Tìm hiểu một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm

Ketnooi.com nghiệp giáo dục MỤC LỤC Danh mục hình ảnh Lời mở đầu .6 CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1 Samonella 1.2 Campylobacter 1.3 Clostridium perfringens .8 1.4 Clostridium botulinum .9 1.5 Staphylococcus aureus .10 1.6 Vibrio spp 11 1.7 Escherichia coli .12 1.8 Shigella spp 13 1.9 Coliforms 14 1.10 Listeria monocytogenes 15 1.11 Bacillus cereus .16 1.12 Aspergillus .17 1.13 Virus 18 CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG 2.1 Samonella 20 2.1.1 Tổng quan 20 2.1.2 Nguyên tắc 20 2.1.3 Môi trường hóa chất 21 2.1.4 Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella thực phẩm 22 Ketnooi.com nghiệp giáo dục 2.2 Vibrio 27 2.2.1 Tổng quan 27 2.2.2 Nguyên tắc 28 2.2.3 Môi trường hóa chất 28 2.2.4 Quy trình phân tích 29 2.3 Listeria monocytogenes 31 2.3.1 Tổng quan 31 2.3.2 Nguyên tắc 32 2.3.3 Môi trường hóa chất 32 2.3.4 Quy trình phân tích 33 2.4 Staphylococcus aureus 35 2.4.1 Tổng quan 35 2.4.2 Nguyên tắc 35 2.4.3 Môi trường hóa chất 36 2.4.4 Phân tích định tính Staphylococus aureus 36 2.4.5 Định lượng S.aureus phương pháp đếm khuẩn lạc .37 2.4.6 Định lượng S.aureus phương pháp MPN 39 2.5 Bacillus Cereus .39 2.5.1 Tổng quan 39 2.5.2 Nguyên tắc 40 2.5.3 Môi trường hóa chất 40 2.5.4 Quy trình phân tích 41 2.6 Clostridium .46 2.6.1 Tổng quan 46 2.6.2 Nguyên tắc 47 Ketnooi.com nghiệp giáo dục 2.6.3 Môi trường hóa chất 48 2.6.4 Quy trình phân tích 48 2.6.5 Báo cáo kết 49 2.7 Coliform E.Coli 49 2.7.1 Tổng quan 49 2.7.2 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân E.coli phương pháp MPN 49 2.7.3 Định lượng Coliforms, Coliform phân phương pháp đếm khuẩn lạc 52 2.7.4 Định lượng E.coli phương pháp đếm khuẩn lạc 55 2.8 Tổng nấm men nấm mốc 57 2.8.1 Tổng quan 57 2.8.2 Nguyên tắc 58 2.8.3 Môi trường hóa chất 58 2.8.4 Quy trình phân tích định tính .59 2.8.5 Quy trình phân tích định lượng 59 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP giám sát vệ sinh .61 3.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63 3.3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization) .65 3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66 3.5 Một số phương pháp thử nhanh khác 70 3.5.1 Kỹ thuật phân tách tăng mật độ .70 Ketnooi.com nghiệp giáo dục 3.5.2 Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) .71 3.5.3 Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71 3.5.4 Kỹ thuật Redigel 72 3.5.5 Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72 3.5.6 Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73 3.5.7 Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73 KẾT LUẬN 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Ketnooi.com nghiệp giáo dục DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Samonella Hình 1.2 Campylobacter Hình 1.3 Clostridium perfringens Hình 1.4 Clostridium botulinum Hình 1.5 Staphylococcus aureus Hình 1.6 Vibrio cholerae Hình 1.7 V.vulnificus Hình 1.8 V.parahaemolyticus Hình 1.9 Escherichia coli Hình 1.10 Shigella Hình 1.11 Coliforms Hình 1.12 Listeria monocytogenes Hình 1.13 Bacillus cereus Hình 1.14 Aspergillus flavus Hình 1.15 A.parasiticus Hình 1.16 Virus Ketnooi.com nghiệp giáo dục LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm yêu cầu bỗ dưỡng, hợp vị, giá phải có an toàn thực phẩm yêu cầu hàng đầu Số vụ ngộ độc thực phẩm tỷ lệ bệnh ung thư cho ăn phải chất gây ô nhiễm ngày gia tăng Trong số đó, nhiễm khuẩn chiếm tỉ lệ cao mối lo nhiều nước giới Việt Nam nước phát triển thuộc vùng nhiệt đới Trình độ sản xuất thấp cộng với điều kiện khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện cho nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm phát triển Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có thực phẩm cần thiết nhằm phát thực phẩm nhiễm khuẩn, chất lượng, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng cho cộng đồng Xuất phát từ yêu cầu sinh viên tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM Mục đích nghiên cứu Nội dung báo cáo giới thiệu đặc trưng phương pháp xác định số vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất thực phẩm Qua giúp cho người biết có mối nguy việc sử dụng thực phẩm phương pháp để kiểm nghiệm thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật Kết cấu khóa luận tốt nghiệp Khóa luận gồm chương: Chương 1: Các tiêu vi sinh vật thường kiểm soát thực phẩm Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống Ketnooi.com nghiệp giáo dục CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1 Salmonella Salmonella gây ngộ độc thực phẩm diện đến mức triệu tế bào gram thực phẩm Các triệu chứng Salmonella gây thường tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm triệu chứng biểu 12 – 36 Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ – ngày Không phải tất người tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Samonella bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy bị nhiễm Samonella cao thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng sản phẩm từ trứng, thủy sản Nguồn gây nhiễm loại thực phẩm thường phân người động vật, nhiễm gián tiếp hay trực tiếp Đặc biệt nguy hiểm cho người loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn Ketnooi.com nghiệp giáo dục Ketnooi.com nghiệp giáo dục Hình 1.1 Samonella 1.2 Campylobacter Ketnooi.com nghiệp giáo dục Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, diện khắp nơi, đặc biệt hệ vi sinh vật nhiều loại động vật chim Tuy nhiên dòng Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, phát triển nhiệt độ thấp 30oC Các triệu chứng ngộ độc vi sinh vật gây đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sảng, có biểu bệnh giống cảm cúm Thời gian ủ bệnh từ – 11 ngày Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm, nước nguồn gây nên ngộ độc Campylobacter Campylobacter diện loại thực phẩm hút chân không Các loài nhạy cảm với nhiệt độ acid nên bi tiệt trùng hoàn toàn phương pháp trùng Pastuer không tăng trưởng thực phẩm có tính acid Hình 1.2 Campylobacter 1.3 Clostridium perfringens C.perfringens tìm thấy đất, phân người Trước người ta cho dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử không làm tan máu gây ngộ độc thực phẩm Ngày có ghi nhận vụ 10 Ketnooi.com nghiệp giáo dục phức hợp luciferase với oxy phức hợp Mg-ATP Sau đó, ánh sáng vàngxanh (bước sóng cao 562nm) phát Để kiểm tra tình trạng vệ sinh bề mặt thiết bị sản xuất, chế biến thực phẩm, tổng số vi khuẩn hiếu khí thành phẩm, người ta xác định tổng lượng ATP mẫu Tổng hàm lượng ATP bao gồm hàm lượng ATP tế bào eukaryote ATP tế bào vi sinh vật Thông thường ATP nguồn gốc tế bào vi sinh vật tách chiết chất tẩy không ion ví dụ Triton X-100 ATP sau tách chiết khỏi tế bào thủy phân cách xử lý với enzyme ATPase vòng phút Tiếp theo, ATP tế bào vi sinh vật ly trích chất trichloacetic acid (5%) Ánh sáng phát phản ứng phát sáng đo loại máy đo ánh sáng đo cường độ ánh sáng thấp Ngày phát quang sinh học sử dụng rộng rãi để đánh giá chất lượng vệ sinh bề mặt thiết bị sử dụng trình sản xuất, chế biến, đánh giá chất lượng thực phẩm, mỹ phẩm Quy trình thực đơn giản, cho kết nhanh chóng vài phút dễ dàng tự động hóa Nguyên tắc chung quy trình sau: Mẫu thu cách dùng que vô trùng quẹt diện tích định bề mặt dụng cụ, thiết bị Sau que cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase cho phản ứng phát sáng Gần nhiều hệ thống phát thiết kế, chế tạo chứa sẵn hóa chất nằm dụng cụ quẹt mẫu tay phát sáng xảy phía đầu dụng cụ quẹt mẫu, sau dụng cụ đặt máy đo lượng ánh sáng phát Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo với đường chuẩn tương quan lượng ánh sáng phát mật độ tế bào vi sinh vật biết trước 65 Ketnooi.com nghiệp giáo dục 3.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến kỹ thuật vài thập niên vừa qua thúc đẩy phát triển nhiều kỹ thuật chẩn đoán huyết nhanh nhạy, xác bệnh truyền nhiễm Mặt khác, phát triển kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên – kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme) Trong số phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA hay enzyme immunosorbent assay – EIA) quan tâm nhiều có tính đơn giản hiệu cao Phương pháp sử dụng cho hầu hết loại kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng (microplate) Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu, phát diện định lượng lượng kháng nguyên ELISA sử dụng rộng rãi dạng hóa chất (kit) thương mại (phát Salmonella, thuốc trừ sâu…) cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng phát định lượng vi sinh thực phẩm 66 Ketnooi.com nghiệp giáo dục thời gian vài sau tăng sinh Kỹ thuật có độ nhạy phát khoảng 106 CFU/ml (một số báo cáo cho giới hạn đạt 104) Tuy nhiên phương pháp cần thực bước tăng sinh tăng sinh chọn lọc trước thực phản ứng miễn dịch Transin Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) kit phát nhanh Salmonella spp dựa nguyên tắc ELISA sandwich Khi mẫu cho vào giếng, có diện vi sinh vật mục tiêu, kháng nguyên tiên mao vi sinh vật tạo phức hợp với kháng thể cố định giếng kháng thể tự có gắn enzyme peroxidase tạo thành phức hợp kép (sandwich) Sau đó, kháng thể gắn enzyme dạng tự không tạo phức hợp sandwich bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp sandwich phát nhờ bổ sung chất phản ứng (ure peroxide tetramethylbenzidine) Enzyme peroxidase thủy phân chất tạo sản phẩm có màu xanh dương Phản ứng kết thúc cách bất hoạt enzyme dung dịch kết thúc làm acid hóa môi trường chuyển màu xanh thành màu vàng Sự hình thành màu vàng chứng minh diện kháng nguyên mục tiêu hay diện vi sinh vật mục tiêu mật độ vi sinh vật xác định cách đo cường độ máy so màu Một ví dụ khác sản phẩm ELISA thương mại quy trình phát độc tố đường ruột định danh độc tố (loại A đến E) Staphylococci thực phẩm Quy trình có thời gian ngắn (4 giờ), nhạy (1 ng/ml hay mg) phát đồng thời diện nhiều loại độc tố Staphylococcus (nhưng phân biệt loại độc tố) Phản ứng ELISA thực dựa kỹ thuật “sandwich” Bộ kit có tên thương mại TECRATM 67 Ketnooi.com nghiệp giáo dục (TECRA Diagnostic, Roseville, 2069, Australia), sản phẩm chứng nhận AOAC 3.3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization) Từ năm 1980, nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm ứng dụng thành tựu kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm Hiện nay, nhiều hệ thống thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật độc tố Tuy nhiên, có phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò, probes), phương pháp PCR (polymerase chain reaction) thương mại hóa dạng kit phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Cơ sở việc sử dụng mẫu dò trình lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử DNA tái bắt cặp đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Một hai mạch DNA bổ sung (gọi DNA mục tiêu DNA tế bào vi sinh vật) cố định giá thể rắn nằm tế bào hay mô Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Sự lai phân tử xảy DNA RNA Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion môi trường Một ví dụ hệ thống phát mẫu dò hệ thống Gen-trak (Framingham, USA) Hệ thống sử dụng que thử với mẫu dò để phát Listeria mẫu bơ sữa mẫu môi trường Mẫu dò đoạn oligomer 68 Ketnooi.com nghiệp giáo dục DNA đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình phân tích chia thành bước: (1) phá vỡ tế bào thu nhận rRNA; (2) mẫu dò DNA có đuôi oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) mẫu dò phát (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) đầu 5’ 3’ phân tử đặt vào phản ứng; (3) que thử bao bọc polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò; (4) que thử đặt vào ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzyme; (5) sau rửa loại phần enzyme thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu; (6) sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450 nm 3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật Karl Mullis cộng (Mỹ) phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật có thực phẩm Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khuôn thường trình tự DNA gen (gọi trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mồi la đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa đặc 69 Ketnooi.com nghiệp giáo dục tính DNA polymerase Khi có diện hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA phản ứng PCR, điều kiện đảm bảo hoạt động DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích tái thao tác gen Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thông tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi gồm mồi xuôi (sens primer) mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã gen Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba bước là: - Bước (bước biến tính, denaturation): dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94 – 95oC vòng 30 – 60 giây Mạch đôi DNA tách thành dạng mạch đơn - Bước (bước lai, anealation): bước này, nhiệt độ hạ thấp Tm mồi cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc vào Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 – 60 giây - Bước (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase (vốn polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt Thời gian bước tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút 70 Ketnooi.com nghiệp giáo dục Trong phản ứng PCR chu kỳ bao gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần, lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại cho khoảng 106 Sau phản ứng PCR, DNA nhuộm ethidium bromide quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR gel agarose quan sát tia UV (bước sóng 312 nm) Hiện có nhiều ứng dụng phản ứng PCR kit thương mại dùng để phát đặc hiệu chủng vi sinh vật gây bệnh thực phẩm loài khó nuôi cấy Một số ưu điểm phương pháp PCR dùng phát vi sinh vật gây bệnh là: - Thời gian cho kết nhanh - Có thể phát vi sinh vật khó nuôi cấy Việc nuôi tăng sinh đơn giản không cần thiết - Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm dễ tồn trữ so với trường hợp huyết học Không cần dụng cụ môi trường chẩn đoán phức tạp, thực trường - Ít tốn mặt nhân sự, tự động hóa để làm giảm chi phí phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Mặc dù phương pháp PCR số nhược điểm cần khắc phục: - Sự ức chế hoạt tính Taq DNA polymerase thành phần mẫu vật mẫu thực phẩm thường có thành phần phức tạp Tuy nhiên, việc chiết tách tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước thực phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ hợp chất ức chế - Mật độ vi sinh vật gây bệnh diện mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát PCR 71 Ketnooi.com nghiệp giáo dục - Phương pháp không phân biệt tế bào sống với tế bào chết, dẫn đến trường hợp dương tính giả DNA từ tế bào chết Ngược lại phương pháp cho phép phát bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào chết vi sinh vật gây bệnh gây ngộ độc Một giải pháp chung nhược điểm kết hợp bước tăng sinh ngắn bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy rửa tế bào trước tiến hành phản ứng PCR Việc phát mầm bệnh vi sinh vật đơn lẻ thực phẩm phương pháp PCR thường gây tốn Do đó, nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chi phí cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi phản ứng PCR (gọi phản ứng multiplex PCR) để phát đồng thời nhiều vi sinh vật gây bệnh khác Tại Việt Nam có số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR việc phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm thực trung tâm khoa học công nghệ sinh học phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử, trường đại học khoa học tự nhiên, đại học quốc gia TP.HCM Dựa kết nghiên cứu số đối tượng vi khuẩn gây bệnh, quy trình chung cho việc phát vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm phương pháp PCR đề nghị sau: - Bước 1: tăng sinh môi trường không chọn lọc (TSB TSB có bổ sung số thành phần dinh dưỡng đặc biệt khác) khoảng thời gian từ 10 – 20 (tùy đối tượng vi sinh vật, loại mẫu thực phẩm điều kiện lưu giữ mẫu) - Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH8,0, 1mM EDTA) với thể tích 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý 72 Ketnooi.com nghiệp giáo dục nhiệt 100oC 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR - Bước 3: thực phản ứng PCR - Bước 4: điện di gel agarose 1,5%, xem kết đèn UV Toàn quy trình phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm từ tiếp nhận mẫu đến cho kết khoảng 14 – 24 (10 – 20 tăng sinh thực phản ứng PCR xem kết quả) 3.5 Một số phương pháp thử nhanh khác 3.5.1 Kỹ thuật phân tách tăng mật độ Để phân lập tế bào vi sinh vật mục tiêu với tế bào vi sinh vật khác cần thực kỹ thuật phân tách Trong trình đồng mẫu, mẫu thường pha loãng thập phân tạo thể tích lớn nguyên liệu (250ml), dùng vài ml mẫu cho quy trình phát Có thể rút ngắn thời gian tăng hiệu phát cách làm tăng mật độ vi sinh vật mục tiêu mẫu Một kỹ thuật phân tách sử dụng rộng rãi phân tách miễn dịch – từ tính (Immunomagnetic separation – IMS) Trong phương pháp này, giai đoạn phân lập rút ngắn cách thay môi trường tăng sinh chọn lọc quy trình tương tự không cần nuôi cấy IMS sử dụng hạt có từ tính cao bao bọc bên kháng thể vi sinh vật mục tiêu Các hạt giúp hấp thụ chọn lọc vi sinh vật mục tiêu phát quy trình vi sinh truyền thống Dynabeads® (Dynal A/S, Oslo, Norway) sản phẩm dựa kỹ thuật IMS Quy trình sử dụng hạt polystyrene từ tính cao có đường kính 2,8 m (Dynabeads® M-280) 4,5 m 73 Ketnooi.com nghiệp giáo dục (Dynabeads® M-450).Cả hai loại M-280 M-450 bao phủ bên loại kháng thể tùy chọn 3.5.2 Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) Đặc điểm chung phương pháp màng lọc lọc thu nhận tế bào từ lượng lớn thể tích lọc Số lượng tế bào dung dịch mẫu lọc xác định cách quan sát đếm kính hiển vi cách nuôi cấy màng đếm khuẩn lạc xuất Phương pháp màng lọc dạng cải biên phương pháp phân tích vi sinh truyền thống nhằm làm tăng mật độ vi sinh vật mục tiêu, loại bỏ tác nhân ức chế tăng trưởng Phương pháp thích hợp mẫu có mật độ tế bào thấp Màng lọc làm nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon, polyvinyl chloride polyester có kích thước lỗ 0,45 0,22 m, đường kính màng lọc khoảng 130 – 150mm Sự lọc hỗ trợ hút chân không lực ép dương Hiện phương pháp màng lọc cải tiến chất liệu màng (màng lưới kỵ nước, cấu tạo polycarbonate), chất nhuộm phát quang Các màng lọc mỏng quan sát kính hiển vi Độ nhạy kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế bào thu màng lọc trước nhuộm Kỹ thuật cho phép phân biệt tế bào sống tế bào chết cách nhuộm nhân với phẩm nhuộm phát huỳnh quang acridine orange Màu sắc phát quang tế bào bị nhuộm thay đổi suốt trình tăng trưởng Thuốc nhuộm phát màu đỏ vởi RNA màu xanh với DNA Thông thường tế bào sống cho màu đỏ da cam tế bào chết cho 74 Ketnooi.com nghiệp giáo dục màu xanh lục Năm 1991, phương pháp ISO-GRID® ứng dụng đối tượng Salmonella AOAC công nhận áp dụng cho loại thực phẩm 3.5.3 Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) Trong kỹ thuật này, môi trường dinh dưỡng dạng đông khô cố định giá thể mỏng phủ màng bảo vệ Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ tách phần để bổ sung 1ml dịch mẫu lên bề mặt môi trường, sau phủ lại màng bảo vệ Môi trường dinh dưỡng hỗ trợ cho tăng trưởng vi sinh vật thời gian ủ số khuẩn lạc xuất đếm trực tiếp Kỹ thuật dùng ứng dụng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, số coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men Ưu điểm kỹ thuật dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ bảo quản, thời hạn sử dụng lâu không cần hấp khử trùng môi trường 3.5.4 Kỹ thuật Redigel Kỹ thuật sử dụng chất dinh dưỡng gel pectin chứa ống nghiệm Ống môi trường sử dụng không cần phải đun chảy thạch Trước tiên nhỏ 1ml mẫu vào ống nghiệm, trộn Sau đổ tất vào đĩa petri đặc biệt tráng sẵn lớp calcium Khi chất lỏng tiếp xúc với calci, gel calcium pectate hình thành trương lên thành thạch môi trường thạch thông thường Sau ủ điều kiện thích hợp, tiến hành đếm khuẩn lạc giống phương pháp đếm đĩa thông thường 3.5.5 Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) Kỹ thuật nhằm phát định lượng nhanh vi sinh vật dựa tăng độ dẫn điện môi trường sản phẩm trao đổi chất có tính ion tiết vào môi trường vi sinh vật Môi trường nuôi cấy chọn lọc có tác dụng 75 Ketnooi.com nghiệp giáo dục dung dịch điện phân Sự thay đổi độ dẫn điện ghi nhận thiết bị đo nhờ giúp phát diện vi sinh vật môi trường nuôi cấy Kỹ thuật không áp dụng cho trường hợp môi trường nuôi cấy chứa hàm lượng ion cao (ví dụ môi trường chọn lọc Listeria) giá trị độ dẫn điện nằm giới hạn đo thiết bị Phương pháp ứng dụng sớm công nghiệp thực phẩm công nghiệp sữa Trong nhiều trường hợp cho kết phương pháp có tương quan tốt với kết phương pháp đếm khuẩn lạc có ưu điểm thời gian phát nhanh Tuy nhiên phương pháp cần điều kiện môi trường chuẩn, ổn định, cần thiết bị môi trường đặc biệt Trong kỹ thuật tương tự, KOH (potassium hydroxide) cố định agar sử dụng làm cầu dẫn điện nối với hai điện cực thiết bị đo điện Trong trình tăng trưởng, sản phẩm biến dưỡng vi sinh vật CO2 làm phân rã thiết bị đo độ dẫn thời gian cần thiết để làm thay đổi độ dẫn gọi thời gian phát Các thiết bị giám sát thường có chương trình tự động xác định diện vi sinh vật độ dẫn vượt qua giá trị quy ước Giới hạn phát phương pháp đạt đến mức tế bào sống Hiện có nhiều thiết bị giám sát thay đổi độ dẫn điện môi trường nuôi cấy vi sinh vật dùng cho kỹ thuật Bactometer 123 (Bactomatic Ltd), Malthus 2000 (Malthus Instruments Ltd)… 3.5.6 Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) Kỹ thuật sử dụng thiết bị nhạy cho phép đo thay đổi nhiệt lượng nhỏ trình trao đổi chất vi sinh vật Mật độ vi sinh vật mẫu để xác định cách đo lượng nhiệt sinh xác định thời gian lượng nhiệt sinh đạt đến ngưỡng đo Kỹ thuật dùng để 76 Ketnooi.com nghiệp giáo dục định danh vi sinh vật dựa khác biệt nhiệt lượng tạo vi sinh vật chất khác 3.5.7 Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) Trong kỹ thuật người ta sử dụng chất chứa carbon đồng vị phóng xạ 14C môi trường nuôi cấy vi sinh vật để khảo sát CO2 có chứa 14C sinh trình trao đổi chất vi sinh vật Mật độ vi sinh vật xác định cách đo lượng 14CO2 sinh thời gian cần thiết để lượng 14CO2 đạt đến ngưỡng phát Hệ thống phát dựa kỹ thuật đồng vị phóng xạ nhạy tính độc hại nên không ưa dùng công nghiêp thực phẩm 77 Ketnooi.com nghiệp giáo dục KẾT LUẬN Nội dung báo cáo tổng hợp số kiến thức bản, sử dụng tài liệu dùng phòng thí nghiệm để củng cố số kiến thức cần thiết Nêu tổng quan phương pháp xác định số vi sinh vật thường xuất thực phẩm Những phương pháp truyền thống sử dụng để dùng phòng thí nghiệm có sở vật chất hạn chế, giúp cho việc tìm hiểu nghiên cứu học tập sinh viên Còn phòng thí nghiệm có chức lớn, có đủ máy móc trang thiết bị sử dụng phương pháp đại giúp cho việc xác định xác nhanh chóng loại vi sinh vật Trong tương lai, trường nên trang bị máy móc thiết bị giúp sinh viên tiếp cận phương pháp đại, giúp phát triển tận dụng lực nghiên cứu sinh viên 78 Ketnooi.com nghiệp giáo dục TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thanh Mai (2009) Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học & kỹ thuật Trần Linh Thước (2009) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo dục Hà Huy Khôi (2004) Dinh dưỡng vệ sinh an toàn thực phẩm, Nhà xuất Y học 79 [...]... ra do tác nhân virus từ thực phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề bí ẩn Các nghiên cứu về virus thực phẩm Đặc điểm sinh lý của virus đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, kỹ thuật PCR… người ta có thể phát hiện virus có hại cho con người trong thực phẩm Sự lan truyền virus qua người... nước và thực phẩm Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm Hình 1.10 Shigella 1.9 Coliforms 16 Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu... thường được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước Loài này có thể nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn Các sản phẩm được thanh trùng bằng phương pháp Pastuer và được bảo quản trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này... Enterobacter Khi Coliform phân hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân Trong các thành vi n của nhóm Coliform phân thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm Hình 1.11 Coliforms 1.10 Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ... nhân lên trong nước hay trong thực phẩm Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm Các loài nhuyễn thể ăn lọc như nghêu, sò… có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước làm mật độ virus trong nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xung quanh Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thể thấp hơn rất nhiều so với vi khuẩn Virus hiện diện trong cơ... của từng bệnh nhân Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao Điều kiện thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh khác... Tất cả virus đường ruột đều có tính kháng với acid, các enzyme thủy phân, muối mật có trong đường tiêu hóa Một số virus có thể kháng nhiệt như virus vi m gan siêu vi A (HAV), hoặc kháng phenol, ethanol… Ô zôn và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín để khử virus trước khi dùng, các... miệng đã được biết đến từ năm 1950 Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột được biết hiện nay chỉ một vài loại có khả năng gây bệnh cho người 20 Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục (Hepatitis type A virus, HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non A, Virus Non B) Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi... emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B.cereus là đau bụng, tiêu chảy, không sốt, bắt đầu 4 – 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 – 24 giờ Một dạng triệu... ngộ độc thực phẩm gây ra bởi các dòng C.perfringens nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu Các triệu chứng ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ Nguồn thực phẩm có thể chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác Bào tử của C.perfringens có tính ... cho nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm phát triển Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy Vì vậy, vi c tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có thực phẩm cần thiết... phát thực phẩm nhiễm khuẩn, chất lượng, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng cho cộng đồng Xuất phát từ yêu cầu sinh vi n tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ... Feacal coliform (coliform phân) nhóm vi sinh vật dùng để thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Nhóm Coliform gồm vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý, Gram âm , không sinh bào tử, hình que,