tơi khó khăn thời gian thực khóa luận Anh Nguyễn Văn Lẫm nhiệt tình giúp đỡ tơi hoàn thành luận văn Tất anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 giúp đỡ động viên suốt năm học nhƣ thời gian thực khóa luận Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2007 Sinh viên Trần Nguyễn Thúy An iii TÓM TẮT Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực Địa điểm: trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007 Pseudomonas fluorescens tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều chúng có khả kháng nấm mạnh có phổ kí chủ rộng Việc phát triển phƣơng pháp nhạy để quan sát tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens biofilm hay rễ trồng đóng vai trị quan trọng muốn nghiên cứu hệ thống Đáp ứng nhu cầu đó, gần marker phân tử đƣợc phát triển nhƣ phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu phân bố, quần thể hoạt tính chuyển hóa vi sinh vật mục tiêu môi trƣờng Trong số marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đƣợc chứng tỏ công cụ hữu hiệu Những dịng Pseudomonas fluorescens đƣợc đánh dấu marker GFP dễ dàng quan sát phát qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc không cần thêm vào chất ngoại sinh Nội dung nghiên cứu Chọn lọc dịng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh môi trƣờng KB có khả kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu Khảo sát điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần Thực PCR để kiểm tra diện gene gfp vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau tiếp hợp Kết đạt đƣợc Chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần iv SUMMARY Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, “Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating” This subject was conducted at Nong Lam University from March to August in 2007 Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent because of their strongly antifungal ability and their broad host range The development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these systems In response to this problem, novel molecular markers have been developed recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic activity of target microorganisms in a certain environment Among them, the green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the most powerful tool The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour Researching contents are Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce under short wave length ultraviolet light Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens after conjugation Obtaining results The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating has been obtained v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa acid amin bp base pair DNA Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid F Fertility GFP Green Fluorescent Protein Hfr High frequency recombinance IS Insert sequence kb Kilo base kDa Kilo dalton MCS Multi cloning site Nm Nano metre PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Tn Tranposon UV Ultraviolet (light) w/v Weight for volume KB King’s B NST Nhiễm sắc thể TGE Transposable genetic element dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate LB Luria – Bertain vi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế lai F+ F- Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F+ Hình 2.3 Cơ chế lai Hfr F- Hình 2.4 Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr Hình 2.5 Cơ chế lai F’và F- Hình 2.6 Cấu trúc trình tự chèn 11 Hình 2.7 Cấu trúc transposon .12 Hình 2.8 Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp thành phần 15 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động thiết bị electroporation 17 Hình 2.10 Quy trình biến nạp phƣơng pháp CaCl2 18 Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP 24 Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp 29 Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens mơi trƣờng KB 36 Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 .38 Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành môi trƣờng M9 .39 Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 .40 Hình 4.5 Đối chứng môi trƣờng M9 41 Hình 4.6 Kết đối chứng .45 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc tính nguồn gốc số dịng vi khuẩn plasmid liên quan thí nghiệm 30 Bảng 4.1 Kết kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 34 Bảng 4.2 Kết kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 35 Bảng 4.3 Nguồn gốc dịng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu 36 Bảng 4.4 Kết đếm số khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 thay đổi theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37 Bảng 4.5 Kết đếm số khuẩn lạc hình thành môi trƣờng M9 thay đổi theo tỉ lệ vi khuẩn 38 Bảng 4.6 Kết đếm số khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ nuôi chung môi trƣờng KB 40 viii MỤC LỤC Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 1.2 1.3 Đặt vấn đề Mục đích Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Những chế chuyển gene vi khuẩn 2.1.2.1 Biến nạp (transformation) 2.1.2.2 Tải nạp (transduction) 2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) 2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả chuyển vị (transposable genetic element_TGE) 10 2.1.3.1 Đặc tính yếu tố di truyền có khả chuyển vị 11 2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả chuyển vị 11 2.2 2.3 Plasmid 13 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid 15 2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) 15 2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp 16 2.3.2.1 Phƣơng pháp 16 2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride 18 2.5 Phòng trừ sinh học bệnh tác nhân phòng trừ sinh học 19 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20 2.5.1.2 Các nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 21 2.6 Protein GFP 24 2.6.1 Cấu trúc đặc điểm 24 2.6.2 Tình hình nghiên cứu gene gfp 25 Chƣơng 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 3.2 Thời gian địa điểm thực 28 Vật liệu hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 28 3.2.1 Vật liệu 28 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp 28 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 29 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 29 3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng nuôi cấy vi khuẩn 31 3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng nghiên cứu 31 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 Chƣơng 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 4.1.1 Kết 34 Kết kiểm tra tính kháng kháng sinh vi khuẩn 34 ix 4.1.2 Kết kiểm tra khả phát sáng môi trƣờng KB 36 4.1.3 Kết khảo sát điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần 37 4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37 4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn 38 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi chung môi trƣờng KB 39 4.1.3.4 Kết đối chứng 40 4.2 Thảo luận 41 4.2.1 Các thông số tối ƣu cho trình tiếp hợp 41 4.2.2 Cơ chế trình tiếp hợp ba thành phần 41 4.2.3 Môi trƣờng tối ƣu cho chọn lọc 43 4.2.4 Kết đối chứng 42 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44 Chƣơng 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 5.2 Kết luận 47 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 51 x đạt yêu cầu hình thành khuẩn lạc rời rạc để cấy điểm sang môi trƣờng M9 nên chúng tơi khơng thực lại thí nghiệm Xử lý thống kê kết đếm khuẩn lạc, nhận thấy khác biệt tỉ lệ ý nghĩa mặt thống kê Nói cách khác tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận thay đổi ảnh hƣởng không lớn đến hiệu tiếp hợp A C B D E Hình 4.3: Khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 Tỉ lệ vi khuẩn cho : vi khuẩn hỗ trợ : vi khuẩn nhận (A) = : : 1, (B) = : : 2, (C) = : : 3, (D) = : : 4, (E) = : : 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi chung môi trƣờng KB Lập lại thí nghiệm nhƣ trên, thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 20 tiếng, tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận 1: 1: 3, thông số khác giữ nguyên nhƣng thay đổi nhiệt độ ủ nuôi chung môi trƣờng KB lần lƣợt 240C, 280C, 320C Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ ni chung mơi trƣờng KB đƣợc trình bày bảng 4.6 39 Bảng 4.6 Kết đếm số khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ nuôi chung môi trƣờng KB Nhiệt độ ủ Số khuẩn lạc Lần Lần Lần 240C 688 720 504 280C 816 1000 816 320C 536 568 456 B A C Hình 4.4: Khuẩn lạc hình thành mơi trƣờng M9 (A) ủ 240C, (B) ủ 280C, (C) ủ 320C Xử lý thống kê kết đếm khuẩn lạc cho thấy khác biệt có ý nghĩa với xác suất sai lầm P = 0.011 Đối với dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 nhiệt độ ủ nuôi chung môi trƣờng KB 280C cho khả tiếp hợp cao nhất, nhiệt độ tối ƣu cho phát triển Pseudomonas fluorescens 4.1.3.4 Kết đối chứng Thực quy trình tiếp hợp tƣơng tự nhƣ riêng dòng vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận vi khuẩn hỗ trợ không trộn chung chúng với Kết môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml chloramphenicol 20µg/ml) nhƣ sau: dịng vi khuẩn cho có chứa plasmid pUT-gfp khơng hình thành khuẩn lạc, cịn dịng vi khuẩn hỗ trợ có chứa plasmid pRK600 dòng vi khuẩn nhận chƣa tiếp hợp sống đƣợc môi trƣờng 40 A B C Hình 4.5: Đối chứng mơi trƣờng M9 (A) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, (B) E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600, (C) Pseudomonas fluorescens 1.8 4.2 Thảo luận 4.2.1 Các thơng số tối ƣu cho q trình tiếp hợp Thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn môi trƣờng LB 20 tiếng cho khả tiếp hợp cao Tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận thay đổi ảnh hƣởng không lớn đến hiệu tiếp hợp Điều giải thích mơi trƣờng chọn lọc chúng tơi sử dụng chƣa tối ƣu nên chƣa thể thấy đƣợc khác biệt tỉ lệ dòng vi khuẩn khác Nhiệt độ ủ nuôi chung môi trƣờng KB 280C cho khả tiếp hợp cao 4.2.2 Cơ chế trình tiếp hợp ba thành phần Ba dòng vi khuẩn đƣợc trộn vào hỗn hợp tiếp hợp theo tỉ lệ thích hợp E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid hỗ trợ pRK600 tiếp hợp thành công với Pseudomonas fluorescens khơng có vùng tƣơng đồng, khơng thể trì Pseudomonas fluorescens có điểm khởi đầu chép colE1 Theo Cameron (2007) gene tra+ pRK600 gây nên hình thành pili, kéo vi khuẩn cho E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp lại gần, làm tan vách tế bào vi khuẩn, hình thành cầu nguyên sinh chất Tra+ gây đứt gãy DNA 41 oriT (mob) làm pRK600 duỗi Một mạch đơn pRK600 đƣợc chuyển vào thể cho E.coli DH5α Lúc có plasmid thể cho Gene tra+ pRK600 lại gây nên hình thành pili, kéo thể nhận Pseudomonas fluorescens lại gần, hình thành cầu nối nguyên sinh chất Đồng thời tra+ gây đứt gãy DNA oriT RP4, khởi đầu chuyển pUT-gfp vào thể nhận Trong thể nhận, tái tổ hợp xảy pUT-gfp DNA gene thể nhận nhờ hệ thống transposon mini-Tn5 Các thể tái tổ hợp sau đƣợc chọn lọc mơi trƣờng có chứa kháng sinh kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml chloramphenicol 20µg/ml 4.2.3 Kết đối chứng Dịng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pUT-gfp khơng mọc đƣợc mơi trƣờng M9 chúng khơng kháng đƣợc với chloramphenicol (20µg/ml) có mơi trƣờng Dịng vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) có chứa plasmid pRK600 kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml), ampicillin (50µg/ml) chloramphenicol (20µg/ml) nên mơi trƣờng M9 chúng tơi sử dụng khơng loại bỏ đƣợc dịng Dịng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 khơng kháng đƣợc với kanamycin (50µg/ml) nhƣng ni riêng dịng vi khuẩn qua bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp nêu chúng hình thành khuẩn lạc mơi trƣờng M9 (có chứa kanamycin 50µg/ml, ampicillin 50µg/ml chloramphenicol 20µg/ml) Để loại trừ trƣờng hợp kháng sinh kanamycin bị hoạt tính bổ sung vào mơi trƣờng, chúng tơi cấy trực tiếp dịng Pseudomonas fluorescens 1.8 lên môi trƣờng M9 phƣơng pháp cấy điểm mà khơng ni qua bƣớc nhƣ quy trình tiếp hợp Kết vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 không mọc đƣợc môi trƣờng M9 Nhƣ vậy, cho quy trình tiếp hợp, ni chung mơi trƣờng KB có chế xảy làm cho dịng vi khuẩn nhận dù khơng nhận đƣợc plasmid mọc đƣợc mơi trƣờng chọn lọc có kháng sinh 42 4.2.4 Mơi trƣờng thích hợp cho chọn lọc Mơi trƣờng M9 có chứa loại kháng sinh kanamycin, ampicillin, chloramphenicol mơi trƣờng chọn lọc thích hợp nghiên cứu Vì M9 loại mơi trƣờng thích hợp cho Pseudomonas E.coli nên chọn lọc phải dựa vào tính kháng kháng sinh dịng vi khuẩn Điều gây nhiều bất lợi Thứ phải kiểm tra chặt chẽ tính kháng kháng sinh dòng vi khuẩn nhận Dòng phải kháng đƣợc với loại kháng sinh mà dòng vi khuẩn cho vi khuẩn hỗ trợ khơng kháng đƣợc Dịng lại phải dòng nhạy với kanamycin ampicillin để chúng khơng nhận đƣợc plasmid khơng mọc đƣợc mơi trƣờng chọn lọc Vì phải đáp ứng khắt khe khả kháng kháng sinh nên dịng Pseudomonas có khả kháng kháng sinh phù hợp để chọn lọc thƣờng khơng phải dịng đối kháng mạnh với nấm gây bệnh không phát sáng mạnh môi trƣờng KB Thứ hai kháng sinh sau đƣợc bổ sung vào môi trƣờng bị phân hủy nhanh chóng nhiệt độ ánh sáng Do chọn lọc cần sử dụng nồng độ kháng sinh cao nên tốn kém, khơng biết đƣợc xác nồng độ kháng sinh cịn mơi trƣờng Để khắc phục vấn đề trên, đề nghị giải pháp: (i) Chúng ta sử dụng loại mơi trƣờng chọn lọc riêng cho Pseudomonas Có nhiều loại mơi trƣờng chọn lọc cho Pseudomonas dựa loại sắc tố chúng tiết mơi trƣờng Ví dụ nhƣ mơi trƣờng có potassium sulphate magnesium chloride Hai chất giúp tăng cƣờng khả tạo pyocyanin Đây loại sắc tố xanh lục ngả sang xanh Pseudomonas tiết môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc Dựa vào sắc tố chọn lọc Pseudomonas, loại bỏ dịng E.coli (ii) Bổ sung vào quy trình tiếp hợp nêu bƣớc cấy điểm sang môi trƣờng KB Khi khuẩn lạc hình thành, đem chiếu dƣới tia UV để xác định loại bỏ dòng E.coli 43 Nhƣ vậy, dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc chọn làm vi khuẩn nhận cần đáp ứng điều kiện không kháng với kanamycin, môi trƣờng chọn lọc cần bổ sung loại kháng sinh để chọn lọc dòng Pseudomonas fluorescens nhận đƣợc plasmid 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 Để chứng tỏ nhận định thực lại thí nghiệm chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với quy trình đƣợc sửa đổi nhƣ sau: Ni riêng dịng vi khuẩn tủ lắc định ôn 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, 20 o Vi khuẩn cho: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp 5ml môi trƣờng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) kanamycin (50 µg/ml) o Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 ml mơi trƣờng LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml) o Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 5ml LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml) Hút lần lƣợt dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1:1:3 = 300µl: 300 µl: 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút 200C phút Thu sinh khối, rửa lại với ml nƣớc cất vô trùng Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc cất vơ trùng hịa tan sinh khối, đem vortex kỹ Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB agar, cách sử dụng micropipet nhỏ giọt (khoảng 10µl ) lên môi trƣờng, ủ 24 28oC Sau khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc cất vơ trùng vào đĩa petri hịa tan khuẩn lạc Pha loãng dịch khuẩn Tiếp tục hút khoảng 30 µl dịch vi khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml) trang mặt đĩa, ủ 48 280C 44 Chọn khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tăm hấp, sấy cấy điểm sang đĩa mơi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml), ủ 24 280C Từ đĩa M9 tiếp tục cấy điểm khuẩn lạc sang đĩa môi trƣờng KB, giữ vị trí khuẩn lạc nhƣ mơi trƣờng M9 Ủ 24 280C Đối chứng đƣợc thực cách ni riêng dịng vi khuẩn cho, nhận hỗ trợ theo quy trình đƣợc trình bày mục 4.2.5 Kết đối chứng đƣợc trình bày hình 4.6 A B C Hình 4.6: Kết đối chứng (A) dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chưa tiếp hợp, (B) dịng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid hỗ trợ pRK600, (C) dịng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pUT-gfp Kết đối chứng cho thấy dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 chƣa tiếp hợp không mọc đƣợc môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml) Nhƣ vậy, dịng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận tiếp hợp vi khuẩn hỗ trợ Các dòng vi khuẩn sau hình thành khuẩn lạc mơi trƣờng KB đƣợc đem chiếu dƣới tia UV Những dòng phát sáng dòng Pseudomonas fluorescens tiếp hợp, cịn dịng khơng phát sáng dịng vi khuẩn E.coli cho hỗ trợ Chỉ chọn dòng phát sáng, loại bỏ dịng khơng phát sáng Nhƣ vậy, qua hai bƣớc chọn lọc: chọn lọc kháng sinh chọn lọc dựa vào khả phát sáng mơi trƣờng KB, thu đƣợc dịng Pseudomonas fluorescens tiếp hợp Do đó, chúng tơi kết luận quy trình đƣợc 45 trình bày mục 4.2.5 quy trình tối ƣu cho việc chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần So với nghiên cứu Đỗ Thị Ngọc Hân (2006), chúng tơi tìm phƣơng pháp chọn lọc thích hợp để thu nhận đƣợc dòng Pseudomonas fluorescens tiếp hợp Với quy trình tiếp hợp mà chúng tơi phát triển việc chọn lọc dịng vi khuẩn nhận thích hợp để làm đối tƣợng nghiên cứu dễ dàng nhiều khơng phải phụ thuộc q chặt chẽ vào tính kháng kháng sinh dòng vi khuẩn nhận Tuy nhiên, hạn chế đề tài không thực PCR để kiểm tra diện gene gfp vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau tiếp hợp Và hạn chế máy móc không thực đƣợc việc quan sát tế bào vi khuẩn dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang để chọn dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tiếp hợp có biểu phát sáng mạnh Chúng tơi đƣa quy trình tối ƣu để chuyển DNA plasmid vào vi khuẩn phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần, tạo tiền đề để so sánh hiệu chuyển gene phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với phƣơng pháp biến nạp cách xử lý với calcium chloride mà Phạm Duy Huỳnh Văn Thái (2005) trình bày nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α”, góp phần chọn phƣơng pháp thích hợp để thực mục đích chuyển gene mong muốn vào tế bào vi khuẩn để sử dụng cho nghiên cứu 46 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tơi khảo sát tìm quy trình thích hợp để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần Quy trình khơng địi hỏi phải sử dụng nhiều loại kháng sinh để chọn lọc, dòng vi khuẩn nhận không cần đáp ứng điều kiện phải kháng với loại kháng sinh mà vi khuẩn cho vi khuẩn hỗ trợ không kháng đƣợc Do dễ dàng chọn đƣợc dịng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu Thay sử dụng nhiều loại kháng sinh dựa vào đặc điểm Pseudomonas fluorescens phát sáng môi trƣờng KB để phân biệt Pseudomonas fluorescens dòng vi khuẩn E.coli cho hỗ trợ Trong q trình tiếp hợp, ni chung dịng vi khuẩn môi trƣờng LB agar cho kết chọn lọc tốt nuôi chung môi trƣờng KB Cơ chế tƣợng chƣa giải thích đƣợc Hạn chế đề tài không thực đƣợc giai đoạn chạy PCR để kiểm tra diện gene gfp vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau tiếp hợp 5.2 Đề nghị Một số hƣớng phát triển đề tài: Chuyển gene phƣơng pháp điện biến nạp so sánh hiệu hai phƣơng pháp Thực PCR để kiểm tra diện gene gfp vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau tiếp hợp Quan sát dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang dịng Pseudomonas fluorescens chuyển gene gfp để chọn dịng có biểu phát sáng mạnh Khảo sát khả định cƣ Pseudomonas fluorescens rễ trồng 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Thị Ngọc Hân, 2006 Chuyển gene gfp (Green Fluorescent Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phương pháp tiếp hợp ba thành phần Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Duy Bình, 2004 Chọn lọc đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Rhizoctonia solani gây hại bơng vải Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nông Học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Thể, 2004 Chọn lọc sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh nấm Rhizoctonia solani Sclerotium rolfsii gây hại vải cà chua Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005 Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Phạm Mỹ Liên, 2004 Chọn lọc đánh giá dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đối kháng với nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh cà chua Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Nơng Học, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Bloemberg, G V., G A O’Toole, B J J Lugtenberg, and R Kolter 1997 Green Fluorescent Protein as a marker for Pseudomonas spp Applied and Environmental Microbiology 63: 4543-4551 Brown, T A 1995 Gene cloning: an introduction, 3rd ed Chapman and Hall, London, UK 48 Cameron, L 2007 Recombinant DNA technology Mbio 4570 Laboratory, 201 Buller Bldg, Canada de Lorenzo,V , M Herrero, U Jakubzik, and K N Timmis 1990 MiniTn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gram-negative eubacteria J Bacteriol 172: 6568-6572 Finan,T.M., B Kunkel, G.F de Vos, and E.R Signer 1986 Second symbiotic megaplasmid in Rhizobium meliloti carrying exopolysaccharide and thiamine synthesis genes J Bacteriol 167: 66-72 Grall, S and C Manceau 2003 Colonization of Vitis vinifera by a Green Fluorescence Protein-Labeled, gfp-Marked Strain of Xylophilus ampelinus, the Causal Agent of Bacterial Necrosis of Grapevine Applied and Environmental Microbiology 69(4): 1904–1912 Mayer, G 2007 Exchange of genetic information In Microbiology and Immunology On-line, Hunt, R.C http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/genetic%20ex.htm editor University of South Carolina School of Medicine Mergeay, M., and J Gerits 1978 F'-Plasmid Transfer from Escherichia coli to Pseudomonas fluorescens J Bacteriology 135: 18-28 Mølbak, L 2003 Conjugative plasmids and the transfer of mobile genetic elements among bacteria in plant rhizosphere environments PhDs thesis National Environmental Research Institute, Denmark 142 pp 10 Royston,C 1972 Molecular structure of bacterial plasmids Bacteriological Reviews 36: 361-405 11 Sawada,H., H Ieki, and I Matsuda 1995 PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains Applied and Environmental Microbiology 61: 828-831 49 12 Sepúlveda-Torres, L D C., N Rajendran, M J Dybas, C S Criddle 1999 Generation and initial characterization of Pseudomonas stutzeri KC mutants with impaired ability to degrade carbon tetrachloride Arch Microbiol 171: 424-429 13 Smith, A W., and B H Iglewsski 1989 Transformation of Pseudomonas aeruginosa by electroporation Nucleic Acids Res 17: 10509 50 PHỤ LỤC Công thức pha số mơi trƣờng dùng thí nghiệm Mơi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Tryptone 10g Bacto yeast extract 5g NaCl 10g Thêm nƣớc 1000ml Chuẩn độ pH=7.0 NaOH 1N Hấp khử trùng 1210C 20 phút Môi trƣờng KB (King’s B) agar Proteose peptone 20g Glycerol 15ml K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 1.5g Thêm nƣớc 1000ml Chuẩn độ pH=7.2 NaOH 1N Agar 15g Hấp khử trùng 1210C 20 phút Môi trƣờng M9 Na2HPO4.7H2O 6g KH2PO4 3g NaCl 0.5g NH4Cl 1g Thêm 950ml nƣớc Chuẩn độ pH=7.4 NaOH 1N 51 Bacto agar 15g Hấp khử trùng 1210C 20 phút, để nhiệt độ hạ xuống 600C thêm 10ml Glucose 20% đƣợc lọc 1ml CaCl2 0.1M hấp khử trùng 1ml MgSO4 1M hấp khử trùng 50 µl Thiamine 100 µg/ml đƣợc lọc Thêm nƣớc tới 1000ml Các dung dịch stock kháng sinh Pha dung dịch stock có nồng độ 100µg/µl Cân 100 mg kháng sinh Ampicillin cho vào 1ml nƣớc hấp vô trùng eppendorf 1,5 ml, trộn lọc qua đầu lọc 0.22 µm Dung dịch kháng sinh đƣợc chiết eppendorf 200µl Cất ống eppendorf dùng thƣờng vào tủ mát 50C, ống lại bảo quản tủ -200C, tất ôngg đƣợc bọc giấy bạc bảo quản tối Pha tƣơng tự cho Kanamycin Còn Chloramphenicol đƣợc pha tƣơng tự nhƣng thay nƣớc ethanol nguyên chất Vật liệu dùng để xem kính hiển vi Lam Lame Dầu soi kính Giấy lau kính Bảng xử lý số liệu thống kê theo phần mềm MINITAB Release 13.2 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Thời gian Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS Thoi gia 78091 39045 Error 35413 5902 Total 113504 F 6,62 52 P 0,030 Level 16 20 24 N 3 Pooled StDev = Mean 288,00 509,33 446,67 StDev 69,74 94,01 63,29 76,83 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( * ) + -+ -+ -+ 240 360 480 600 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Tỉ lệ vi khuẩn Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS Ti le VK 24453 6113 Error 10 26557 2656 Total 14 51010 Level 111 112 113 114 115 N 3 3 Pooled StDev = Mean 657,33 679,33 666,67 717,00 767,33 StDev 91,24 18,04 45,49 30,41 40,41 51,53 F 2,30 P 0,130 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) ( * -) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+ 630 700 770 840 One-way ANOVA: Số khuẩn lạc theo Nhiệt độ ủ Analysis of Variance for So khuan Source DF SS MS Nhiet 199054 99527 Error 56405 9401 Total 255460 F 10,59 P 0,011 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ -+ 24 637,3 116,6 ( * ) 28 877,3 106,2 ( * ) 32 520,0 57,7 ( * ) -+ -+ -+ -+ Pooled StDev = 97,0 400 600 800 1000 Saving file as: C:\Data\day du.MPJ 53 ... chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần Quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (theo... gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần Thực PCR để kiểm tra diện gene gfp vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau tiếp hợp Kết đạt đƣợc Chọn đƣợc dòng vi. .. dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần iv