Tìm hiểu một số phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm

Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đún

MỤC LỤC

Danh mục hình ảnh 5

Lời mở đầu 6

CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1 Samonella 7

1.2 Campylobacter 7

1.3 Clostridium perfringens 8

1.4 Clostridium botulinum 9

1.5 Staphylococcus aureus 10

1.6 Vibrio spp 11

1.7 Escherichia coli 12

1.8 Shigella spp 13

1.9 Coliforms 14

1.10 Listeria monocytogenes 15

1.11 Bacillus cereus 16

1.12 Aspergillus 17

1.13 Virus 18

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG 2.1 Samonella 20

2.1.1 Tổng quan 20

2.1.2 Nguyên tắc 20

2.1.3 Môi trường và hóa chất 21

2.1.4 Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 22

2.2 Vibrio 27

2.2.1 Tổng quan 27

2.2.2 Nguyên tắc 28

2.2.3 Môi trường và hóa chất 28

2.2.4 Quy trình phân tích 29

2.3 Listeria monocytogenes 31

2.3.1 Tổng quan 31

2.3.2 Nguyên tắc 32

2.3.3 Môi trường và hóa chất 32

2.3.4 Quy trình phân tích 33

2.4 Staphylococcus aureus 35

2.4.1 Tổng quan 35

2.4.2 Nguyên tắc 35

2.4.3 Môi trường và hóa chất 36

2.4.4 Phân tích định tính Staphylococus aureus 36

2.4.5 Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37

2.4.6 Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN 39

2.5 Bacillus Cereus 39

2.5.1 Tổng quan 39

2.5.2 Nguyên tắc 40

2.5.3 Môi trường và hóa chất 40

2.5.4 Quy trình phân tích 41

2.6 Clostridium 46

2.6.1 Tổng quan 46

2.6.2 Nguyên tắc 47

2.6.3 Môi trường và hóa chất 48

2.6.4 Quy trình phân tích 48

2.6.5 Báo cáo kết quả 49

2.7 Coliform và E.Coli 49

2.7.1 Tổng quan 49

2.7.2 Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli bằng phương pháp MPN 49

2.7.3 Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 52

2.7.4 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 55

2.8 Tổng nấm men nấm mốc 57

2.8.1 Tổng quan 57

2.8.2 Nguyên tắc 58

2.8.3 Môi trường và hóa chất 58

2.8.4 Quy trình phân tích định tính 59

2.8.5 Quy trình phân tích định lượng 59

CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1 Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 61

3.2 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63

3.3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 65

3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66

3.5 Một số phương pháp thử nhanh khác 70

3.5.1 Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 70

3.5.2 Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid

Membrane) 71

3.5.3 Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71

3.5.4 Kỹ thuật Redigel 72

3.5.5 Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72

3.5.6 Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73

3.5.7 Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73

KẾT LUẬN 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm thì ngoài những yêu cầu về sự

bỗ dưỡng, hợp khẩu vị, giá cả phải chăng còn có an toàn thực phẩm cũng là một trong những yêu cầu hàng đầu Số vụ ngộ độc thực phẩm cùng tỷ lệ bệnh ung thưđược cho là do ăn phải các chất gây ô nhiễm ngày càng gia tăng Trong số đó, nhiễm khuẩn chiếm tỉ lệ khá cao đang là mối lo của nhiều nước trên thế giới Việt Nam là nước đang phát triển thuộc vùng nhiệt đới Trình độ sản xuất còn thấp cộng với điều kiện khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện cho nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm phát triển Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra

Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là rất cần thiết nhằm phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, kém chất lượng, bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng và cho cộng đồng Xuất phát từ

yêu cầu trên sinh viên tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM.

2 Mục đích nghiên cứu

Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp xác định một số

vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm Qua đó giúp cho mọi người biết được có những mối nguy nào trong việc sử dụng thực phẩm và

phương pháp để kiểm nghiệm những thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật

3 Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận gồm 3 chương:

Chương 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong thực phẩm.Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống

Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống

CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM

SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1 Salmonella

Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu

tế bào trong một gram thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường

là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ

thực phẩm bị nhiễm Samonella đều bị ngộ độc Các loại thực phẩm có nguy cơ

bị nhiễm Samonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ

trứng, thủy sản Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người

và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp Đặc biệt nguy hiểm cho người là

các loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn.

Hình 1.1 Samonella

1.2 Campylobacter

Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc

biệt trong hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và chim Tuy nhiên các dòng

Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, không thể

phát triển ở nhiệt độ thấp hơn 30oC Các triệu chứng ngộ độc do vi sinh vật này gây ra là đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sảng, thỉnh thoảng có những biểu hiện bệnh giống như cảm cúm Thời gian ủ bệnh từ 2 – 11 ngày Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm, nước là nguồn có thể gây

nên ngộ độc do Campylobacter Campylobacter có thể hiện diện trong các loại

thực phẩm hút chân không Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên

có thể bi tiệt trùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pastuer và không

acid

Hình 1.2 Campylobacter

1.3 Clostridium perfringens

C.perfringens được tìm thấy trong đất, trong phân người Trước đây người

ta cho rằng chỉ các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan

máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm Ngày nay đã có những ghi nhận các vụ

ngộ độc thực phẩm gây ra bởi các dòng C.perfringens nhạy cảm với nhiệt, không

làm tan máu Các triệu chứng ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đauthắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ Nguồn thực phẩm có thể chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác Bào tử của

C.perfringens có tính bền đối với nhiệt nên chúng có thể sống sót qua quá trình

nấu chín, đặc biệt là khi đun nấu thực ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn Các bào tử sống sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm, tăng trưởng

Hình 1.3 Clostridium perfringens

1.4 Clostridium botulinum

Loài vi sinh vật này phân bố khắp nơi trong đất, nước, trong đường ruột các gia súc và các loài thủy sản Vi sinh vật này sinh độc tố botulin gây ngộ độc thịt làm thực phẩm cho người Triệu chứng lâm sàng khi ngộ độc là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt,

có thể dẫn đến tử vong Các triệu chứng trên biểu hiện 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm độc tố và kéo dài 2 – 6 ngày tùy theo mức độ nhiễm độc và

tình trạng sức khỏe của từng bệnh nhân Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao Điều kiện thích hợpcho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung

tính, không có các vi sinh khác cạnh tranh Độc tố botulin do C.botulinum dòng

E thường có nguồn gốc từ cá và các sản phẩm thủy sản Dòng vi sinh vật này thường phân lập được từ các mẫu bùn đáy tại các cửa sông

thường hay nhiễm các loài vi sinh vật này Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá trình chế biến.

Hình 1.5 Staphylococcus aureus

1.6 Vibrio spp

Các loài Vibrio thường hiện diện trong nước biển do chúng cần ion Na+ để

phát triển, một số loài có khả năng gây bệnh cho người là Vibrio cholera,

V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.hollisae, V.furnsii, V.mimicus, V.fluvialis, V.alginolyticus, V.cholerae là tác nhân gây nên các vụ dịch tả trên toàn thế giới

Loài vi sinh vật này được chia thành hai kiểu huyết thanh chính là O1 và không

O1 (non-O1) Kiểu huyết thanh O1 lại gồm ba kiểu huyết thanh phụ là Ogawa, Inaba và Eltor (còn được gọi là kiểu O139) Hai kiểu huyết thanh Inaba và

Ogawa ngày nay chỉ còn được tìm thấy tại các nước thuộc khu vực châu Á Trong khi đó, các vụ dịch tả trên thế giới lại gây ra bởi kiểu Eltor Dịch tả gây ra

bởi V.cholerae thường được lan truyền rất nhanh qua đường nước, gây nhiễm thực phẩm và truyền nhiễm qua con người khi điều kiện vệ sinh kém V.cholerae

tạo ra độc tố tả cholera-toxin, có độc tính mạnh: chỉ cần 5μg gây nhiễm qua đường miệng có thể gây ra tiêu chảy cho người trưởng thành Ngoài độc tố tả,

loài này cũng tiết ra một số độc tố tương tự shiga-toxin Nguồn thực phẩm có nguy cơ nhiễm và lan truyền dịch tả là nước uống, nước trái cây, rau quả, sữa và các sản phẩm sữa, các loại thủy sản tươi sống (không qua gia nhiệt hay gia nhiệt nhẹ).

Một loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng khác là V.parahaemolyticus

tạo độc tố hemolysin bền nhiệt có phản ứng kháng nguyên Kanagawa Tuy nhiên, những năm gần đây người ta phát hiện ra rằng nhiều dòng

V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm tính cũng có thể gây bệnh Triệu

chứng ngộ độc là đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột và tiêu chảy nhẹ xuất hiện 2 – 96 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào mật độ tế bào vi khuẩn đã xâm nhiễm và thể trạng của từng bệnh nhân.Loài vi khuẩn này hiện diện và tăng trưởng trong môi trường có hàm lượng muốicao, thường phân lập được từ các sản phẩm thủy sản, trong các vùng nước ấm ven biển

Các loài Vibrio khác khi xâm nhiễm vào trong thực phẩm cũng có thể gây nên các bệnh đường ruột và có biểu hiện bệnh lý tương tự như hai loài trên

Riêng loài V.vulnificus không gây các triệu chứng bệnh đường ruột mà gây

nhiễm trùng máu cho người

Hình 1.6 Vibrio cholerae Hình 1.7 V.vulnificus Hình 1.8 V.parahaemolyticus

1.7 Escherichia coli

E.coli là vi sinh vật hiếu khí tùy ý hiện diện trong đường ruột của người và

các loài động vật máu nóng Hầu hết các dòng E.coli không gây hại và đóng vai

trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột Tuy nhiên có 4 dòng có thể

gây bệnh cho người và một số loài động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) và

Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/Verocytoxin E.coli (VTEC) hay E.coli O157: H7 Các loài E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân

hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường Gần đây

người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước

ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên

E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn các

triệu chứng rối loạn đường tiêu hóa Biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể gây chết người phụ thuộc và mức độ nhiễm, dòng gây nhiễm và khảnăng đáp ứng của từng người

Hình 1.9 Escherichia coli

1.8 Shigella spp

Giống Shigella thuộc họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) gồm 4 loài khác nhau là S.dysenteriae, S.sonnei, S.plexneri và S.boydii Các loài

Shigella có tính chuyên biệt ký chủ cao, chỉ xâm nhiễm và tăng trưởng trong

người và các loài linh trưởng Trong môi trường nước các loài này có thể tồn tại

hơn 6 tháng Các vụ ngộ độc thực phẩm do Shigella gây ra chủ yếu tập trung ở

các nước kém phát triển, nơi việc sản xuất chế biến thực phẩm được thực hiện

trong điều kiện vệ sinh không đảm bảo Shigella cũng có thể lây nhiễm trực tiếp

từ người qua người Shigella chủ yếu gây nên các triệu chứng lỵ (bệnh lỵ trực

trùng) trong khoảng 1 – 7 ngày sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm Biểu hiện bệnh lý có thể thay đổi từ dạng nhẹ như tiêu chảy nhẹ đến mức nghiêm trọng (đặc biệt là ở trẻ em và người già) như đi tiêu ra máu, có những mảnh niêm mạc ruột, mất nước, sốt cao và bị co rút thành bụng Các triệu chứng trên có thể kéo dài từ 12 – 14 ngày thậm chí lâu hơn Hàng năm có khoảng nửa triệu người tử

vong do vi sinh vật gây bệnh này Vi khuẩn Shigella lây nhiễm chủ yếu qua nước

và thực phẩm Thực phẩm bị nhiễm Shigella từ nguyên liệu hay thông qua tiếp

xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm

Hình 1.10 Shigella

1.9 Coliforms

Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng

để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm ,

không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trườngnuôi cấy lỏng Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành hai

nhóm nhỏ là Coliform và Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động

vật Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn

Coliform Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng

bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter Khi Coliform phân

hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân Trong

các thành viên của nhóm Coliform phân thì E.coli là loài được sự quan tâm nhiều

nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm

Hình 1.11 Coliforms

1.10 Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở trẻ em,

phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây Mặc dù

L.monocytogenes chỉ hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi

được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại, khi có điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng nhanh xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh Triệu chứng bệnh thường bắt đầu là tiêu chảy, sốt nhẹ, sau đó là nhiễm trùng máu, tổn thương hệ thần kinhtrung ương, tim, mắt, gây nên sẩy thai, đẻ non hay nhiễm trùng thai nhi ở phụ nữ

mang thai L.monocytogenes ưa lạnh, tăng trưởng ở nhiệt độ từ 2 – 44oC, thường được phân lập từ phô mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước Loài này có thể nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn Các sản phẩm được thanh trùng

này rất cao

Hình 1.12 Listeria monocytogenes

1.11 Bacillus cereus

B.cereus là trực khuẩn Gram dương, sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng

được trong khoảng nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ưu ở 35 – 40oC, pH dao động từ 4,5 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng Vi khuẩn này hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô…)

-Vi khuẩn có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và

emetic toxin gây nôn mửa Ngộ độc thực phẩm gây ra bởi B.cereus khi thực

phẩm được chuẩn bị mà không được giữ trong điều kiện lạnh trong vài giờ trước khi sử dụng Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ trên 106 tế bào/g đủ gây ngộ

độc Triệu chứng ngộ độc phổ biến gây ra bởi B.cereus là đau bụng, tiêu chảy,

không sốt, bắt đầu 4 – 16 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm và kéo dài trong 12 – 24 giờ Một dạng triệu chứng ngộ độc khác là buồn nôn và nôn sau 1 – 2 giờ ănphải thực phẩm nhiễm khuẩn, không bị tiêu chảy, kéo dài khoảng 24 giờ

Hình 1.13 Bacillus cereus

1.12 Aspergillus

Aspergillus flavus và A.parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong

các loài nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra bởi nhiều chủng của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư Các nấm mốc này có thể phát triển ởnhiệt độ từ 7 – 40oC và tối ưu ở 24 - 28oC, do vậy có khả năng tăng trưởng tốt trên các loại ngũ cốc, nông sản (gạo, lúa, miến, đậu phộng, bắp, lúa mì…) khôngđược phơi sấy tốt, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt

độ không khí cao Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây độc cho người Ở các chủng có khả năng sinh độc tố, sau khi tăngtrưởng 1 – 3 ngày độc tố được tạo ra và tiết vào cơ chất Bốn loại aflatoxin được

tạo ra bởi A.flavus và A.parasiticus là aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) và G1, G2 phát huỳnh quang màu lục (green) Khi ăn cỏ hoặc thức ăn chứa aflatoxin B1 hoặc B2, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố aflatoxin M1, M2 hiện diện trong sữa bò Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt Hầu hết các nước đều có tiêu chuẩn quốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực phẩm, thường là 10ppb (một phần tỷ).

Hình 1.14 Aspergillus flavus Hình 1.15 A.parasiticus

1.13 Virus

Các vụ dịch bệnh gây ra do tác nhân virus từ thực phẩm cho đến nay vẫn

là vấn đề bí ẩn Các nghiên cứu về virus thực phẩm Đặc điểm sinh lý của virus đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, kỹ thuật PCR… người ta có thể phát hiện virus có hại cho con người trong thực phẩm Sự lan truyền virus qua người thông qua đường miệng đã được biết đến từ năm 1950 Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột được biết hiện nay chỉ một vài loại có khả năng gây bệnh cho người

(Hepatitis type A virus, HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non

A, Virus Non B) Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự nhân lên trong nước hay trong thực phẩm Chúng xâm nhiễm vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm Các loài nhuyễn thể ăn lọc như nghêu, sò… có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước làm mật

độ virus trong nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xung quanh.Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thể thấp hơn rất nhiều so với vi khuẩn Virus hiện diện trong cơ thể người và các loài động vật và được tìm thấy với số lượng lớn trong phân của những người bị nhiễm, tồn tại từ nhiều ngày đếnnhiều tuần Nước bị nhiễm phân là con đường lây nhiễm gián tiếp hay trực tiếp của virus vào thực phẩm Khả năng sống sót của virus trong môi trường hay trong thực phẩm phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, nồng độ muối, cường độ bức xạ mặt trời hay sự hiện diện của các thành phần hữu cơ khác Tất cả virus đường ruột đều có tính kháng với acid, các enzyme thủy phân, muối mật có trongđường tiêu hóa Một số virus có thể kháng nhiệt như virus viêm gan siêu vi A (HAV), hoặc kháng phenol, ethanol… Ô zôn và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột Để ngăn ngừa các bệnh do virus

từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín để khử virus trước khi dùng, các loại nhuyễn thể ăn lọc phải được khai thác từ, những vùng nước không

nhiễm virus hay được nuôi trong các vùng nước sạch trước khi tiêu thụ

Hình 1.16 Virus

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT

TRUYỀN THỐNG 2.1 Samonella

2.1.2 Nguyên tắc

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình

gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella

thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae

có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.

- Bước tăng sinh: tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi

- Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng

để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT) Các nghiên cứu gần đây của AOAC cho thấy môi trường RV có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều loại mẫu khác nhau Tuy vậy, môi trường TTthường được dùng để phân tích các loại mẫu chứa thịt tươi sống, các mẫu có mật

độ nhiễm cao, các loại thức ăn gia súc… Hiện nay người ta khuyến khích việc sửdụng ít nhất 2 loại môi trường tăng sinh chọn lọc để tăng cường khả năng phát

hiện được tất cả các serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.

- Bước phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi

sinh vật khác trong mẫu Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để

phân lập Salmonella, mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này

dựa trên một vài đặc tính Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích việc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để

tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt môi trường

XLD được khuyến khích sử dụng

- Bước khẳng định: nhằm xác nhận lại các khuẩn lạc đặc trưng cho

Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập Bước này dựa trên việc sử dụng

các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella

Các thử nghiệm được khuyến khích sử dụng là thử nghiệm KIA/TSI, indol, LDC(lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, lên men mannitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá Thông thường các phòng phân tích vi sinh thực phẩm không có khả năng xác định đến loại phụ hay

serotype mà chỉ xác nhận đến Salmonella spp Việc phân tích chính xác serotype

nhiễm vào thực phẩm thường đượcthực hiện tại các trung tâm vệ sinh phòng dịch hay các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.

2.1.3 Môi trường và hóa chất

- Nước pepton đệm (Buffered Peptone Water, BPW)

- Canh Rappaport – Vasiliadis Soya Pepton (RV)

- Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến)

- Tetrethionate Muller – Kauffmann (TT)

- Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

- Thạch Hektoen Entric Agar (HE)

- Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS)

- Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)

- Thạch Triple Sugar Iron (TSI)

- Canh Ure

- Canh Lysine Decarboxylase

- Canh Ornithine Decarboxylase

- Canh Mannitol (Phenol Red Broth Base)

- Canh Sucrose (Phenol Red Broth Base)

- Canh Sorbitol (Phenol Red Broth Base)

- Canh Tryptone

- Thuốc thử Kovac’s

- Kháng huyết thanh Salmonella đa giá

2.1.4 Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm

2.1.4.1 Tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong

15 hoặc 30 giây Ủ ở 37 1oC trong 18 – 24 giờ Đối với một số loại thực phẩm

có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần

thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt như sau:

- Đối với mẫu gia cầm tươi sống: đặt gia cầm vào một bao nhựa lớn, thêm

1 lít môi trường tăng sinh BPW Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trườngthấm được vào trong toàn bộ mẫu

- Đối với sữa khô: cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml môi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn

- Đối với các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đồng nhất mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi nuôi tăng sinh Biện pháp này nhằm làm giảm nồng độ các hợp chất ức chế sự

tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.

- Đối với các loại mẫu như casein, pho mát, bơ và các sản phẩm tương tự khác: thực hiện đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng sinh Rappapport-Vassliadis Soya Pepton đã được ủ ấm đến 42oC Ủ ở 42 0,2oC trong 18 – 24 giờ Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine Broth,

Tetrathionate Muller-Kauffman cũng được dùng Mỗi loại môi trường chỉ có tác

dụng chọn lọc trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số dòng

Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng

được trong môi trường khác Ví dụ Salmonella typhi không tăng trưởng được

trong môi trường Rappaport Vassiliadis và Tetrathionate Muller-Kaufmann, Salmonella Dublin không tăng trưởng được trong môi trường Rappaport

Vassiliadis Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện

diện trong mẫu thực phẩm cần phải dung ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được

ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 – 24 giờ

thiểu 2 môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu Các biểu

hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:

- Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có

tâm đen Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bong rất lớn có thể chiếm

gần hết khuẩn lạc

- Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonella có tâm đen

bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc

- Môi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen,

thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím Môi trường chung quanh khuẩn lạc

chuyển thành màu nâu và sau đố chuyển thành đen nếu kéo dài thời gian ủ

- Môi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hồng nhạt, trong suốt,

xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ

Tất cả các đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22 – 26 giờ 27auk hi

ủ, chọn các khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện bước

khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên

2.1.4.4 Khẳng định

Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trưởng không chọn lọc ví dụ như TSA Ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là lên men

glucose, lactose, saccharose, H2S, urea, indol, VP, ODC, LDC, sử dụng

mannitol, sorbitol Các chủng Salmonella cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa

như sau:

- Thử nghiệm sinh H2S (TSI hay KIA): Salmonella chỉ lên men được

đường glucose trong các môi trường trong các môi trường trên vì thế phần

nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng Đa số các dòng

Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng là vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo ra một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm

- Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuôi cấy môi trường chuyển thành kiềm, màu môi trường được chuyển thành màu như ban đầu (màu tím hay xanh)

- Thử nghiệm urea (-): Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu cam

- Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trường sau nuôi cấy bị acid hóa và chuyển thành màu vàng

- Thử nghiệm Indol và VP (-)

Các thử nghiệm kháng nguyên cần được thực hiện song song với mẫu chứng không bằng dung dịch nước muối sinh lý để loại trừ khả năng ngưng kết

giả Hai loại kháng huyết thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và

Salmonella Polyvalent H Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngưng kết với

kháng huyết thanh nhưng không có hiện tượng ngưng kết với nước muối sinh lý

2.1.4.5 Báo cáo kết quả

Quy trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính Salmonella, giúp kết luận có hay không có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, không cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng

kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gởi chủng

Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh

vật

Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm Do vậy

cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng

Salmonella dùng làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân

lập được Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa

2.2 Vibrio

2.2.1 Tổng quan

Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành

hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy cảm với

Vibriostaticum O/129 Trừ V.cholerae hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập

được từ các vùng nước ven biển Giống này có 4 loài là tác nhân gây bệnh cho

người gồm: V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus và V.alginolyticus

được phân biệt dựa trên các đặc điểm sau đây:

V.cholerae có phản ứng oxidase (+) tăng trưởng được trong môi trường

canh trypton ở 42oC, arginiae dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứa 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong các môi trườngchứa 6, 8, 10% muối

V.parahaemolyticus có phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh

trypton ở 24oC, phản ứng ADH (-), LDC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không

có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối.

V.vulnificus khác với hai loài nêu trên là không lên men sucrose, không

tăng trưởng được trong môi trường không có muối, bị ức chế trong môi trường

có 8 – 10% muối

V.alginolyticus có khả năng lên men đường sucrose, không tăng trưởng

được khi trong môi trường không có muối nhưng có thể phát triển trong môi trường chứa đến 10% muối

2.2.2 Nguyên tắc

Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học Môi trường tăng sinh chọn lọc

cho Vibrio cholera, V.alginolyticus và V.vulnificus là nước pepton kiềm Trong

khi đó môi trường Colistine Polymicine Broth thường được dùng để tăng sinh

V.parahaemolticus Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS

(Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar) Các vi sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh

2.2.3 Môi trường và hóa chất

- Canh Pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW)

- Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine)

- Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar)

- Canh Tryptone

- Thạch Kligler Iron (KI).

- Canh Hugh Leifon Glucose (HLG)

- Canh Carbohydrate tím

- Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller)

- Dung dịch oxidase

- Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%)

- Kháng huyết thanh polyvalent’O dùng cho V.cholerae

V.cholerae, V.vulnificus, V.alginolyticus, canh Colistine cho trường hợp

V.parahaemolyticus) Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ

2.2.4.2 Phân lập

Dùng que cấy vòng ria váng trên bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên

bề mặt đĩa thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ

Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các loài Vibrio trên môi trường này là như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V.alginolyticus lớn, đường kính khoảng 2 – 3mm,

láng, có màu vàng, hơi phẳng, tâm đục và chung quanh khuẩn lạc có quầng trắng

đục Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V.vulnificus lớn, đường kính khoảng 3 –

4mm, có màu xanh đến xanh dương Tiếp theo, cấy chuyển sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập sang môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa

2.2.4.3 Thử nghiệm sinh hóa

Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài

Vibrio là quan sát tính di động trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch

mềm và các thử nghiệm khác Các đặc điểm sinh hóa của V.cholerae là: ONPG

(+), lactose (-), ADH (-), LDC (+), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (+), oxidase (+), tính ưa mặn NaCl 0% (+), 3% (+), 6% (-), 8% (-), 10% (-) Các đặc

điểm sinh hóa của V.parahaemolyticus là: ONPG (-), lactose (-), ADH (-), LDC

(+), TDA (-), Indol (+), manose (+), sucrose (-), oxidase (+), tính ưa mặn NaCl 0% (-), 3%(+), 6% (+), 8% (+/-) 10% (-)

2.2.4.4 Thử nghiệm kháng huyết thanh:

Thử nghiệm ngưng kết huyết thanh được dùng để xác định các dòng Vibrio có các biểu hiện kháng nguyên chuyên biệt Trường hợp V.cholerae có thể phân biệt được các dòng V.cholera O1 và V.cholerae non-O1 (khác O1) như sau:

- Thử nghiệm với kháng huyết thanh đa giá polyvalent O nhóm 1: nhỏ mộtgiọt kháng huyết thanh O đa giá lên phiến kính sạch và một giọt nước muối sinh

lý lên một vị trí khác của phiến kính Dùng que cấy vô trùng chuyển vi khuẩn lên

2 giọt dung dịch trên, phân tán đều vi khuẩn vào trong giọt dung dịch Kết luận (+) khi có hiện tượng ngưng kết

- Xác định kiểu kháng nguyên O1: dùng kháng huyết thanh đơn giá Inaba

và Ogawa Kháng huyết thanh Inaba (+) khi kháng nguyên chỉ ngưng kết với kháng huyết thanh Inaba không ngưng kết với các nhóm khác hay dung dịch muối sinh lý Kháng huyết thanh Ogawa (+) khi kháng nguyên chỉ ngưng kết vớikháng huyết thanh Ogawa và không ngưng kết với các nhóm khác hay dung dịchmuối sinh lý Kháng huyết thanh Hikojima (+) khi kháng nguyên ngưng kết với kháng huyết thanh Ogawa và Inaba nhưng không ngưng kết với dung dịch muối sinh lý Phản ứng kháng nguyên là (-) khi chúng không ngưng kết với các nhóm kháng huyết thanh nêu trên và không ngưng kết với dung dịch muối sinh lý Trường hợp này có thể gặp do sai lầm trong thao tác thử nghiệm hoặc là do

chủng Vibrio nêu trên thuộc nhóm non-O1 Phản ứng ngưng kết là không đặc hiệu khi tất cả thử nghiệm kháng huyết thanh đều cho kết quả (+)

Trường hợp V.parahaemollyticus thực hiện ngưng kết với hai loại huyết

thanh là huyết thanh O và huyết thanh K Tuy nhiên trong một số trường hợp kháng nguyên O bị kháng nguyên K che lấp, vì thế cần phải xử lý chủng trước khi thực hiện ngưng kết với kháng nguyên O bằng cách dùng que cấy chuyển sinh khối của chúng trên môi trường thạch chọn lọc vào dung dịch nước muối 3%, hấp ở 121oC trong 1 giờ để biểu lộ kháng nguyên O ra bên ngoài

2.2.4.5 Báo cáo kết quả

Kết quả được báo cáo dưới dạng phát hiện hay không phát hiện V.cholera hay V.parahaemolyticus trong 25g mẫu.

Cần lưu ý Vibrio là nhóm chứa các dòng gây bệnh nên cần tuân thủ triệt

để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Vibrio dùng làm đối chứng

(+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa

2.3 Listeria monocytogenes

2.3.1 Tổng quan

L.monocytogenes là vi khuẩn có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương sau khi

nuôi cấy 20 giờ, cho thử nghiệm catalase (+), oxidase (-), chuyển động xoay trònthành đợt trong tiêu bản giọt treo (khi nuôi cấy ở 20 – 25oC), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu, sinh acid rhamnose

nhưng không xylose, có phản ứng CAMP (+) với Staphylococcus aureus và (-) với Rhodococcus equi L.monocytogenes là một số tác nhân gây bệnh listeriosis

rất nguy hiểm (nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi) có tỉ lệ tử vong rất cao (30 – 35% ở người lớn và 70% ở trẻ em) Loài này thường được phát hiện trong thức ăn gia súc, nước, nước thải, là loài đặc biệtnguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt Các quy định về an toàn vệ

sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện của L.monocytogenes trong

25g thực phẩm đã qua gia nhiệt nhưng cho phép 100 CFU/g đối với thực phẩm phải gia nhiệt trước khi sử dụng

2.3.2 Nguyên tắc

Quy trình phát hiện L.monocytogenes được thực hiện bằng quá trình tăng

sinh 2 giai đoạn Mẫu được cân vào trong túi PE vô trùng, đồng nhất với môi trường tăng sinh sơ cấp Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển vào môi trường tăng sinh thứ cấp và được ủ tiếp 24 giờ Hiện nay quy trình cải tiến cho phép tăng sinh một giai đoạn nhưng thời gian tăng sinh là 48 giờ Quy trình tăng sinh một giai đoạn được sử dụng khi các mẫu có mật độ vi sinh vật nhiễm thấp; quy trình tăng sinh hai giai đoạn được sử dụng cho các mẫu có mật độ vi sinh vậtnhiễm cao Sau bước tăng sinh, canh khuẩn được chuyển sang bước phân lập trên môi trường chọn lọc đặc trưng Các khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định

bằng các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa và miễn dịch bằng các thử

nghiệm đặc trưng Trong phát hiện L.monocytogenes cần sử dụng các chủng vi sinh vật làm đối chứng như: L.monocytogenes, L.innocua, S.aureus dung huyết yếu, R.equi.

2.3.3 Môi trường và hóa chất

- Canh tăng sinh sơ cấp Listeria Enrichment Broth I (LBI)

- Canh tăng sinh thứ cấp Listeria Enrichment Broth II (LBII) được chuẩn

- Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR)

- Thuốc thử catalase, oxidase

2.3.4 Quy trình phân tích

2.3.4.1 Tăng sinh

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh LBI bằng

Stomacher trong 30 giây Ủ 30oC trong 24 giờ Chuyển 0,1ml LBI sang ống 10ml LBII tiếp tục ủ ở 30oC trong 24 giờ Quy trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện như sau: Cân 25g mẫu, thêm vào 225ml canh EB (đã được làm

ấm ở 45oC nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và ở 30oC đối với các sản phẩm khác) và tiến hành đồng nhất mẫu trong 30 giây Ủ ở 30oC trong 48 giờ

2.3.4.2 Phân lập

Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, trải sang 1/2 đĩa môi trường Oxford Agar Từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn lại Ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ Trên môi trường này khuẩn lạc Listeria

có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, đường kính khoảng 1mm

2.3.4.3 Khẳng định

- Thử khả năng tan huyết: chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch Oxford, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường thạch máu, ủ ở 37oC

trong 24 – 48 giờ Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L.monocytogenes được

bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng Trước khi

tiến hành thử khẳng định, cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ L.monocytogenes sang

một môi trường lỏng không chọn lọc, ủ ở 25oC trong 20 giờ

- Thử nghiệm catalase và oxidase: L.monocytogenes có catalase (+) và

oxidase (-)

- Nhuộm gram: Listeria nhuộm gram dương.

- Khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp chuyển động xoay

tròn trong canh trùng ủ ở 25oC Thử tính di động trong ống nghiệm: cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong ống nghiệm, ủ 25oC trong 40 giờ hoặc

lâu hơn, kiểm tra sự tăng trưởng của vi khuẩn xung quanh đường cấy, Listeria

spp di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm.

- Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên menđường ở 37oC trong 7 ngày Kết quả (+) (màu vàng) thường quan sát được trong

vòng 24 – 48 giờ L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có

khả năng lên men đường xylose

- Thử thử nghiệm CAMP: trên đĩa thạch dùng để thử CAMP, cấy S.aureus thành một đường cấy mỏng, tương tự cấy R.equi để tạo thành hai đường cấy

song song cách nhau 4cm

Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy song song của S.aureus và R.equi Có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes (chủng thử nghiệm) để kiểm tra trên cùng một đĩa Cấy chủng đối chứng (+) L.monocytogenes và chủng L.innocua Ủ đĩa ở

37oC trong 20 – 36 giờ Phản ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết

rộng (5 – 10mm) và có hình dạng đầu mũi tên Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn L.monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và (-) với R.equi Ngược lại, L.innocua có phản ứng CAMP (-) với cả hai loài S.aureus và R.equi.

2.3.4.4 Báo cáo kết quả

Báo cáo phát hiện hoặc không phát hiện L.monocytogenes trong 25g mẫu.

2.4 Staphylococcus aureus

2.4.1 Tổng quan

Thuộc nhóm tụ cầu khuẩn, Gram dương, hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả năng lên men

và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S.aureus đều mẫn

cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu Đường kính vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩn lạc Sản sinh ra nội độc tố enterotoxin bền nhiệt dẫn đến ngộ độc thực

phẩm,các tế bào thường liên kết thành hình các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase làm đông huyết tương, không phân

bố trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu trên da và tóc của người và động vật Khi phát triển trong môi trường, tạo sắc tố có màu từ trắng tới vàng đậm Sự hiện diện với

mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát

nhiệt độ kém của quá trình chế biến

2.4.2 Nguyên tắc

S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng

đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trườngphân lập

2.4.3 Môi trường và hóa chất

- Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng

để phân tích định tính S.aureus hay trong định lượng bằng phương pháp MPN.

- Môi trường thạch máu: Máu được sử dụng là máu cừu hay bê non dưới 5tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chông đông citrate Môi trường cần được pha chế ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm

- Môi trường thạch Baird Parker Agar (BPA): thành phần lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng vàlàm nguội đến khoảng 60oC

- Môi trường thạch Tellurite Glycine Agar (TGA)

- Môi trường Brain Heart Infusion (BHI)

- Huyết tương thỏ: huyết tương thỏ được cố định bằng 0,1% EDTA hay sodium oxalate và được phân phối 0,3ml vào các ống nghiệm nhỏ

2.4.4 Phân tích định tính Staphylococus aureus:

Lấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trường chuyển từ đỏ sang màu vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGAhay thạch Baird Parker, ủ ở 37oC trong 24 giờ Tìm khuẩn lạc đặc trưng của

S.aureus trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính

1 – 1,5mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 37oC trong 24 giờ Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật Mẫu

được kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này (+) (có sự xuất hiện

của khối đông trong khi ống đối chứng không có)

2.4.5 Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

2.4.5.1 Đồng nhất mẫu và pha loãng

Cân chính xác 10 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấymột thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc/đĩa

2.4.5.2 Phân lập trên môi trường chọn lọc

Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bềmặt môi trường cho đến khi khô Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi độ pha loãng Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu Lật