ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN NẤM MỐC

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN21.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí21.2 Tổng nấm men, nấm mốc3CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH62.1 Vật liệu, hóa chất, dụng cụ62.2 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm82.2.1 Thu và chứa mẫu82.2.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu92.2.3 Chuẩn bị mẫu 92.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí112.3.1 Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí112.3.2 Môi trường sử dụng122.3.3 Quy trình phân tích122.3.4 Thuyết minh quy trình122.5.5 Ý nghĩa172.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt (theo TCVN 56671992):172.5. Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm252.5.1 Nguyên tắc252.5.2 Môi trường và hóa chất252.5.3 Quy trình phân tích định tính nấm mốc262.5.4 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc262.5.5 Ý nghĩa282.6. Định lượng nấm men nấm mốc trong thịt và các sản phẩm từ thịt (Theo TCVN 71372002)292.7. Xác định mật số và lên men vi sinh vật trong lên men ca cao (báo cáo khoa học – Tạp chí Khoa học – Đại học Cần Thơ)38

LỜI NÓI ĐẦU

Phân tích vi sinh vật học thực phẩm là một môn học quan trọng trong hệ đại họcngành công nghệ thực phẩm Môn học này giúp chúng ta có được những kiến thức hữuích trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm Hiên nay, việc phân tích

vi sinh thực phẩm của một số các sản phẩm thiết yếu như thịt-các sản phẩm từ thịt, thủysản, sữa,… đều đã được tiêu chuẩn hóa, nên những những vấn đề được đề cập trongtiểu luận này chỉ là các vấn đề cơ bản nhất Những ai đang làm, hoặc sẽ làm trong lĩnhvực này phải thường xuyên cập nhật thông tin, tiêu chuẩn hóa kiến thức của mình, phùhợp với sự thay đổi của các tiêu chí chất lượng thực phẩm ngày càng cao của xã hội Nội dung tiểu luận

• Tổng số vi sinh vật hiếu khí

• Tổng nấm men, nấm mốc

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

Trong điều kiện ánh sáng thích hợp, quá trình quang hợp của tảo diễn ra như sau:

NH3 + 7,62CO2 + 2.53H2O → C7,62H8,06O2,53N + 7,62O2 (1.6)

Tổng vi khuẩn hiếu khí

Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu là chỉ thị mức độ vệ sinh của thựcphẩm Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môitrường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinhkhối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vịhình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thựcphẩm Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (AerobicPlateCount, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi sinh vậtsống ( Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC)

Nguyên tắc

Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm xác định bằng phương pháp nuôicấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ Tổng số vi sinh vật hiếukhí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C/72 giờ ± 6 giờhoặc 370C/48 giờ ± 6 giờ Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptricho phép xác định được lượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môitrường trong mẫu ban đầu

Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250khuẩn lạc Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ phaloãng lớn hơn

năng lượng từ môi trường bên ngoài Vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phânlập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác Có thể phân biệt được nấm men

và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sảnbằng bào tử hay khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảychồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thànhchuổi Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên mộtkhuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay mộtđoạn của khuẩn ty

Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từmôi trường Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độthích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, một ít trong số này ưalạnh hay ưa nóng Nước hoạt tính cũng là nhân tố ảnh hưởng tất quan trọng đến tăngtrưởng Hầu hết các loại nấm men và nấm mốc phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạttính khoảng 85% hay lơn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nướchoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70% Nấm mốc và nấm men tăng trưởng ở vùng pH từ2-9, trong pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 -6,5 Hầu hết nấm mốc, nấm men đềuthuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí Một

số có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn lànguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm men và nấm mốc

Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúngchỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan Trong quá trình trao đổi chấtxảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất hào tan thành các chất khônghòa tan thành lignocellulose Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất

độc của chúng được gọi chung là độc tố vi nấm ( mycotoxins) Tiêu biểu có Aspegillus

flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegillus moninus, Penicillium italicum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii, Penicillium digitatum Trong thực phẩm nấm

men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm

phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thểtạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.

Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien.

Nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, nguồn chất có đường Hình dạng của chúng rất

đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình oval (hình 2.4)

Hình 1: Khuẩn lạc và tế bào nấm men [11]

Nấm mốc sinh sản bằng bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi là sợi khí sinh ( sợi sinhsản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ cơ chất là 60%, có nguồn chất là bội đường( hình 2.5)

Hình 2: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc [11]

Cách phân biệt nấm men, nấm mốc

• Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty

• Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi Thỉnh thoảng

có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi

Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩnlạc khi nuôi cấy trong môi trường Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạnkhuẩn ty Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làmthay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơcấu của thực phẩm

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 2.1.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ:

Vật liệu

Mẫu thực phẩm chế biến sẵn

Hóa chất – môi trường

• Buffer Pepton Water (BPW)

• Plate Count Agar (PCA)

• Tryptone Soya Agar (TSA)

• Violet Red Bile Agar ( VRB)

• Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

• Eosine Methylene Blue Agar(EMB)

• Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC)

• Môi trường canh LSB

• Đũa thủy tinh

• Túi nilon vô khuẩn

2.2 Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm

2.2.1 Thu và chứa mẫu

Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quảnmẫu Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang vềphòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích

Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm Trường hợp thực phẩm đông lạnh,

có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượngmẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa Lưu ý tránhthu các mảng băng

Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằngcách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn

Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cầnphân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để cóđược khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu haythành phẩm

Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiệnthu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn Đối với các loại mẫu như thịt hay cá,nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quétmột diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu

Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo,bao nylon chứa mẫu Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ

2.2.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu

Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảoquản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá Nước đá phải không được tan chảytrong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm

Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngaykhi có thể Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khiphân tích Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủlạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ Các loại thực phẩm như đồ hộp, thựcphẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độphòng cho đến khi phân tích

2.2.3 Chuẩn bị mẫu

 Rã đông mẫu trước khi phân tích

Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phântích Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bêntrong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm,không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác

Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ Khi cầnthiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút Trường hợp này, cần liên tục lắcbình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu

 Cân mẫu

Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầucủa chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g Lượng mẫu này được cho vào trongcác bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng

Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp vàđược xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thíchhợp kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau:

• Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tếbào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không

được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể pháttriển được

• Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ốngnghiệm có nắp

Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch phaloãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dungdịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch phaloãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3 Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ phaloãng như mong muốn ( hình 3.1)

Hình 3 : Pha loãng mẫu

 Đồng nhất mẫu

Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làmđồng nhất trước khi phân tích Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cáchlắc kỹ trước khi phân tích Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyêndùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng.

Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu mộtlượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng,lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra

để phân tích là 25g

2.3 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí

2.3.1 Nguyên tắc phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí

Quy trình phân tích bao gồm các bước:

- Cân mẫu

- Đồng nhất mẫu

- Pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân

- Chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên mặt môi trường rắn trong đĩapetri bằng phương pháp hộp trải, hoặc hộp đổ

- Ủ ở nhiệt độ và thời gian quy định

Phương pháp hộp đổ được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh.Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa peptri cho phép xác định đượclượng vi sinh vật còn có khả năng sinh trưởng trong môi trường trong mẫu ban đầu

Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250khuẩn lạc Nếu vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ phaloãng lớn hơn

Điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tùy theo yêu cầu phân tích và quy địnhcủa từng quốc gia Tiêu chuẩn của nhiều quốc gia quy định ủ ở 300C trong 3 ngày Một

số tiêu chuẩn khác quy định ử ở 20 – 220C trong cùng thời gian trên Theo yêu cầu củatiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48giờ ± 6 giờ

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

Ủ mẫu

30±1 o C trong 72 giờ

Đếm khuẩn lạc

Chọn đĩa có 25→250 khuẩn lạc

Sơ đồ quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

2.3.4 Thuyết minh quy trình

1 Định lượng mẫu

Bước 1: Cân chính xác hay 25 g mẫu cho vào bao PE vô trùng

2 Đồng nhất và pha loãng mẫu

Bước 2: Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội

Bước 3: Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dậpmẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây

Bước 4: Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta

sẽ được dung dịch pha loãng 10-1

Bước 5: Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cáchdùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khửtrùng, đồng nhất ta đươc 10-2 Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muốisinh lý, đồng nhất ta được 10-3 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ phaloãng cần thiết

Bước 6: Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đều bằng máy vortex mixer hay lắcmạnh bằng tay

3 Cấy mẫu và rót môi trường vào đĩa Petri

Bước 7: Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4

Bước 8: dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khửtrùng

Bước 9: Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguộikhoảng 45oC

Bước 10: lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ

từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa

Hình 4 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10]

- Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn

250 Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107

Hình 5: Mẫu khuẩn lạc Công thức tính kết quả

Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

fi: Độ pha loãng tương ứng

Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5

Đĩa 2 246 21 10

(cfu/g)

1 1

n

N A

×

× + +

×

×

=

2

26246

g CFU

+

++

2.3.5 Ý nghĩa

Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về visinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm

Đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm

2.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí trên thịt và một số sản phẩm từ thịt (theo TCVN 5667-1992):

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm bềmặt sản phẩm và trong 1g cho các loại thịt và sản phẩm chế biến từ thịt trừ đồ hộp thịt

1) Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm 2

1.2 ) Lấy mấu theo TCVN 5153 – 90 và TCVN 4886 – 89

1.3 ) Thiết bị và dụng cụ

- Giấy thấm vô khuẩn, kích thước 2 x 2 hoặc 5 x 5 cm;

- Khung bằng kim loại không rỉ vô khuẩn có kích thước trong là 2 x 2 hoặc x 5 cm;

- Bi thuỷ tinh vô khuẩn, có đường kính phù hợp;

- Tăm bông;

- Kẹp gắn kim loại;

- Ống nghiệm 18 x 180mm;

- Cốc đong các loại;

- Bình tam giác các loại;

- Bình định mức dung tích 100, 500 và 1000 ml;

- Pipét 1,0 và 100ml, chia độ tới 0,1ml;

- Đĩa petri có đường kính trong 90 – 100mm;

- Phích đá duy trì được nhiệt độ từ 0 đến + 20C;

- Buồng cấy vô khuẩn

1.4 ) Hoá chất và môi trường

1.4.1) Hoá chất

- Nước cất

- Natriclorua, tinh khiết phân tích (TKPT)

- Dinatri hydro phot phat (Na2HPO4), TKPT;

- Kalidihydro photphat (KH2PO4), TKPT;

- Thạch dùng cho vi sinh vật

- Trypton dùng cho vi sinh vật

- Glucaza.TKPT

- Cao men dùng cho vi sinh vật

- Pepton dùng cho vi sinh vật

10C trong 15 phút Nếu không dùng ngay, môi trường cần được bảo quản nơi khô ráo,tối ở nhiệt độ từ 0 đến + 50C và không quá 30 ngày

Vừa đun nhỏ lửa vừa khuấy nhẹ để hoà tan các chất đến khi dung dịch sôi Điều chỉnh

pH sao cho sau khi tiệt trùng pH ở 250 là 7,0 ± 0,2 Rót môi trường vào bình với lượngmôi trường không quá 1/2 dung tích mỗi bình Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120

± 10C trong 15 phút Để nguội trong nồi cách thuỷ tới 45 ± 10C để sử dụng Nếu chưadùng ngay cần bảo quản môi trường ở nơi khô ráo, tối, ở 0 đến + 50 và không quá 30ngày Trước khi dùng, đun cách thuỷ cho chảy môi trường và để nguội trong nồi cáchthuỷ tớ 45 ± 10C.

1.5.1) Chuẩn bị mẫu

a) Dùng giấy thấm vô khuẩn (1.3) được làm ướt trước bằng nước muối sinh lý và cótổng diện tích là 100cm (gồm 4 mảnh 5 x 5 cm hoặc 25 mảnh 2 x 2 cm) dán lên các vịtrí khác nhau của bề mặt mẫu (1.2) cần dám sao cho toàn bộ diện tích giấy thấm tiếpxúc trực tiếp với bề mặt mẫu Sau 2 phút, chuyển toàn bộ số giấy thấm trên vào ốngnghiệm đã chứa sẵn 10 ml dung dịch đệm pepton.

Có thể chuẩn bị mẫu theo cách: áp các khung kim loại vô khuẩn có kích thước tương tự(1.3) lên bề mặt mẫu ở các vị trí khác nhau với tổng diện tích là 100cm2 ( 4 lần vớikhung 5 x 5 cm hoặc 25 lần với khung 2 x 2cm) Nhẹ nhàng quét đầu tăm bông đã đượcthấm ẩm bằng nước muối sinh lý lên toàn bộ diện tích đã được khung kim loại giới hạn.Cchuyển toàn bộ số lên đầu tăm bông trên vào ống nghiệm chữa sẵn 10ml dung dịchđệm pepton Các ống nghiệm chứa mẫu có thể được bảo quản ở 0 đến + 20 trong vòng6h

b) Chuyển toàn bộ lượng mẫu trong ống nghiệm vào bình tam giác dung tích 100 mlchứa khoảng 10 viên bi thuỷ tinh vô khuẩn Tráng ống nghiệm chứa mẫu bằng dungdịch đệm pepton và đổ cả vào bình chứa mẫu, lắc nhẹ cho giấy thấm hoặc bông tanvụn, sau đó cho thêm dụch dịch đệm pepton tới khoảng 100ml

c) Để lắng hoặc tiến hành ly tâm dung dịch mẫu khoảng 5 phút ở tốc độ 200 vòng/phút Gạn lấy lớp dng dịch trong vào bình định mức dung tích 100ml và cho thêm dungdịch đệm pepton tới vạch mức 100ml (tương đương với 100cm2 bề mặt mẫu đượcchuẩn bị) Dung dịch này được gọi là dung dịch huyền phù ban đầu Cần tiến hànhkiểm tra ngay sau khi chuẩn bị xong dung dịch, nếu chưa kiểm tra, dung dịch cần đượcbảo quản ở 0 đến + 50C nhưng không quá 1h

1.5.2) Pha loãng mẫu

Dùng dung dịch đệm tepton ( mục b điều 1.4.2) để pha loãng dung dịch huyền phù banđầu theo tỉ lệ 1/9 tới các độ pha loãng thập phân khác nhau (10-1, 10-2…10n) Cần căn cứmức độ nhiễm khuẩn của mẫu để tiến hành pha loãng dung dịch mẫu tới các độ phaloãng phù hợp

1.5.3) Tiến hành nuôi cấy

a) Với mỗi mẫu phải nuối cấy ít nhất 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng nuốicấy 2 đĩa, phải dùng pipet riêng trong mỗi độ pha loãng

b) Dùng pipet khác nhau lấy 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau cho vàogiữa các đĩa petri Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường thạch trypton glucoza(mục c điều 1.4.2) Lắc vòng tròn 5 lần theo chiều kim đồng hồ và 5 lần ngược lai đểtrộn đều môi trường và dung dịch mẫu Đặt các đĩa chứa môi trường trên mặt phẳngngang sao cho môi trường đông tự nhiên Thời gian từ khi pha loãng mẫu (1.5.2) đếnkhi nuôi cấy xong không quá 20 phút

c) Nếu nghi trong sản phẩm có chứa các vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thểmmọc lan trên bề mặt môi trường thì sau khi môi trường đã đông rót thêm 4 ml thạchmàng lên bề mặt đĩa

d) Khi môi trường đã đông, lật úp các đĩa peptri và đặt vào tủ ấm đã duy trì ở 30 ± 10Ctrong 72 h

1.6.2) Tổng số vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 mẫu thử ( X1) được quy ra tổng số vi khuẩnhiếu khí có trong 1ml dung dịch huyền phù ban đầu của mẫu thử được tính ở 2 độ phaloãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng gồm 2 đĩa theo công thức sau:

X1 = n C n xd

z)1,0( 1+

∑

Trong đó:

∑C - tổng số khuẩn lạc trên tất cả các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp được đếm

n1 - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm;

nz - số lượng đĩa ở độ pha loãng thứ hai được đếm;

d - hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được đếm

Kết quả được làm tròn tới số hàng nghìn và biều thị dưới dạng tích của một số thậpphân hai chữ số ( 1,0 ….9,9) với 10n ( n= số chữ số nguyên của kết qủa trừ 1)

Thí dụ: Hai đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm ( 10-2) có số khuẩn lạc là 168 và 215;Hai đĩa ở độ pha loãng liên tiếp thứ hai được đếm ( 10-3) có số khuẩn lạc là 14 và 25

42210

21,02

2514215168)

1,0

1

=

=+

+++

=+

∑

−

x x d

n n

1.6.4) Nếu hai đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15, kếtquả là trung bình số học của số khuẩn lạc mọc trong hai đĩa đó

1.6.5) Nếu hai đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quảlà: ít hơn 1 vi khuẩn hiếu khí trên 1cm2 bề mặt sản phẩm.

2 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g

2.1) Nguyên tắc

Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1 g mẫu được tính theo phương pháp đếm số khuẩnlạc vi khuẩn hiếu khí quy ra 10ml dung dịch huyền phù ban đầu dưới các điều kiện xácđịnh của tiêu chuẩn này

2.2) Lấy mẫu, theo TCVN 5153 –90

2.3) Thiết bị và dụng cụ, xem điều 1.3

2.4) Hoá chất và môi trường, xem điều 1.4

2.5) Trình tự xác định

2.5.1) Chuẩn bị mẫu, theo TCVN 4887 – 89

Khối lượng mẫu được chuẩn bị để pha loãng là 10 ± 1g

2.5.2) Pha loãng mẫu, theo điều 1.5.2

2.5.3) Tiến hành nuôi cấy, theo các mục a, b, c điều 1.5.3

2.6) Tính kết quả

Cách đếm khuẩn lạc, tính toán và biểu thị kết quả theo các điều 1.6.1; 1.6.2 và 1.6.3.2.6.1) Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều có số khuẩn lạc thấp hơn 15, lấytrung bình số học m của chúng và kết quả X2 được tính:

X2 = m x m

d 10

1 =

(d là hệ số pha loãng của dịch huyền phù ban đầu bằng 10-1)

2.6.2) Nếu 2 đĩa chứa dịch huyền phù ban đầu đều không có khuẩn lạc nào, kết quả X2

được tính:

có hàm lượng đường hay muối cao Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu cóhàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm từ sữa, các loại rau quả và trái cây tươi,các loại đồ hộp Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môitrường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato DextroseAgar (PDA) chứa 40ppm Chloramphenicol hay cholotetracyline.

2.5.2 Môi trường và hóa chất

- Dung dịch pha loãng ( nước pepton 1%)

- Môi trường thạch DBRC

- Môi trường thạch MEA

- Môi trường thạch PDA

- Môi trường thạch SDA

- Môi trường thạch SDB

Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong đĩa petri, làm khô bề mặt trong đềukiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng Môi trường thạch Sabouraud DextroseAgar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng

2.5.3 Quy trình phân tích định tính nấm mốc

Quy trình phân tích

Thuyết minh quy trình

Đối với mẫu có nguy cơ nhiễm và mật độ nhiễm mốc quá thấp, việc phân tíchthường được thực hiện một cách định tính theo trình tự sau: mẫu được pha loãng 10-1 vàđồng nhất trong môi trường SDB Dịch đồng nhất được ủ 300C, theo dõi từng ngày đến

7 ngày Nếu trong canh trường có sự xuất hiện của nấm mốc, tiến hành chuyển lên cácđĩa thạch SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày Các khuẩn lạc nấm mốc xuấthiện trên các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề mặt ống thạch nghiêng SDA

để định danh khi cần thiết

2.5.4 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc

Quy trình phân tích

Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 300C, 1-7 ngày

Cấy tranh trường có mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày

Kết luận: có hay không có nấm mốc

Thuyết minh quy trình

Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng Trườnghợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhấtmẫu Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành cácdãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môitrường DBRC hoặc DG18 Nếu mật độ nấm men và nám mốc có thể cấy 1ml mẫu.Dùng que gạt thủy tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khi khô.Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 250C trong 5-7 ngày Đĩa

đã được đặt ngửa để tạo độ ẩm cho sự phát triển cuẩ nấm men mốc và hạn chế làm khôthạch Thực hiện 3 đĩa cho mỗi độ pha loãng Đếm và số lượng khuẩn lạc nấm mốc vànấm men trên tất cả các đĩa cấy Khi cần thiết quan sát bằng kính hiển vi soi nổi haykính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay mốc Kết quả được ghi bằng đơn vịCPU/g Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loại nghi ngờ sinh độc tố, cáckhuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đếncác phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm

Đồng nhất pha loãng mẫu thành các độ pha loãng

10-1, 10-2, 10-3

Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18 ủ ngửa đĩa ở

250C, 5-7 ngàyĐếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CPU/g)

Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ ở 300C, 7 ngày

Định danh

Cần lưu ý rằng tổng thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào môitrường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thờigian ủ không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả Mặtkhác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán củabào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác Công thức tính:

Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng tương ứng

Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ởnồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ởnồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g

2.5.5 Ý nghĩa

Tổng vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinhcủa thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạnbảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thựcphẩm

Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm đẫn đến biến đổi chất lượng: 106 tếbào/g (ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không Một vàitrường hợp vi sinh vật bằng 106 tế bào/g (ml) thực phẩm chưa có dấu hiệu hư hỏng rõràng về mặt hóa học

(cfu/g)

1 1

n

N A

×

× + +

×

×

=