Phân tích vi sinh: PHƯƠNG PHÁP ELISA

Giới thiệu phương pháp ELISA1.1 Khái niệm phương pháp ELISA Elisa Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay hay EIA Enzyme ImmunoAssay là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng

Bộ Công Thương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

DANH SÁCH NHÓM

1 HOÀNG THỊ NGỌC BÍCH 2005100206

5 LÊ THỊ KIỀU TRANG 2005100061

1 • GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP ELISA

NỘI DUNG

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

1.1 Khái niệm phương pháp ELISA

Elisa (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật

sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng

nguyên trong mẫu xét nghiệm

Hiện nay elisa được sử dụng trong nhiều lĩnh

vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt

là trong kiểm tra an toàn các sản phẩm sinh học.

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

1.2 Kháng nguyên – kháng thể

• Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy

động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu và polysaccarit.

• Kháng thể (antibody) là các phân tử immunoglobulin do các tế bào lympho B tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và

vô hiệu hóa các tác nhân lạ.

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

1.3 Nguyên tắc

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn

dịch dùng enzyme) dựa trên nguyên tắc là phản

ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với

một kháng thể đặc hiệu Tín hiệu của phản ứng

miễn dịch có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa

hay kết dính của kháng nguyên kháng thể hoặc

bằng những kháng thể đã được đánh dấu bằng chất

nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay

enzyme.

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

1.2 Nguyên tắc

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta

xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một

nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml)

ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân

gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu;

Thực hiện qua hai bước:

 Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng

nguyên và kháng thể.

 Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của

enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2

để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.

1 Giới thiệu phương pháp ELISA

• Tốn thời gian

• Các sinh phẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-8o C).

Các enzyme thường được

sử dụng:

• Peroxidase

• Beta – galactoxidase

• Alkaline – phosphatase

1 giới thiệu phương pháp ELISA

2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

2.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

2.3 Sandwich ELISA

2.4 ELISA cạnh tranh

2 Các phương pháp ELISA

2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu

Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện

sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Quy trình thực hiện:

2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

_ Khuếch đại tín hiệu tối thiểu.

2.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

Phương pháp này khác Direct ELISA ở

chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không

được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc

hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này

mới là kháng thể được gắn với enzyme)

2.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp) Quy trình thực hiện:

2.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

 Ưu điểm:

_ Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa.

_ Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.

_ Linh hoạt.

_ Độ nhạy sáng được tăng lên.

2.2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

 Nhược điểm:

_ Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là

như nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau

giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử

nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau

để kết quả có thể tin tưởng được

_ Phản ứng có thể xảy ra với kháng thể thứ cấp,

dẫn đến tín hiệu không đặc hiệu

2.3 Sandwich ELISA

Được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là:

_ Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA – Double antibody sandwich)

_ Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich)

2.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

Quy trình thực hiện

2.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

 Ưu điểm:

_ Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.

 Chú ý:

_ Nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.

2.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Quy trình thực hiện

2.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sandwich ELISA do

antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.

2.4 ELISA cạnh tranh

Phản ứng cạnh tranh nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.

Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu.

2.4 ELISA cạnh tranh

Quy trình thực hiện:

_ Ủ kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên _ Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên.

_ Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do

“cạnh tranh”

_ Thêm kháng thể thứ cấp Kháng thể thứ cấp gắn với enzyme.

_ Thêm cơ chất Lượng enzyme dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu màu.

2.4 ELISA cạnh tranh

Máy ELISA

3.1 Ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng

nguyên.

Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng

nguyên.

3 Các yếu tố ảnh hưởng

• Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính

thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm

dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất

cả hóa chất

dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu

3 Các yếu tố ảnh hưởng

tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản

kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm

4 Ứng dụng và xét nghiệm HIV

 Trong thực phẩm

• phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm

trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.

• Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu

phộng, quả óc chó, hạnh nhân và trứng

• Phát hiện độc tố trong tảo.

• Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella,

Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực

phẩm.

• Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, tàn

dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu…

4 Ứng dụng và xét nghiệm HIV

 Trong nông nghiệp

bệnh héo rũ) trên cây cam quýt

Top Virus gây bệnh chùn đọt chuối

hyopnewmonia ở heo

Thank You!