LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM

MỤC LỤC Danh mục hình ảnh 5 Lời mở đầu 6 CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1. Samonella 7 1.2. Campylobacter 7 1.3. Clostridium perfringens 8 1.4. Clostridium botulinum 9 1.5. Staphylococcus aureus 10 1.6. Vibrio spp 11 1.7. Escherichia coli 12 1.8. Shigella spp 13 1.9. Coliforms 14 1.10. Listeria monocytogenes 15 1.11. Bacillus cereus 16 1.12. Aspergillus 17 1.13. Virus 18 CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG 2.1. Samonella 20 2.1.1. Tổng quan 20 2.1.2. Nguyên tắc 20 2.1.3. Môi trường và hóa chất 21 2.1.4. Quy trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 22 1 2.2. Vibrio 27 2.2.1. Tổng quan 27 2.2.2. Nguyên tắc 28 2.2.3. Môi trường và hóa chất 28 2.2.4. Quy trình phân tích 29 2.3. Listeria monocytogenes 31 2.3.1. Tổng quan 31 2.3.2. Nguyên tắc 32 2.3.3. Môi trường và hóa chất 32 2.3.4. Quy trình phân tích 33 2.4. Staphylococcus aureus 35 2.4.1. Tổng quan 35 2.4.2. Nguyên tắc 35 2.4.3. Môi trường và hóa chất 36 2.4.4. Phân tích định tính Staphylococus aureus 36 2.4.5. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 37 2.4.6. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN 39 2.5. Bacillus Cereus 39 2.5.1. Tổng quan 39 2.5.2. Nguyên tắc 40 2.5.3. Môi trường và hóa chất 40 2.5.4. Quy trình phân tích 41 2.6. Clostridium 46 2.6.1. Tổng quan 46 2.6.2. Nguyên tắc 47 2 2.6.3. Môi trường và hóa chất 48 2.6.4. Quy trình phân tích 48 2.6.5. Báo cáo kết quả 49 2.7. Coliform và E.Coli 49 2.7.1. Tổng quan 49 2.7.2. Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E.coli bằng phương pháp MPN 49 2.7.3. Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 52 2.7.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 55 2.8. Tổng nấm men nấm mốc 57 2.8.1. Tổng quan 57 2.8.2. Nguyên tắc 58 2.8.3. Môi trường và hóa chất 58 2.8.4. Quy trình phân tích định tính 59 2.8.5. Quy trình phân tích định lượng 59 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT KHÔNG TRUYỀN THỐNG 3.1. Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh 61 3.2. Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 63 3.3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 65 3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 66 3.5. Một số phương pháp thử nhanh khác 70 3.5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ 70 3 3.5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) 71 3.5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) 71 3.5.4. Kỹ thuật Redigel 72 3.5.5. Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance) 72 3.5.6. Kỹ thuật đo vi lượng calorie (Microcalorimetry) 73 3.5.7. Kỹ thuật đo mức phóng xạ (Radiometry) 73 KẾT LUẬN 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 4 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Samonella. Hình 1.2 Campylobacter. Hình 1.3 Clostridium perfringens. Hình 1.4 Clostridium botulinum. Hình 1.5 Staphylococcus aureus. Hình 1.6 Vibrio cholerae. Hình 1.7 V.vulnificus. Hình 1.8 V.parahaemolyticus. Hình 1.9 Escherichia coli. Hình 1.10 Shigella. Hình 1.11 Coliforms. Hình 1.12 Listeria monocytogenes. Hình 1.13 Bacillus cereus. Hình 1.14 Aspergillus flavus. Hình 1.15 A.parasiticus. Hình 1.16 Virus. 5 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay người tiêu dùng lựa chọn thực phẩm thì ngoài những yêu cầu về sự bỗ dưỡng, hợp khẩu vị, giá cả phải chăng còn có an toàn thực phẩm cũng là một trong những yêu cầu hàng đầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm cùng tỷ lệ bệnh ung thư được cho là do ăn phải các chất gây ô nhiễm ngày càng gia tăng. Trong số đó, nhiễm khuẩn chiếm tỉ lệ khá cao đang là mối lo của nhiều nước trên thế giới. Việt Nam là nước đang phát triển thuộc vùng nhiệt đới. Trình độ sản xuất còn thấp cộng với điều kiện khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện cho nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm phát triển. Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra. Vì vậy, việc tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là rất cần thiết nhằm phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, kém chất lượng, bảo vệ sức khỏe của người tiêu dùng và cho cộng đồng. Xuất phát từ yêu cầu trên sinh viên tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM. 2. Mục đích nghiên cứu Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp xác định một số vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm. Qua đó giúp cho mọi người biết được có những mối nguy nào trong việc sử dụng thực phẩm và phương pháp để kiểm nghiệm những thực phẩm nghi ngờ có nhiễm vi sinh vật. 3. Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp Khóa luận gồm 3 chương: Chương 1: Các chỉ tiêu vi sinh vật thường được kiểm soát trong thực phẩm. Chương 2: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật truyền thống. Chương 3: Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật không truyền thống. 6 CHƯƠNG 1: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT THƯỜNG ĐƯỢC KIỂM SOÁT TRONG THỰC PHẨM 1.1. Salmonella Salmonella có thể gây ngộ độc thực phẩm khi hiện diện đến mức cả triệu tế bào trong một gram thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm cho đến khi các triệu chứng được biểu hiện là 12 – 36 giờ. Triệu chứng ngộ độc thường kéo dài từ 2 – 7 ngày. Không phải tất cả mọi người khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm Samonella đều bị ngộ độc. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Samonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Đặc biệt nguy hiểm cho người là các loài Samonella typhi, S.paratyphi A, B, C gây sốt thương hàn. 7 8 Hình 1.1 Samonella 1.2. Campylobacter 9 Campylobacter gây bệnh viêm nhiễm đường ruột, hiện diện khắp nơi, đặc biệt trong hệ vi sinh vật của nhiều loại động vật và chim. Tuy nhiên các dòng Campylobacter gây ngộ độc thực phẩm thuộc loại ưa nhiệt bắt buộc, không thể phát triển ở nhiệt độ thấp hơn 30 o C. Các triệu chứng ngộ độc do vi sinh vật này gây ra là đau nhức, tiêu chảy, sốt, đau đầu, khó chịu, chuột rút, lạnh cóng, mê sảng, thỉnh thoảng có những biểu hiện bệnh giống như cảm cúm. Thời gian ủ bệnh từ 2 – 11 ngày. Các sản phẩm sữa, thịt gia cầm, nước là nguồn có thể gây nên ngộ độc do Campylobacter. Campylobacter có thể hiện diện trong các loại thực phẩm hút chân không. Các loài này rất nhạy cảm với nhiệt độ và acid nên có thể bi tiệt trùng hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pastuer và không tăng trưởng được trong thực phẩm có tính acid. Hình 1.2 Campylobacter 1.3. Clostridium perfringens C.perfringens được tìm thấy trong đất, trong phân người. Trước đây người ta cho rằng chỉ các dòng C.perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm. Ngày nay đã có những ghi nhận các vụ 10 [...]... ra do tác nhân virus từ thực phẩm cho đến nay vẫn là vấn đề bí ẩn Các nghiên cứu về virus thực phẩm Đặc điểm sinh lý của virus đường ruột, phương pháp nuôi cấy, phát hiện virus trong thực phẩm cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế Tuy nhiên, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, kỹ thuật PCR… người ta có thể phát hiện virus có hại cho con người trong thực phẩm Sự lan truyền virus qua người... tiếp xúc bề mặt trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm Hình 1.10 Shigella 1.9 Coliforms 16 Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Nhóm Coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm , không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường... Các virus gây bệnh đường ruột cho người chủ yếu có nguồn gốc từ các sản phẩm thủy sản Trong khoảng hơn 100 loại virus đường ruột được biết hiện nay chỉ một vài loại có khả năng gây bệnh cho người 20 (Hepatitis type A virus, HAV, Norwalk virus, Calicivirus, Astrovirus, Virus Non A, Virus Non B) Virus tồn tại ở thể không hoạt động khi ở bên ngoài tế bào, không thể tự nhân lên trong nước hay trong thực phẩm. .. Coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật Trên thực tế kiểm nghiệm Coliform phân được quan tâm nhiều hơn Coliform Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter Khi Coliform phân hiện diện ở số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong. .. mai, sữa, thịt cá, rau quả và trong nước Loài này có thể nhiễm vào thực phẩm ở mọi công đoạn trong quy trình chế biến thực phẩm, sữa hay rau quả Đặc biệt, trong thời gian bảo quản thực phẩm ở nhiệt độ thấp, loài này có cơ hội tăng trưởng thành số lượng lớn Các sản phẩm được thanh trùng bằng phương pháp Pastuer và được bảo quản trong các tủ lạnh có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này rất cao Hình 1.12 Listeria... của từng bệnh nhân Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định, thực phẩm nhiễm đất, phân động vật được chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách có nguy cơ gây ngộ độc bởi vi sinh vật này rất cao Điều kiện thích hợp cho sự tăng trưởng và tạo độc tố của vi sinh vật này là điều kiện kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh khác... vào thực phẩm hoàn toàn do quá trình chế biến, từ nước bị ô nhiễm Các loài nhuyễn thể ăn lọc như nghêu, sò… có khả năng tích lũy nhiều virus trong nước làm mật độ virus trong nhuyễn thể cao hơn rất nhiều so với môi trường nước xung quanh Liều lượng gây nhiễm của virus từ thực phẩm có thể thấp hơn rất nhiều so với vi khuẩn Virus hiện diện trong cơ thể người và các loài động vật và được tìm thấy với số. ..ngộ độc thực phẩm gây ra bởi các dòng C.perfringens nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu Các triệu chứng ngộ độc do độc tố của vi sinh vật này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ Nguồn thực phẩm có thể chứa các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác Bào tử của C.perfringens có tính... ruột đều có tính kháng với acid, các enzyme thủy phân, muối mật có trong đường tiêu hóa Một số virus có thể kháng nhiệt như virus vi m gan siêu vi A (HAV), hoặc kháng phenol, ethanol… Ô zôn và chlorine là những tác nhân có thể làm bất hoạt một vài loại virus đường ruột Để ngăn ngừa các bệnh do virus từ thực phẩm, các loại thức ăn phải được nấu chín để khử virus trước khi dùng, các loại nhuyễn thể ăn lọc... trình phân tích đánh định tính Salmonella trong thực phẩm 2.1.4.1 Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 24 15 hoặc 30 giây Ủ ở 37 1oC trong 18 – 24 giờ Đối với một số loại thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh . trên sinh vi n tiến hành đề tài: TÌM HIỂU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT GÂY BỆNH CÓ TRONG THỰC PHẨM. 2. Mục đích nghiên cứu Nội dung báo cáo là giới thiệu về đặc trưng và phương pháp. Tình hình ngộ độc thực phẩm liên tục xảy ra. Vì vậy, vi c tìm hiểu quy trình, phương pháp phân tích vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là rất cần thiết nhằm phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn,. pháp xác định một số vi sinh vật gây ngộ độc thường xuất hiện trong thực phẩm. Qua đó giúp cho mọi người biết được có những mối nguy nào trong vi c sử dụng thực phẩm và phương pháp để kiểm