fluorescens 1.8
Để chứng tỏ những nhận định trên chúng tôi thực hiện lại thí nghiệm chuyển gene gfp vào vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với quy trình đƣợc sửa đổi nhƣ sau:
1. Nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn trong tủ lắc định ôn ở 28oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 20 giờ.
o Vi khuẩn cho: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pUT-gfp trong 5ml môi trƣờng LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và kanamycin (50 µg/ml).
o Vi khuẩn hỗ trợ: Vi khuẩn E.coli DH5α (λ-pir) chứa plasmid pRK600 trong 5 ml môi trƣờng LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml).
o Vi khuẩn nhận: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 1.8 trong 5ml LB chứa chloramphenicol (20 µg/ml).
2. Hút lần lƣợt 3 dòng với tỉ lệ vi khuẩn cho: vi khuẩn hỗ trợ: vi khuẩn nhận = 1:1:3 = 300µl: 300 µl: 900 µl cho vào ependorf 1.5 ml, vortex kỹ, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 200C trong 1 phút. Thu sinh khối, rửa lại với 1 ml nƣớc cất vô trùng. Cho thêm vào ependorf 100 - 200 µl nƣớc cất vô trùng hòa tan sinh khối, đem vortex kỹ.
3. Cấy dịch vi khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB agar, bằng cách sử dụng micropipet nhỏ từng giọt (khoảng 10µl ) lên môi trƣờng, ủ 24 giờ ở 28oC.
4. Sau khi khuẩn lạc hình thành, cho tiếp 1ml nƣớc cất vô trùng vào đĩa petri hòa tan các khuẩn lạc. Pha loãng dịch khuẩn. Tiếp tục hút khoảng 30 µl dịch vi
khuẩn sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml) trang đều trên mặt đĩa, ủ 48 giờ ở 280
45
Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, sử dụng que tăm đã hấp, sấy cấy điểm sang đĩa môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml), ủ 24 giờ ở 280C. Từ đĩa M9 này tiếp tục cấy điểm các khuẩn lạc sang đĩa môi trƣờng KB, giữ đúng vị trí các khuẩn lạc nhƣ trên môi trƣờng M9. Ủ 24 giờ ở 280
C.
Đối chứng cũng đƣợc thực hiện bằng cách nuôi riêng 3 dòng vi khuẩn cho, nhận và hỗ trợ theo quy trình đƣợc trình bày trong mục 4.2.5.
Kết quả đối chứng đƣợc trình bày trong hình 4.6.
Kết quả đối chứng cho thấy dòng Pseudomonas fluorescens 1.8 chƣa tiếp hợp không mọc đƣợc trên môi trƣờng M9 (chứa kanamycin 50µg/ml). Nhƣ vậy, các dòng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc là vi khuẩn cho, vi khuẩn nhận đã tiếp hợp và vi khuẩn hỗ trợ.
Các dòng vi khuẩn sau khi hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng KB đƣợc đem chiếu dƣới tia UV. Những dòng phát sáng là các dòng Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp, còn những dòng không phát sáng là các dòng vi khuẩn
E.coli cho và hỗ trợ. Chỉ chọn những dòng phát sáng, loại bỏ những dòng không phát sáng.
Nhƣ vậy, qua hai bƣớc chọn lọc: chọn lọc bằng kháng sinh và chọn lọc dựa vào khả năng phát sáng trên môi trƣờng KB, chúng ta có thể thu đƣợc những dòng
Pseudomonas fluorescens đã tiếp hợp. Do đó, chúng tôi kết luận quy trình đƣợc
A B C
Hình 4.6: Kết quả đối chứng.
(A) dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens chưa tiếp hợp, (B) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid hỗ trợ pRK600, (C) dòng vi khuẩn E.coli có chứa plasmid pUT-gfp
46
trình bày trong mục 4.2.5 là quy trình tối ƣu cho việc chuyển gene gfp vào vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần.
So với nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Hân (2006), chúng tôi đã tìm ra phƣơng pháp chọn lọc thích hợp hơn để thu nhận đƣợc các dòng Pseudomonas fluorescens
đã tiếp hợp. Với quy trình tiếp hợp mà chúng tôi đã phát triển việc chọn lọc dòng vi khuẩn nhận thích hợp để làm đối tƣợng nghiên cứu cũng dễ dàng hơn rất nhiều vì không phải phụ thuộc quá chặt chẽ vào tính kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn nhận. Tuy nhiên, hạn chế của đề tài này là chúng tôi không thực hiện PCR để kiểm tra sự hiện diện của gene gfp trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens sau khi tiếp hợp. Và do hạn chế về máy móc chúng tôi cũng không thực hiện đƣợc việc quan sát các tế bào vi khuẩn dƣới kính hiển vi phát huỳnh quang để chọn ra dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tiếp hợp có biểu hiện phát sáng mạnh.
Chúng tôi đã đƣa ra quy trình tối ƣu để chuyển DNA plasmid vào vi khuẩn bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần, tạo tiền đề để so sánh hiệu quả chuyển gene bằng phƣơng pháp tiếp hợp ba thành phần với phƣơng pháp biến nạp bằng cách xử lý với calcium chloride mà Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái (2005) đã trình bày trong nghiên cứu “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn
E.coli DH5α”, góp phần chọn ra phƣơng pháp thích hợp để thực hiện mục đích chuyển các gene mong muốn vào tế bào vi khuẩn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
47 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ