Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà.

Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************** CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO BSTY HỒNG THANH HẢI BSTY LÊ HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN  Với tất lòng kính trọng yêu thƣơng, xin cảm ơn Ba Mẹ, Ngƣời cho có ngày hơm  Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ mơn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô Khoa, Bộ mơn tận tình dạy bảo tơi suốt năm học qua  Xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Bích Liên tận tình dạy bảo, động viên, giúp đỡ em thời gian học tập nhƣ việc thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp  Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hồng Thanh Hải, ngƣời ln bên cạnh, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian thực hồn thành khóa luận  Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong hỗ trợ, giúp đỡ em thời gian thực khóa luận  Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa luận  Xin cảm ơn bạn, ngƣời chia buồn vui với Thảo suốt năm qua  Em cảm ơn Anh…! Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2007 Nguyễn Ngọc Thanh Thảo iii TĨM TẮT Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ”, đƣợc thực Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007 Nội dung: Thực quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi xác định tuổi phơi, quy trình tách tế bào thích hợp Ni cấy, cấy chuyển theo dõi phát triển tế bào sơ cấp, tế bào thứ cấp Thu hoạch bảo quản tế bào xơ phôi gà Nitơ lỏng Hồi phục khảo sát khả sống tế bào sau bảo quản Các kết thu đƣợc: Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng cao số tế bào tách đƣợc từ phôi ngày tuổi Số tế bào tách đƣợc quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao số tế bào tách đƣợc quy trình trypsin ấm (25,51 x 106) Độ tuổi phơi quy trình tách tế bào không ảnh hƣởng đến phát triển tế bào in vitro Tế bào xơ phơi gà thứ cấp có khả phát triển điều kiện in vitro cao tế bào sơ cấp Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau bảo quản Nitơ lỏng ngày có khả bám phát triển bề mặt bình ni cấy iv SUMMARY Graduating thesis topic: “IMPROVE THE PROCEDURE OF HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS” The thesis was carried out at Microbiology and Infectious Diseases Dept of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam university Ho Chi Minh city from 4/2007 to 8/2007 Contents of research: Trying trypsin process for the culture of primary cells from embryonated eggs at 8th, 9th, 10th day then define a trypsin process and an age of embryo for primary culture Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary cells Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected Result: The number of CEF cells were removed from 9th day embryo tantamount to those from 10th day embryo and more than those from 8th day embryo The number of CEF cells were removed by cool trypsin process (49,73x106) more than those by warm trypsin process (25,51 x 106) The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro cells The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in vitro 5th day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the substrate and grow v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa i Trang bìa ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt tiếng Việt iv Tóm tắt tiếng Anh v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Danh sách biểu đồ xi Danh sách sơ đồ xi MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2.2 Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào 2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất 2.2.2 Tính chất học yếu 2.2.3 Khả phân chia tốc độ tăng trƣởng chậm 2.2.4 Cần giá đỡ q trình phát triển nhân đơi 2.2.5 Chịu ảnh hƣởng mạnh sản phẩm trao đổi chất chúng 2.2.6 Khả tiếp nhận gene lạ 2.2.7 Khả bảo quản điều kiện nhân tạo 2.3 Tổng quan nuôi cấy tế bào động vật vi 2.3.1 Nuôi cấy sơ cấp 2.3.2 Sự cấy chuyển 2.3.3 Hệ thống nuôi cấy tế bào 10 2.3.3.1 Nuôi cấy lớp đơn 10 2.3.3.2 Nuôi cấy huyền phù 10 2.3.4 Các loại tế bào nuôi cấy tế bào động vật 11 2.3.5 Những đặc điểm chức tế bào nuôi cấy 12 2.3.6 Điều kiện thích hợp cho ni cấy tế bào động vật 13 2.3.7 Vấn đề cần lƣu ý nuôi cấy tế bào động vật 19 2.3.8 Các pha nuôi cấy tế bào động vật 19 2.3.8.1 Pha ức chế 19 2.3.8.2 Pha phát triển 19 2.3.8.3 Pha ổn định 20 2.3.8.4 Pha suy giảm 20 2.4 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy 20 2.4.1 Những ƣu điểm việc đông lạnh tế bào ni cấy 20 2.4.2 Tiến trình bảo quản lạnh tế bào 21 2.4.3 Một số vấn đề ảnh hƣởng đến kết bảo quản 22 2.5 Ứng dụng nuôi cấy tế bào động vật 22 2.5.1 Thiết lập hệ thống mơ hình 23 2.5.2 Xét nghiệm độc tế bào 23 2.5.3 Nghiên cứu ung thƣ 23 2.5.4 Virus học 23 2.5.5 Sản xuất chất thứ cấp từ tế bào 23 2.5.6 Chẩn đoán di truyền 24 2.5.7 Kỹ thuật di truyền 24 2.5.8 Liệu pháp gene 25 2.5.9 Phát triển chọn lọc thuốc 25 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 vii 3.1 Thời gian địa điểm 26 3.1.1 Thời gian 26 3.1.2 Địa điểm 26 3.2 Vật liệu hóa chất 26 3.2.1 Đối tƣợng 26 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 26 3.2.3 Các hóa chất mơi trƣờng 27 3.3 Nội dung nghiên cứu 27 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Kỹ thuật lấy phôi tách mô phôi gà 28 3.4.2 Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp 28 3.4.3 Phƣơng pháp đếm tế bào buồng đếm Neubauer 29 3.4.4 Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào 30 3.4.5 Phƣơng pháp bảo quản tế bào 31 3.4.6 Phƣơng pháp hồi phục tế bào 31 3.5 Chỉ tiêu theo dõi 31 3.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 31 3.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm 32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Xác định tuổi phơi phƣơng pháp tách tế bào thích hợp 33 4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy lớp 35 4.3 Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào khảo sát khả sống tế bào sau bảo quản 37 4.3.1 Thời gian phát triển đầy lớp tế bào thứ cấp 37 4.3.2.Xác định khả sống tế bào sau bảo quản 39 4.4 Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà điều kiện Việt Nam 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 46 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CEF: Chicken Embryo Fibroblast DMSO: dimethyl sulfoxide EMEM: Eagle’s minimum essential medium FBS: Fetal bovine serum HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid MEM: Minimum essential medium PBSA: Phosphate bufferd saline solution A ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mơ hình tế bào động vật điển hình Hình 2.2: Các dụng cụ ni cấy tế bào lớp đơn 10 Hình 2.3: Các dụng cụ ni cấy huyền phù tế bào 11 Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào 21 Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào 22 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer 29 Hình 3.2: Tế bào CEF buồng đếm 30 Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 nuôi cấy 36 Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy lớp 36 Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy lớp 38 Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau hồi phục 40 Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau hồi phục 40 x 40 Tế bào xơ phôi gà sơ cấp đƣợc phục hồi sau bảo quản bình Nitơ lỏng khơng có khả bám phát triển (Hình 4.4), cịn tế bào thứ cấp có khả bám phát triển bề mặt bình ni cấy (Hình 4.5) Hình 4.4 Tế bào xơ phơi gà sơ cấp sau hồi phục Hình 4.5 Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau hồi phục 41 Kết theo chúng tơi tế bào sơ cấp đƣợc tách từ phơi gà nên khả thích nghi với điều kiện sống in vitro chƣa cao, tính ổn định chƣa hồn thiện nên tế bào khơng thể bám phát triển nhƣ tế bào thứ cấp Khi bảo quản tế bào xơ phơi gà, ngồi việc đảm bảo nhu cầu cho sống tế bào nhƣ bổ sung huyết thanh, DMSO… nên chọn tế bào xơ phôi gà thứ cấp để tiến hành bảo quản 4.4 Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà điều kiện Việt Nam Sau tiến hành theo quy trình thể Sơ đồ 3, xây dựng đƣợc quy trình điều chế tế bào xơ phơi gà điều kiện Việt Nam Quy trình điều chế đƣợc trình bày Sơ đồ 4: 42 Trứng gà có phơi (hoặc 10) ngày tuổi Xử lý tách mô Tách tế bào phƣơng pháp trypsin lạnh Đếm số lƣợng tế bào Nuôi cấy sơ cấp: 4*106 tế bào/ bình 25 cm2 Cấy chuyển lần Thu hoạch, đếm tế bào bảo quản -1960C ngày Hồi phục tế bào Phục vụ nhu cầu sử dụng Sơ đồ Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà Theo dõi phát triển tế bào 43 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng cao số tế bào tách đƣợc từ phôi ngày tuổi Số tế bào tách đƣợc quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao số tế bào tách đƣợc quy trình trypsin ấm (25,51 x 106) Tuổi phôi phƣơng pháp tách tế bào không ảnh hƣởng đến phát triển tế bào in vitro Tế bào xơ phơi gà thứ cấp có khả phát triển điều kiện in vitro cao tế bào xơ phôi gà sơ cấp Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau bảo quản Nitơ lỏng ngày có khả bám phát triển bề mặt bình ni cấy 5.2 Đề nghị Ni cấy tế bào CEF nhiều loại môi trƣờng khác mật độ khác để xác định mơi trƣờng thích hợp Cấy chuyển tế bào nhiều lần để khảo sát khả phát triển tế bào hệ khác Bảo quản tế bào CEF thời gian lâu để kiểm tra khả sống phát triển tế bào sau bảo quản Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến kết nuôi cấy nhƣ: nồng độ CO 2, thời gian thay môi trƣờng, thời điểm tiến hành cấy chuyển… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Hanh, 1978 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Tủ sách Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Phan Kim Ngọc, 2002 Giáo trình thực tập sở Công Nghệ Sinh Học Động Vật NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002 Công Nghệ Tế Bào NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TỪ INTERNET Bonnie L Wallace, Felicia F Piel, William J Hillegas, James Varani, 2001 Growth Kinetics of Primary CEF Cells on Hillex Microcarriers in Sigma's TiterHigh™ CEF Basal Medium with 2% Bovine Calf Serum SoloHill Engineering Inc and The University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Life_Science_Qua rterly/January_2001.html John A Ryan, 2004 General Guide for Cryogenically Storing Animal Cell Cultuers, Corning Incorporated – Life Sciences, Acton, MA 01720 http://www.corning.com/lifesciences/technical_information/TechDocs/t_cryoani malcc.pdf John A Ryan, 2004 Introduction to Animal Cell Culture, Corning Incorporated – Life Sciences, Acton, MA 01720 www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_c ell_culture.pdf www.pharma.ethz.ch/ /protocols/Hemato.gif http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o http://www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/cccontam ination.pdf 10 http://www.corning.com/Lifesciences/cells100/ 11 http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Life_Science_Qua rterly/January_2001/Jan_01_CEF_Cells.html 45 12 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1533818 13 http://www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/cc_scale_ up_guide.pdf 14 http://ccr.coriell.org/Sections/Support/Global/Fibroblast.aspx?PgId=214 46 PHỤ LỤC Thành phần cách pha hóa chất, mơi trƣờng  Pha mơi trƣờng EMEM (pha lít) Cho 500 ml nƣớc cất khử ion vào bình thuỷ tinh Cho gói EMEM dạng bột (9,6g gói) vào bình cho bột khơng dính vào thành, lắc kĩ để bột tan Khuấy từ tối thiểu để bột tan hoàn toàn Làm đầy thành lít Lọc tiệt trùng mơi trƣờng với lƣới lọc 0,22 m máy hút chân không tủ cấy vô trùng Chắt lọ nhỏ để 370C 48 để kiểm tra tiệt trùng Phần lại trữ ngăn dƣới tủ lạnh  Phƣơng pháp pha glutamine (pha lít) Cân 29,2g glutamine cho vào lít, khơng cho bột dính vào thành lọ Đong lít nƣớc khử ion cho vào lọ cho tan hết bột thành lọ Trộn tối thiểu 15 phút để hoà tan Khi tan hết, lọc với lƣới lọc 0,22 m máy hút chân không Khi lọc xong chiết lọ 5ml Trữ lạnh đông  Phƣơng pháp pha dung dịch P/S (Penicillin/Streptomycine) để pha 500ml (trong 1ml có 40000UI Penicillin 40000 g Streptomycine) Lấy 20 lọ benzylpenicillin 1000000UI 20 lọ Streptomycine Sulfate 1g Bóc bỏ lớp vỏ để lộ phần cao su Lấy xilanh hút 10ml nƣớc khử ion vào lọ Penicillin, 5ml vào lọ Streptomycine Khi bột tan hút Penicillin Streptomycine từ lọ cho vào lọ 500ml Rửa lại lọ nhƣ Làm đầy thành 500ml với nƣớckhử ion Chia nhỏ lọ 1ml 4ml 47 Trữ -200C  Pha dung dịch kháng nấm FU (Fungizone): pha 50ml dung dịch có 500 g Amphotericine B/ml Lấy lọ kháng nấm Amphotericine B (25mg/lọ), dùng xilanh bơm 10ml nƣớc cất khử ion vào lọ thuốc, lắc cho tan Sau bột tan hút dung dịch từ lọ vào lọ 100ml Bơm 10ml nƣớc cất để tráng Làm đầy thành 50ml Chia thành lọ nhỏ 2ml trữ -200C  Môi trƣờng nuôi cấy tế bào xơ phôi gà: EMEM + 10% FBS EMEM tổng hợp 100 ml FBS 10 ml Glutamine 2,92% ml HEPES 1M ml Sodium bicarbonate 7% 1,5 ml P/S 0,25 ml FU 0,5 ml  Quy trình pha trypan blue 0.22% Cho 1l nƣớc cất khử ion vào chai thủy tinh Cho 8,5g NaCl vào, khuấy cho NaCl tan Cân 2,2g trypan blue cho vào chai, khuấy từ khoảng Chia vào ống 10 ml Bảo quản 40C  Dung dịch trypsin 0,25% Stock trypsin 0,5% 10X 0,5 ml BPS khử trùng 9,5 ml Bảo quản 40C  Quy trình pha PBSA (phosphate bufferd saline solution A) pha 200ml Cho 200ml nƣớc cất khử ion vào chai thuỷ tinh có nắp Cho viên PBSA vào Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Lƣu ý không đƣợc vặn nắp chặt Sau hấp xong vặn chặt nắp, trữ lạnh 40C 48 Bảng xử lý thống kê 2.1 Số lƣợng tế bào tách từ phôi  Trypsin ấm One-way ANOVA: SO TE BAO - versus TUOI PHOI - Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,11130 0,11130 Error 10 0,09296 0,00930 Total 11 0,20426 Level N 6 Pooled StDev = Mean 7,2277 7,4203 StDev 0,0576 0,1236 0,0964 F 11,97 P 0,006 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( * ) ( * ) -+ -+ -+ 7,20 7,30 7,40 One-way ANOVA: SO TE BAO - 10 versus TUOI PHOI - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,0168 0,0168 Error 10 0,1506 0,0151 Total 11 0,1673 Level 10 N 6 Pooled StDev = Mean 7,4203 7,4951 StDev 0,1236 0,1218 0,1227 F 1,12 P 0,316 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -( * ) ( -* ) + -+ -+ -7,40 7,50 7,60 One-way ANOVA: SO TE BAO - 10 versus TUOI PHOI - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,21454 0,21454 Error 10 0,09078 0,00908 Total 11 0,30532 Level 10 N 6 Pooled StDev = Mean 7,2277 7,4951 0,0953 StDev 0,0576 0,1218 F 23,63 P 0,001 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+( * -) ( -* ) -+ -+ -+ -+7,20 7,32 7,44 7,56 49  Trypsin lạnh One-way ANOVA: SO TE BAO - versus TUOI PHOI - Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,1596 0,1596 Error 10 0,1133 0,0113 Total 11 0,2729 Level N 6 Pooled StDev = Mean 7,5159 7,7466 StDev 0,1082 0,1046 0,1064 F 14,09 P 0,004 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( -* -) ( * -) + -+ -+ -+ -7,44 7,56 7,68 7,80 One-way ANOVA: SO TE BAO - 10 versus TUOI PHOI - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,0009 0,0009 Error 10 0,2522 0,0252 Total 11 0,2531 Level 10 N 6 Pooled StDev = Mean 7,7466 7,7291 StDev 0,1046 0,1987 0,1588 F 0,04 P 0,852 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( * -) ( * -) + -+ -+ -+ -7,60 7,70 7,80 7,90 One-way ANOVA: SO TE BAO - 10 versus TUOI PHOI - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS TUOI PHO 0,1363 0,1363 Error 10 0,2560 0,0256 Total 11 0,3923 Level 10 N 6 Mean 7,5159 7,7291 Pooled StDev = 0,1600 -0,0073 StDev 0,1082 0,1987 F 5,32 P 0,044 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( -* -) ( * -) -+ -+ -+ 7,50 7,65 7,80 50  So sánh trypsin ấm trypsin lạnh One-way ANOVA: SO TE BAO versus QUY TRINH Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS QUY TRIN 0,7201 0,7201 Error 34 0,9042 0,0266 Total 35 1,6243 Level N 18 18 Pooled StDev = Mean 7,3810 7,6639 StDev 0,1525 0,1730 0,1631 F 27,08 P 0,000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( -* ) ( * -) + -+ -+ -+ -7,32 7,44 7,56 7,68 Ghi chú: – Trypsin ấm – Trypsin lạnh 2.2 Thời gian làm đầy lớp tế bào sơ cấp  Trypsin ấm One-way ANOVA: THOI GIAN 8,9 versus TUOI PHOI 8,9 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 6,0 6,0 Error 41,3 10,3 Total 47,3 Level N 3 Pooled StDev = Mean 23,667 25,667 StDev 3,215 3,215 3,215 F 0,58 P 0,489 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -( * -) ( -* ) + -+ -+ -21,0 24,5 28,0 One-way ANOVA: THOI GIAN 9, 10 versus TUOI PHOI 9, 10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 8,2 8,2 Error 58,7 14,7 Total 66,8 Level 10 N 3 Pooled StDev = Mean 25,667 28,000 3,830 F 0,56 P 0,497 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev + -+ -+ -+ -3,215 ( * -) 4,359 ( * ) + -+ -+ -+ -20,0 24,0 28,0 32,0 51 One-way ANOVA: THOI GIAN 8,10 versus TUOI PHOI 8,10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 28,2 28,2 Error 58,7 14,7 Total 86,8 Level 10 N 3 Pooled StDev =  Mean 23,667 28,000 StDev 3,215 4,359 3,830 F 1,92 P 0,238 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+( -* ) ( -* -) -+ -+ -+ -+20,0 25,0 30,0 35,0 Trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN 8, versus TUOI PHOI 8, Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 88,2 88,2 Error 90,7 22,7 Total 178,8 Level N 3 Pooled StDev = Mean 22,333 30,000 StDev 3,055 6,000 4,761 F 3,89 P 0,120 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( * ) ( * ) -+ -+ -+ 21,0 28,0 35,0 One-way ANOVA: THOI GIAN 9,10 versus TUOI PHOI 9, 10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 0,7 0,7 Error 90,7 22,7 Total 91,3 Level 10 N 3 Pooled StDev = Mean 30,000 30,667 4,761 StDev 6,000 3,055 F 0,03 P 0,872 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( * -) + -+ -+ -+ 25,0 30,0 35,0 40,0 52 One-way ANOVA: THOI GIAN 8, 10 versus TUOI PHOI 8,10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TUOI PHO 88,2 88,2 Error 90,7 22,7 Total 178,8 Level N 3 Pooled StDev =  Mean 22,333 30,000 StDev 3,055 6,000 4,761 F 3,89 P 0,120 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( * ) ( * ) -+ -+ -+ 21,0 28,0 35,0 So sánh trypsin ấm trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN versus TRYPSIN Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS TRYPSIN 16,1 16,1 Error 16 345,6 21,6 Total 17 361,6 Level N 9 Pooled StDev = Mean 25,778 27,667 4,647 F 0,74 P 0,401 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev -+ -+ -+ -+ 3,667 ( * ) 5,454 ( * ) -+ -+ -+ -+ 22,5 25,0 27,5 30,0 Ghi chú: – Trypsin ấm – Trypsin lạnh 2.3 Thời gian làm đầy lớp tế bào thứ cấp  Trypsin ấm One-way ANOVA: Thoi Gian - versus Tuoi Phoi - Analysis of Variance for TG89 Source DF SS MS VA 0,17 0,17 Error 32,67 8,17 Total 32,83 Level N 3 Pooled StDev = Mean 22,000 21,667 2,858 StDev 2,000 3,512 F 0,02 P 0,893 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+-( * -) ( * ) + -+ -+ -+-18,0 21,0 24,0 27,0 53 One-way ANOVA: Thoi Gian - 10 versus Tuoi Phoi - 10 Analysis of Variance for TG9 10 Source DF SS MS VA 10 2,7 2,7 Error 42,7 10,7 Total 45,3 Level 10 N 3 Pooled StDev = Mean 21,667 23,000 StDev 3,512 3,000 3,266 F 0,25 P 0,643 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+-( * ) ( * ) + -+ -+ -+-17,5 21,0 24,5 28,0 One-way ANOVA: Thoi Gian - 10 versus Tuoi Phoi - 10 Analysis of Variance for TG8 10 Source DF SS MS VA 10 1,50 1,50 Error 26,00 6,50 Total 27,50 Level 10 N 3 Pooled StDev =  Mean 22,000 23,000 StDev 2,000 3,000 2,550 F 0,23 P 0,656 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ 20,0 22,5 25,0 Trypsin lạnh One-way ANOVA: Thoi gian 8, versus Tuoi phoi 8, Analysis of Variance for T89 Source DF SS MS 89 0,17 0,17 Error 20,67 5,17 Total 20,83 Level N 3 Pooled StDev = Mean 23,000 23,333 2,273 4,820 StDev 1,000 3,055 F 0,03 P 0,866 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 20,0 22,5 25,0 27,5 54 One-way ANOVA: Thoi gian 9, 10 versus Tuoi phoi 9, 10 Analysis of Variance for T910 Source DF SS MS 910 0,17 0,17 Error 23,33 5,83 Total 23,50 Level 10 N 3 Pooled StDev = Mean 23,333 23,667 StDev 3,055 1,528 2,415 F 0,03 P 0,874 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+ ( * -) ( -* ) -+ -+ -+ -+ 20,0 22,5 25,0 27,5 One-way ANOVA: Thoi gian 8, 10 versus Tuoi phoi 8, 10 Analysis of Variance for T810 Source DF SS MS 810 0,67 0,67 Error 6,67 1,67 Total 7,33 Level 10 N 3 Pooled StDev =  Mean 23,000 23,667 1,291 F 0,40 P 0,561 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev -+ -+ -+ -+ 1,000 ( * -) 1,528 ( -* -) -+ -+ -+ -+ 21,0 22,5 24,0 25,5 So sánh trypsin ấm trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN versus QUY TRINH Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS QUY TRIN 5,56 5,56 Error 16 79,56 4,97 Total 17 85,11 Level N 9 Pooled StDev = Mean 22,222 23,333 2,230 Ghi chú: – trypsin ấm – trypsin lạnh StDev 2,587 1,803 F 1,12 P 0,306 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -( * ) ( * -) + -+ -+ -21,6 22,8 24,0 ... ? ?Cải thiện quy trình thu hoạch bảo quản tế bào xơ phôi gà” 1.2 Mục đích Xây dựng quy trình ni cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện Việt Nam, từ mở rộng khả ứng dụng tế bào xơ phơi gà nghiên... vitro cao tế bào sơ cấp 4.3.2 Khảo sát khả sống tế bào sau bảo quản Để xác định khả sống tế bào xơ phôi gà sau thời gian bảo quản, sử dụng tế bào sơ cấp tế bào thứ cấp (cấy chuyển lần) bảo quản nhiệt... quy trình tách tế bào phù hợp (quy trình Trypsin ấm hay Trypsin lạnh) - Khảo sát khả bảo quản hồi phục tế bào sau bảo quản - Xây dựng quy trình sản xuất bảo quản tế bào xơ phôi gà 28 3.4 Phƣơng