Tối ưu quy trình chuyển gên gfp vào vi khuẩn Psendomonas flouresens

Tối ưu quy trình chuyển gên gfp vào vi khuẩn Psendomonas flouresens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN NGUYỄN THÚY AN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09 / 2007 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con trƣởng thành nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cám ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm cùng thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Thầy Zhang Liqun ở Đại Học Nông Nghiệp Trung Quốc đã cung cấp mẫu vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp, vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 và các tài liệu phục vụ cho thí nghiệm. Ban giám đốc cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hƣớng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tất cả các anh chị thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật Khoa Nông Học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Các bạn bè lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt những năm học cũng nhƣ thời gian thực hiện khóa luận. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh viên Trần Nguyễn Thúy An iv TÓM TẮT Đề tài “Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Trần Nguyễn Thúy An, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh thực hiện. Địa điểm: trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007. Pseudomonas fluorescens là tác nhân kiểm soát sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng kháng nấm mạnh và có phổ kí chủ rộng. Việc phát triển các phƣơng pháp nhạy để quan sát những tế bào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trong biofilm hay trên rễ cây trồng đóng vai trò quan trọng khi muốn nghiên cứu những hệ thống này. Đáp ứng nhu cầu đó, gần đây những marker phân tử mới đã đƣợc phát triển nhƣ những phƣơng pháp chuyên biệt để đánh dấu sự phân bố, quần thể và hoạt tính chuyển hóa của các vi sinh vật mục tiêu trong môi trƣờng. Trong số những marker này, green fluorescent protein (GFP) từ loài sứa Aequorea victoria đã đƣợc chứng tỏ là công cụ hữu hiệu nhất. Những dòng Pseudomonas fluorescens đƣợc đánh dấu bởi marker GFP có thể dễ dàng quan sát và phát hiện qua kính hiển vi phát huỳnh quang mà không cần phải phá hủy cấu trúc và cũng không cần thêm vào các cơ chất ngoại sinh. Nội dung nghiên cứu 1. Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích nghiên cứu. 2. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. 3. Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Kết quả đạt đƣợc Chọn đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Đạt đƣợc quy trình tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần. v SUMMARY Tran Nguyen Thuy An, Nong Lam university, Ho Chi Minh city, “Establishing an optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating”. This subject was conducted at Nong Lam University from March to August in 2007. Pseudomonas fluorescens is the most extensively studied biocontrol-agent because of their strongly antifungal ability and their broad host range. The development of sensitive methods for observing Pseudomonas fluorescens cells in a population in biofilms or in plant roots is of great importance for studying these systems. In response to this problem, novel molecular markers have been developed recently as specific methods for tracing the distribution, population and metabolic activity of target microorganisms in a certain environment. Among them, the green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria has proved to be the most powerful tool. The GFP-marked Pseudomonas fluorescens strain can be conveniently observed by using fluorescence microscopy to study their behaviour. Researching contents are 1. Selecting the Pseudomonas fluorescens strains which have strongly antifungal ability, appropriate antibiotic resistance and fluoresce under short wave length ultraviolet light. 2. Researching the optimal conditions to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating. 3. Performing PCR to confirm the gfp gene in Pseudomonas fluorescens after conjugation. Obtaining results The appropriate Pseudomonas fluorescens strains have been selected. The optimal protocol to transfer gfp gene into Pseudomonas fluorescens by triparental mating has been obtained. vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa acid amin bp base pair DNA Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid F Fertility GFP Green Fluorescent Protein Hfr High frequency recombinance IS Insert sequence kb Kilo base kDa Kilo dalton MCS Multi cloning site Nm Nano metre PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome binding site RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Tn Tranposon UV Ultraviolet (light) w/v Weight for volume KB King’s B NST Nhiễm sắc thể TGE Transposable genetic element dNTP deoxyribonucleotide_5_triphosphate LB Luria – Bertain vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế lai giữa F+ và F- . 7 Hình 2.2 Sự hình thành thể Hfr từ thể F+ 8 Hình 2.3 Cơ chế lai giữa Hfr và F- 8 Hình 2.4 Cơ chế hình thành thể F’ từ thể Hfr 8 Hình 2.5 Cơ chế lai giữa F’và F- 9 Hình 2.6 Cấu trúc một trình tự chèn 11 Hình 2.7 Cấu trúc transposon . 12 Hình 2.8 Cơ chế phƣơng pháp tiếp hợp 3 thành phần 15 Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của thiết bị electroporation . 17 Hình 2.10 Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp CaCl2 18 Hình 2.11 Cấu trúc protein GFP 24 Hình 3.1 Cấu trúc plasmid pUT-gfp . 29 Hình 4.1 Khuẩn lạc Pseudomonas fluorescens trên môi trƣờng KB 36 Hình 4.2 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 . 38 Hình 4.3 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 . 39 Hình 4.4 Khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 . 40 Hình 4.5 Đối chứng trên môi trƣờng M9 41 Hình 4.6 Kết quả đối chứng . 45 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Đặc tính và nguồn gốc một số dòng vi khuẩn và plasmid liên quan trong thí nghiệm 30 Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh kanamycin của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens . 34 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra tính kháng với kháng sinh chloramphenicol của một số dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 35 Bảng 4.3 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens thích hợp làm đối tƣợng nghiên cứu 36 Bảng 4.4 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn . 37 Bảng 4.5 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo tỉ lệ vi khuẩn 38 Bảng 4.6 Kết quả đếm số khuẩn lạc hình thành trên môi trƣờng M9 thay đổi theo nhiệt độ ủ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB . 40 ix MỤC LỤC Chƣơng 1 . 1 MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích . 2 1.3 Yêu cầu . 3 Chƣơng 2 . 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn . 4 2.1.1 Giới thiệu . 4 2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn 4 2.1.2.1 Biến nạp (transformation) 4 2.1.2.2 Tải nạp (transduction) 5 2.1.2.3 Tiếp hợp (conjugation) 7 2.1.3 Những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị (transposable genetic element_TGE) 10 2.1.3.1 Đặc tính của những yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị . 11 2.1.3.2 Các loại yếu tố di truyền có khả năng chuyển vị . 11 2.2 Plasmid . 13 2.3 Các phƣơng pháp thƣờng dùng để chuyển DNA plasmid . 15 2.3.1 Phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần (triparental mating) 15 2.3.2 Phƣơng pháp điện biến nạp 16 2.3.2.1 Phƣơng pháp 16 2.3.3 Phƣơng pháp Calcium chloride 18 2.5 Phòng trừ sinh học bệnh cây và tác nhân phòng trừ sinh học 19 2.5.1 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 20 2.5.1.1 Phân loại vi khuẩn Pseudomonas fluorescens . 20 2.5.1.2 Các nghiên cứu về vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 21 2.6 Protein GFP 24 2.6.1 Cấu trúc và đặc điểm . 24 2.6.2 Tình hình nghiên cứu về gene gfp . 25 Chƣơng 3 . 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện . 28 3.2 Vật liệu và hóa chất, dụng cụ thí nghiệm . 28 3.2.1 Vật liệu . 28 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp . 28 3.2.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 . 29 3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 29 3.2.2 Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy vi khuẩn . 31 3.2.3 Các loại dụng cụ, thiết bị dùng trong nghiên cứu 31 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 Chƣơng 4 . 34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 34 4.1 Kết quả . 34 4.1.1 Kết quả kiểm tra tính kháng kháng sinh của vi khuẩn . 34 x 4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB 36 4.1.3 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần 37 4.1.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 37 4.1.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn 38 4.1.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ khi nuôi chung trên môi trƣờng KB . 39 4.1.3.4 Kết quả đối chứng 40 4.2 Thảo luận 41 4.2.1 Các thông số tối ƣu cho quá trình tiếp hợp 41 4.2.2 Cơ chế quá trình tiếp hợp ba thành phần . 41 4.2.3 Môi trƣờng tối ƣu cho chọn lọc . 43 4.2.4 Kết quả đối chứng 42 4.2.5 Quy trình tiếp hợp tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Pseudomonas fluorescens 1.8 44 Chƣơng 5 . 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị . 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 48 PHỤ LỤC 51 [...]... E.coli vào vi khuẩn vùng rễ Cơ chế quá trình tiếp hợp Vi c truyền yếu tố F từ một vi khuẩn F+ sang một vi khuẩn F- đòi hỏi một sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào Khi nuôi chung với vi khuẩn F- các vi khuẩn F+ sẽ có phản ứng của giới tính đực kéo dài pili sinh dục của mình và bám vào một thụ thể của tế bào vi khuẩn nhận, sau đó pili co lại để kéo tế bào nhận lại gần Giai đoạn tiếp theo vi khuẩn cho... thể nhờ vào tốc độ tăng trƣởng nhanh chóng Thêm vào đó,vì vi khuẩn là những sinh vật đơn bội nên ngay cả những đột biến lặn cũng sẽ đƣợc biểu hiện Do đó, những đột biến trong quần thể vi khuẩn có thể gây ra vấn đề trong vi c chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn Mặt khác, vi khuẩn có những cơ chế chuyển gene sang vi khuẩn khác nên 1 đột biến xảy ra trong 1 tế bào có thể lan truyền sang các tế bào khác Chuyển. .. Khảo sát các điều kiện tối ƣu để chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần 1.3 Yêu cầu Chọn lọc đƣợc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có đặc tính đối kháng mạnh với nấm, phát sáng mạnh trên môi trƣờng KB và có khả năng kháng kháng sinh thích hợp cho mục đích thí nghiệm Xây dựng đƣợc quy trình tiếp hợp plasmid pUT -gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens... soát khả năng định cƣ của vi khuẩn đối kháng trên đất hay cây trồng Để đánh dấu vi khuẩn Pseudomonas fluorescens với marker GFP chúng ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp, trong đó tiếp hợp ba thành phần là một trong những phƣơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có chi phí thấp Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens... tiết ra enzyme làm tan vách tế bào của vi khuẩn nhận và truyền DNA của mình vào Hiện tƣợng tái tổ hợp sẽ diễn ra sau đó Quá trình truyền vật chất di truyền từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận xảy ra theo các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: sự tiếp xúc ngẫu nhiên xuất hiện vài phút sau khi trộn vi khuẩn với nhau Xác suất của sự tiếp xúc phụ thuộc vào nồng độ của hai nòi vi khuẩn Giai đoạn 2: là sự bắt cặp giữa... của vi khuẩn đƣợc xác nhận do chất kháng khuẩn pyrrolnitrin 22 Abdelzaher và Elnaghy (1998) cho biết bệnh thối rễ cây bông vải do nấm P.carolinianum ở Ai Cập đƣợc kiểm soát bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng P.fluorescens Vi khuẩn đối kháng cao với nấm trong thí nghiệm trên đĩa petri và hạn chế đƣợc bệnh khi áp dụng trong đất Hiệu quả kiểm soát khi trộn vi khuẩn vào đất cao hơn khi chủng vi khuẩn vào. .. ở vi khuẩn chỉ đi theo một hƣớng duy nhất là từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Thể cho thƣờng chỉ truyền đi một phần nhỏ DNA của chúng nên không tạo thành các hợp tử hoàn chỉnh mà chỉ tạo thành các hợp tử không hoàn chỉnh Các gene của vi khuẩn thƣờng chỉ truyền trong cùng loài nhƣng thỉnh thoảng sự chuyển gene tới các loài khác cũng có thể xảy ra 2.1.2 Những cơ chế chuyển gene ở vi khuẩn. .. tiếp tục từ nghiên cứu Chuyển gene gfp (Green Fluorescent Protein) vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần” do Đỗ Thị Ngọc Hân, trƣờng Đại học Nông Lâm thực hiện, và nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, Đại học Nông Lâm thực hiện 1.2 Mục đích 1- Chọn lọc dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens... tăng sinh (Viable-but-Nonculturable State ) đến khả năng phát sáng của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens A506 đánh dấu bởi gene gfp đã đƣợc M Lowder và cộng sự (2000) nghiên cứu Janus A.J và cộng sự (2002) kiểm tra tại chổ (In situ detection ) vi c chuyển gene theo chiều ngang của các yếu tố di truyền di động bằng cách xây dựng tổ hợp gene reporter gfp và promoter lac chuyển vào vi khuẩn GFP phát ra... fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần tối ƣu cho dòng vi khuẩn nhận Thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự trao đổi thông tin di truyền ở vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu Trong các quần thể vi khuẩn, đột biến liên tục xảy ra do các lỗi trong quá trình sao chép Nếu có sự chọn lọc thuận lợi cho . TỐI ƢU QUY TRÌNH CHUYỂN GENE gfp VÀO VI KHUẨN Pseudomonas fluorescens BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIẾP HỢP BA THÀNH PHẦN Giáo vi n hƣớng dẫn Sinh vi n. Minh, tháng 8 năm 2007 Sinh vi n Trần Nguyễn Thúy An iv TÓM TẮT Đề tài Tối ƣu quy trình chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens