ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁC CHẤT GÂY DỊ ỨNG NGUỒN GỐC TỪ CÂY HỌ ĐẬU VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT NÀY TRONG THỰC PHẨM

Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh LỜI MỞ ĐẦU Các họ Đậu đậu nành, đậu phộng, đậu xanh, đậu đỏ với hàm lượng protein, lipid, khống chất vitamin cao nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho người Do ta khơng ngạc nhiên sản phẩm thực phẩm từ họ đậu ngày sản xuất sử dụng phổ biến Tuy nhiên, số cá thể đặc biệt lại có phản ứng dị ứng số chất họ đậu tỉ người mắc bệnh dị ứng ngày gia tăng Chính nhà nghiên cứu quan tâm đến việc nghiên cứu chất gây dị ứng có nguồn gốc từ họ đậu đạt thành tựu định Nhiệm vụ đồ án “Tổng quan tài liệu chất gây dị ứng có nguồn gốc từ họ Đậu phương pháp xác định chất thực phẩm” tìm hiểu chất, cấu tạo, tính chất chất gây dị ứng từ họ đậu mà đặc biệt đậu phộng đậu nành; phương pháp để xác định phương pháp để giảm hay loại bỏ chất thực phẩm Em xin chân thành cảm ơn cô Vũ Thị Kim Hạnh hướng dẫn giúp đỡ để em hoàn thành đồ án Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Chương KHÁI QUÁT VỀ DỊ ỨNG THỰC PHẨM 1.1 Khái niệm dị ứng thực phẩm Dị ứng thực phẩm nghĩa thể có phản ứng miễn dịch khác thường loại thực phẩm mà đa số người khác khơng gặp phải Dị ứng thực phẩm xảy số cá thể định, đặc biệt thường xảy trẻ em Trên giới, trẻ em bị dị ứng thực phẩm chiếm 4-8% người trưởng thành 2-3% [1,2] 1.2 Các thực phẩm gây dị ứng Theo FAO nhóm thực phẩm liên quan đến 90% trường hợp dị ứng thực phẩm bao gồm : họ Đậu (đậu phộng, đậu nành, đậu xanh, đậu trắng…), loạt hạch (hạnh nhân, hạt dẻ ), hạt mè, lúa mì, cá hải sản vỏ cứng, sữa, trứng [1,7] 1.2.1 Cây họ Đậu Cây họ đậu có tên khoa học Leguminosae (hay Fabaceae sensu lato) gồm số loài quan trọng bậc cung cấp thực phẩm cho người, chẳng hạn loại đậu, đỗ, đậu phộng, đậu nành, đậu lăng [3] Tuy nhiên giá trị dinh dưỡng cao, số loại đậu mà chủ yếu đậu phộng đậu nành có khả gây dị ứng số cá thể [3] Ở đậu phộng, Ara h1và Ara h hai chất gây dị ứng chủ yếu Ngịai cịn có Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h [1] Ở đậu nành, chất gây dị ứng gồm Gly m Bd 28K, Gly m Bd 30K Gly m Bd 60K [1] Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh a) b) c) d) Hình 1.1: Các loại đậu a) đậu phộng, b) đậu trắng, c) đậu xanh, d) đậu nành 1.2.2 Các loại hạch Trên giới khoảng 1,1% dân số dị ứng với sản phẩm từ loại hạch hạnh nhân, hạt dẻ, hạt điều, óc chó [1] Ở Châu Âu phỉ (hazelnut) loại gây dị ứng chủ yếu nhóm loại hạch, cịn Châu Mỹ đứng đầu óc chó, hạt điều, hạnh nhân hồ đào pecan.Chất gây dị ứng phỉ gồm Cor a1, Cor a2, Cor a3, Cor a4; hạt dẻ Cas 1, Cas 2, Cas 3, Cas 4, Cas [1] a) b) Hình 1.2: Các loại hạch a) hạt dẻ, b) hạt phỉ, c) hạt điều c) Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 1.2.3 Sữa bị Hình 1.3: Sữa bị Sữa bị loại thực phẩm gây dị úng phổ biến Theo nghiên cứu cho thấy người bị dị ứng sữa bò chiếm khoảng 2% Úc, 1,9% Phần Lan, 3,2% Pháp; 3,9% Đức, 4% Nhật 1,4% Mỹ.[1].Đặc biệt dị ứng sữa bò thường xảy 2-3% trẻ sơ sinh Tuy nhiên khỏang 85-90% trẻ triệu chứng dị ứng với sữa lớn lên [1,4] Hàm lượng protein sữa bò khỏang 30-35g/l gồm hai nhóm casein (chiếm 80%) whey (chiếm 20%) Cả hai nhóm chứa các chất có khả gây dị ứng Trong đó, casein (Bos d 8) chất gây dị ứng chủ yếu sữa bị Ngồi nhóm whey protein có chất gây dị ứng lactalbumin (Bos d 4) lactoglobulin (Bos d 5) Nhiểu nghiên cứu cho thấy với lượng nhỏ, sữa bị gây triệu chứng dị ứng nghiêm trọng [1,4] Vì tương đồng cấu trúc protein casein whey protein sữa bò với sữa dê sữa cừu, người dị ứng với sữa bị thường khơng thể dung nạp sản phẩm từ sữa dê sữa cừu [1,4] 1.2.4 Trứng Hình 1.4: Trứng Khoảng 3,2% dân số Úc 2,8% dân số Đức bị dị ứng với trứng sản phẩm từ trứng Hiện tượng thường gặp trẻ sơ sinh.Theo nghiên cứu Taylor Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh năm 1999, liều lượng gây dị ứng cho nằm vùng từ 0,13mg (toàn trứng sống) đến 200mg (tồn trứng chiên) [1] Trong lịng trắng trứng có chất gây dị ứng Ovomucoid (Gal d 1), Ovalbumin (Gal d 2), Ovotransferrin (Gal d 3), Lysozyme (Gal d 4) Đây chất gây dị ứng chủ yếu [1,4,5] Trong lịng đỏ trứng có chất gây dị ứng chiếm thiểu số, α-livitin (Gal d 5) [1] 1.2.5 Cá Chất gây dị ứng chủ yếu cá protein thuộc nhóm parvalbumin Các chất thường gặp cá tuyết, cá hồi, cá thu, cá trích, cá bơn Ở cá tuyết ta thấy có chất Gad c1, cá hồi Sal s1 [1] Với tính chất bền nhiệt, chất gây dị ứng cá loại bỏ chế biến nhiệt [1] a) b) Hình 1.4: Cá a) cá tuyết b) cá hồi 1.2.6 Hải sản Trypomyosin, loại protein bền nhiệt, chất gây dị ứng thường thấy lồi hải sản tơm, cua, mực, bào ngư a) b) c) Hình 1.5: Các loại hải sản a) Tôm, b) Cua, c) Bào ngư Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 1.2.7 Lúa mì Hạt lúa mì có chứa bốn loại protein albumin, globulin, gliadin (prolamin) glutenin (glutelin) Trong gliadin glutelin hai protein thường gây dị ứng Theo nghiên cứu Battais huyết từ người dị ứng hạt lúa mì 60% α/β gliadin, 55% γ- gliadin glutenin phân tử lượng thấp, 48% ω-gliadin 26% glutenin cao phân tử [1] Đặc biệt dị ứng với gliadin hạt lúa mì dẫn tới bệnh tạng phù nghiêm trọng [1,3] 1.3 Nguyên nhân gây dị ứng Khi ăn loại thực phẩm gây dị ứng, thể tạo kháng thể đặc biệt Immunoglobine E (IgE) để chống lại chất protein lạ có thực phẩm (chất gây dị ứng) Phản ứng miễn dịch làm phóng thích chất histamine hóa chất bảo vệ khác Những hóa chất gây hững phản ứng kích hoạt ảnh hưởng tới hệ hơ hấp, hệ tiêu hóa, da hệ tim mạch Đây phản ứn miễn dịch thể dịch [4,5] 1.3.1 Khái niệm phản ứng miễn dịch thể dịch Miễn dịch thể dịch chế miễn dịch đặc hiệu biểu sản sinh kháng thể có khả tương tác đặc hiệu với chất lạ thể phá hủy vơ hiệu hóa chúng Những kháng thể sản sinh từ lympho B [4] 1.3.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng miễn dịch 1.3.2.1 Kháng nguyên Trong phản ứng miễn dịch dị ứng chất gây dị ứng có vai trị kháng nguyên a) Khái niệm kháng nguyên: Các yếu tố lạ xuất thể động vật có khả gây đáp ứng miễn dịch gọi kháng nguyên [4] b) Tính chất kháng nguyên − Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu kháng ngun đặc tính mà kháng ngun có khả kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng (trong trường hợp đáp ứng miễn dịch dịch thể) có khả kết hợp đặc hiệu với thụ thể bề mặt lympho T (trong trường hợp miễn dịch tế bào) [4] Tính đặc hiệu kháng ngun khơng phải tồn cấu trúc phân tử kháng nguyên định mà “nhóm định” (epitope) kháng nguyên định, đoạn nhỏ phận nhỏ nằm bề mặt phân tử Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh kháng nguyên định Nhóm định kháng ngun khơng định tính đặc hiệu sinh kháng thể tương ứng, mà vị trí để kháng thể đó, lympho bào mẫn cảm gắn với kháng nguyên cách đặc hiệu [4] Nếu kháng nguyên có nhóm định kích thích thể sinh loại kháng thể tương ứng kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với loại kháng thể mà thơi [4] Nếu kháng ngun có nhiều nhóm định có nhiều kháng thể tương ứng sinh ra, nhóm định kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng nhóm [4] Có nhóm định kháng ngun có nhiêu loại kháng thể kết hợp đặc hiệu độc lập với nhau[4] − Tính lạ (nonself) Những chất lạ với thể túc chủ có tính kháng ngun mạnh, tính kháng ngun mạnh loài xa nguồn gốc tổ tiên [4] − Trọng lượng phân tử đủ lớn Những chất có phân tử lượng lớn cấu trúc phức tạp tính sinh miễn dịch cao, thơng thường phải có phân tử lượng từ 10 kDa, nhiên có trường hợp ngoại lệ dextran, gelatin có phân tử lượng lớn khơng có tính kháng nguyên, trái lại insulin phân tử lượng có 6000, glucagon phân tử lượng 3800 lại có tính kháng nguyên cao [4] − Cấu trúc phân tử phức tạp Những chất có chất protein phức tạp cấu tạo từ polysaccharide có tính sinh miễn dịch cao dễ bị đại thực bào nuốt xử lý, cịn chất có chất lipid, acid nucleic tính sinh miễn dịch yếu khơng có, chất muốn trở thành kháng nguyên phải gắn với "protein mang" có chứa acid amin mạch vòng tyrozin, tryptophan acid amin mạch vòng khác [4] 1.3.2.2 Kháng thể a) Khái niệm Globulin miễn dịch hay kháng thể (Immuglobulin - Ig)là protein có huyết dịch sinh học thể (nước tiểu, sữa ) có khả liên kết đặc hiệu với kháng nguyên kích thích sinh Kháng thể theo định nghĩa gọi kháng thể miễn dịch hay kháng thể đặc hiệu Những kháng thể có sẵn từ trước có tiếp xúc với kháng nguyên gọi kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu Ở xem xét kháng thể đặc hiệu [4] Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Bản chất kháng thể protein, nên tác nhân hóa, lý acid, kiềm nhiệt độ phá hủy kháng thể Hoạt tính kháng thể phụ thuộc vào pH mơi trường nhiều yếu tố khác Amone sulfat, natri sulfat, cồn 5°C làm kết tủa kháng thể khơng làm tính chất chúng Do người ta lợi dụng tính chất để tinh kháng thể [4] Hai đặc tính sinh học quan trọng kháng thể khả phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên khả biểu kháng nguyên, tức kích thích sinh kháng thể chống laị Kháng thể chống lại kháng thể gọi kháng kháng thể Khi kết hợp với kháng nguyên kháng thể có xu hướng ức chế tiêu diệt kháng nguyên Đặc biệt hoạt tính kháng thể không vĩnh viễn [4] b) Cấu trúc chức phân tử kháng thể Cấu trúc phân tử kháng thể hình thành từ hai loại chuỗi polypeptide chuỗi nặng (ký hiệu: H=Heavy chain) có khối lượng phân tử từ 53-59 kDa chuỗi nhẹ (ký hiệu: L=Light chain) có khối lượng phân tử 22-26 kDa Cả bốn chuỗi gắn với cầu disunfid (S-S) Trung tâm hoạt động phần liên kiết với kháng nguyên nằm vùng tận N chuỗi nặng chuỗi nhẹ có cấu trúc khoảng 8-10 amino acid [4,22] Các phân tử Ig có đặc tính hoạt động miễn dịch theo hai chức năng: - Có khả liên kết với kháng nguyên hai vị trí tiếp nhận kháng nguyên nhờ biến đổi kỳ diệu phần tận NH2 phân tử kháng thể - Phần tận COOH phân tử kháng thể có khả thực số lớn hoạt động sinh học ảnh hưởng liên kết với thụ thể bề mặt tế bào Tất kháng thể có cấu trúc phân tử khác mức độ vùng liên kết với kháng nguyên [4.22] Nhìn chung phân tử kháng thể chia làm hai phần: phần Fab phần liên kết với kháng nguyên, phần Fc phần dễ kết tinh phản ứng với tế bào hệ thống miễn dịch qua thụ thể tế bào Dùng enzyme papain hay pepsin cắt kháng thể thành hai mảnh Fab Fc, F(ab’)2 tương ứng 4,22[] Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cơ Vũ Thị Kim Hạnh Hình 1.6: cấu trúc kháng thể [ 4] c) Phân loại kháng thể  Theo cấu trúc chức miễn dịch người ta chia thành loại kháng thể IgG, IgM, IgA, IgD, IgE − Đặc điểm IgG: IgG chiếm 80% tổng số Ig huyết Đây Ig truyền từ mẹ sang con, IgG Ig có thể Ở người , IgG có khoảng 14mg/1ml serum [5,16] IgG gồm có phân lớp IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG 4.Nó thực chức trung hịa độc tố sinh hóa học; hoạt hóa bổ thể, thực bào tế bào vi khuẩn Phản ứng điển hình IgG ngưng kết vi khuẩn trung hòa virus [5,16] − Đặc điểm IgM: IgM chiếm 8% Ig serum, không truyển từ mẹ sang hình thành vào tháng cuối thai nhi [5] IgM gồm phân lớp IgM IgM Nó tổng hợp nhanh (hơn IgG) có hoạt tính kháng ngun hoạt hóa bổ thể nhanh mạnh [5] − Đặc điểm IgA IgA có dạng Ig A huyết (trong máu) IgA tiết (trong sữa, nước tiểu, dịch xoang…) Đây loại kháng thể yếu, đời sống ngắn (khơng q ngày) [5] IgA có phân lớp IgA IgA Chức tham gia kháng nguyên nhóm máu [5] − Đặc điểm IgD: Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cơ Vũ Thị Kim Hạnh IgD có nồng độ thấp máu, mẫn cảm với protease ln có xu hướng tự phân giải Chức chưa biết hết [5] − Đặc điểm IgE IgE có nồng độ thấp serum tăng nhanh nhiễm trùng hay dị ứng Do có có vai trị chủ yếu dị ứng , nhiểm kí sinh trùng, chất độc sinh học [5]  Theo số kháng nguyên kết hợp ta có loại kháng thể đơn dòng kháng thể đa dòng Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody = Mab) epitope kích thích sinh kết hợp với epitope [5] Kháng thể đa dịng (polyclonal antibody = Pab) kháng thể nhiều epitope kháng nguyên kích thích sinh ra, chúng có khả kết hợp với nhiều epitope phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể [5] 1.3.2.3 Đại thực bào Đại thực bào có mặt khu vực tiếp giáp với bên ngoài: phổi, gan, hạch Người ta thấy chúng lách, máu (tế bào mono), mạc, não Đại thực bào máu có tên monocyte, chiếm % tổng số bạch cầu Đại thực bào trưởng thành có mặt quan, tổ chức với tên gọi khác Đại thực bào loại tế bào to có hình thái khác nơi khác Chúng di chuyển cố định mô [9] Đại thực bào giữ vai trò trung tâm đáp ứng miễn dịch Chúng vừa tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ban đầu vừa tham gia vào đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu đại thực bào làm nhiệm vụ bắt giữ tiêu diệt vật lạ, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, chúng gây cảm ứng đáp ứng qua vai trị trình diện kháng nguyên cho tế bào T, đồng thời tham gia vào pha hiệu ứng đáp ứng qua vai trò tiêu diệt tế bào u vi sinh vật Chúng có chức điều hịa đáp ứng miễn dịch [9] 1.3.2.4 Phức hịa hợp mơ MHC II Phức hợp hồ hợp mơ chủ yếu MHC (Major Histocompability complex) có vai trị quan trọng trình diện kháng ngun đáp ứng miễn dịch Protein MHC làm nhiệm vụ nơi trung chuyển phân tử [10] Các kháng nguyên hồn tồn khơng thể trình diện dạng ngun thủy, trực tiếp với tế bào B đặc biệt cho tế bào T, kháng nguyên hoàn toàn phải tế bào trình diện kháng nguyên (antigen presenting cells-APC) xử lý nghĩa 10 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh  Chuẩn bị đoạn mồi Đoạn mồi xuôi (F): 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’ Đoạn mồi ngược (R): 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’ [] pcr for soy  Chuẩn bị hỗn hợp Ta chuẩn bị hỗn hơp gồm thành phần sau − 2µL dịch trích DNA − 36.6 µL nước cất hai lần − 5µL dung dịch đệm GeneAmp PCR gồm 500mM KCl, 100mM TrisHCl (pH 8.3), 15mM MgCl 0.01% w/v gelatin − µL primer ( nồng độ 10 µM ) − µL dung dịch dNTP (5 mM) − 0.4 µL AmliTag DNA polymerase (5U/µL) − 5µL uracil-N-glycosylase (UNG, 1u/µL) Điều kiện tiến hành Ta chỉnh thơng số theo chế độ nhiệt sau Bảng 4.4: Điều kiện tiến hành khuếch đại Ara h2 Giai đoạn Hoạt hóa UNG Họat hóa polymerase PCR Biến tính (55 chu Gắn mồi kì) Kéo dài Điều kiện 50oC/ phút 95oC / phút 95oC/ 20 giây 600C / 30 giây 720C/ 60 giây 87 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Chương PHƯƠNG PHÁP LÀM GIẢM HAY LOẠI BỎ CHẤT GÂY DỊ ỨNG Hiện y học chưa tìm phương pháp để điều trị bệnh dị ứng thực phẩm Việc chữa trị thuốc điều trị triệu trứng Lời khuyên tốt bệnh nhân dị ứng thực phẩm tránh thức ăn có chứa nhân tố gây dị ứng điều khó thực phẩm gây dị ứng đậu phộng đậu nành lại phổ biến Hơn nữa, hai loại đậu lại có giá trị dinh dưỡng cao protein, lipid, carbohydrate, khoáng vitamin Nhiều nhà nghiên cứu đưa giải pháp khác để giảm hay loại bỏ chất gây dị ứng thực phẩm xử lý nhiệt, tìm chọn giống có hàm lượng chất gây dị ứng thấp, vacine, phương pháp chuyển gen Trong phương pháp chuyển gen cho phương pháp khả quan thành công để hạn chế hay loại bỏ chất gây dị ứng họ đậu 5.1 Khái niệm chuyển gen Chuyển gen (transgenesis) đưa đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen thể đa bào, sau đoạn DNA ngoại lai có mặt hầu hết tế bào truyền lại cho hệ sau Vì khái niệm chuyển gen sử dụng cho thực vật động vật Nấm men, vi khuẩn tế bào nuôi cấy mang đoạn DNA ngoại lai gọi tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) tế bào biến nạp (transformed cell) [29,51] Về mặt lịch sử, thuật ngữ GMO (genetically modified organism)-sinh vật biến đổi gen, sử dụng chủ yếu để thực vật chuyển gen gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm cho người động vật Logic xác hơn, GMO đề cập tới tất thể sống biến đổi di truyền, bao gồm vi sinh vật Thuật ngữ GMP (genetically modified plant)-thực vật biến đổi gen GMA (genetically modified animal) - động vật biến đổi gen sử dụng [29] Trong thực tế, đoạn DNA ngoại lai sử dụng để tạo sinh vật chuyển gen hầu hết gen ln có sẵn trình tự phù hợp với promoter làm cho biểu thành RNA, nói tổng quát protein [29] 88 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Sản phẩm phiên mã gen RNA không dịch mã thành protein Ðây trường hợp RNA ngược hướng (antisense RNA), rybozyme gen phiên mã RNA polymerase I III [29] 5.2 Khái niệm thực vật chuyển gen Muốn tạo sinh vật biến đổi gen (genetically modified organism-GMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào tế bào chúng Ở vi khuẩn, tế bào xử lý dung dịch muối calcium chloride Ở tế bào nấm men, tiếp nhận DNA tăng lên tế bào tiếp xúc với lithium chloride lithium acetate Tuy nhiên, phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có phương pháp khác tinh vi Chuyển gen thực vật phát triển với phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nó trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu sinh học thực vật Ngoài việc mở triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào trồng, kỹ thuật cho phép nghiên cứu cấu trúc điều khiển hoạt động gen Quá trình đưa DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) sinh vật gọi trình biến nạp (transformation) Những biến nạp gọi biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Ứng dụng công nghệ gen cơng tác giống trồng đại có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như: - Bằng việc biến nạp gen thu mang đặc tính xác định - Rào cản lồi khơng cịn có tác dụng, khơng gen từ thực vật mà từ vi khuẩn, nấm, động vật người chuyển thành công vào thực vật Về nguyên tắc thay đổi vùng điều khiển gen, promoter terminator Tuy nhiên, số trường hợp đòi hỏi thay đổi phù hợp codon - Những đặc điểm không mong muốn thực vật Chẳng hạn, tổng hợp chất độc chất gây dị ứng loại trừ công nghệ gen - Thực vật biến đổi gen lị phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu protein chất cần thiết dùng dược phẩm thực phẩm - Mở khả nghiên cứu chức gen trình phát triển thực vật trình sinh học khác Vì vậy, thực vật biến đổi gen có ý nghĩa nghiên cứu - Trong lai tạo giống đại, công nghệ gen giúp làm giảm mâu thuẫn kinh tế môi trường sinh thái Bằng việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật 89 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 5.3 Một số nguyên tắc chuyển gen 5.3.1 Một số nguyên tắc sinh học Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thơng qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào.Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) 5.4 Liệu pháp gen đậu phộng: 5.4.1 Cơ chế loại bỏ chất gây dị ứng đậu phộng liệu pháp gen: Đường dịng thơng tin di trưyền thường từ DNA phiên mã tạo thành mRNA , sau mRNA dịch mã tạo thành protein Ví dụ trường hợp Ara h 1, hệ gen gồm 2275 bp phiên mã thành mRNA vơi 1875 bp , sau dịch mã thành protein Ara h có 636 acid amin Như để loại chất gây dị ứng đậu phộng ta tác động vào đường dịng thơng tin di truyền Chẳng hạn, để loại bỏ Ara h ta tác động q trình phiên mã (cịn gọi điều hịa phiên mã) hay sau q trình phiên mã (cịn gọi điều hòa sau phiên mã) Điều hòa sau phiên mã thích hợp để điều hịa chất dị ứng đậu phộng tính đặc hiệu phân hủy mRNA Nguyên tắc điều hòa sau phiên mã: 90 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Gen chất gây dị ứng sau biến đổi biến nạp vào tế bào thực vật thông qua vectơ chuyển gen Bên tế bào, trình phiên mã từ gen chuyển tạo thành RNA mạch kép (double-stranded RNA- dsRNA) RNA mạch kép sau bị cắt thành RNA mạch kép ngắn từ 21-25 nucleotide (siRNA) enzyme cắt đoạn gọi Dicer (Dicer ribonucelase thuộc họ RNAse III) Một mạch đơn siRNA gắn với RISC (RNA-induced silencing complex)một loại nucleoprotein- tạo thành phức hợp siRNA-RISC Dưới hướng dẫn siRNA, phức hợp ngăn ngừa mạch kép siRNA nối lại với Đồng thời tìm thấy mạch mRNA đích kích hoạt enzyme RNAse cắt nhỏ mRNA đích Khi mRNA bị phá hủy trình dịch mã khơng thể diễn protein tổng hợp khơng thể tạo thành Hình 5.1: Sơ đồ mơ tả đường dịng thơng tin việc hình thành Ara h a) Đường dịng thơng tin từ DNARNA protein Ara h b) Sơ đồ bước điều hòa sau phiên mã để hạn chế hình thành Ara h 91 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 5.4.2 Các bước để tạo đậu phộng giảm chất gây dị ứng 5.4.2.1 Tách đoạn gen chất gây dị ứng Yêu cầu để điều hòa gen chất gây dị ứng đậu phộng xác định DNA mã hóa cho protein đích Đoạn DNA dùng để tạo đoạn DNA biến đổi dùng chuyển gen Mặc dù cDNA chất gây dị ứng đậu phộng tách dịng, việc phân lập xác định trình tự hệ gen chất dị ứng chủ đích cần thiết lý sau: Giúp hiểu tốt cấu trúc hoạt động gen Phát thơng tin khơng có cDNA diện intron promoter 5.4.2.2 Xây dựng vectơ biến nạp Một đoạn gồm 430 cặp base khuếch đại PCR từ mã hóa DNA gen Ara h dùng để xây dựng vector biến nạp Đoạn gen chuyển Ara h nối với gen khởi động CaMV 35S ( từ virus khảm bắp cải) gen kết thúc NOS vi khuẩn A Tumefacien tách dòng vector pUC18 Kết ta plasmid pDK2 Khi cho pDK2 tiếp hợp với plasmid pCB13- plasmid chọn có chứa gen kháng kháng sinh để biến nạp vào tế bào 5.4.2.3 Tái sinh đậu phộng chuyển gen có chứa Ara h chuyển gen Sau đến tháng từ lúc pDK2 pCB13 tiếp hợp, 48 dòng kháng hygromycin chọn để tái sinh thành Phân tích PCR thực để xác định tế bào có chứa gen khởi độn CaMV35S- đoạn DNA vốn khơng có gen đậu phộng bình thường Khoảng 75% (36/48) dòng thể dãy 0,6 kb tương ứng với kích thước gen CaMV 35S chuyển gen tái sinh từ dòng 9-13 tháng Sự hòa hợp gen chuyển Ara h vào gen đậu phộng xác định phương pháp lai Southern Trình tự đích gen khởi động CaMV 35S DNA trích từ hai dịng biến nạp khơng biến nạp thủy phân HindIII/BglII để giải phóng đoạn gen khởi động 0,6 kb Đoạn dò san phẩm PCR CaMV 35S Dãy kết thể hòa hợp gen chuyển gen đậu phộng 5.5 Liệu pháp gen đậu nành Đối với đậu nành giảm loại bỏ chất gây dị ứng cách tạo dòng đột biến hay gây giống (Samoto cộng 1997) Tuy nhiên, hai phương pháp không thành công Gly m Bd 30K- chất gây dị ứng chủ yếu đậu nành Gly m Bd 30 K phần có mối quan hệ với globulin hạt mà globulin lại protein chủ yếu soy isolate Nó có mặt hầu hết sản phẩm thực phẩm chứa protein đậu nành 92 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Các nhà khoa học đưa đề nghị sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp để loại bỏ protein không mong muốn Gly m Bd 30K để tăng tính an toàn cho thực phẩm Trong phương pháp nhà khoa học tạo dòng đậu nành biến đổi gen cách chuyển gen gây im lặng Gly m Bd 30K Các bước tạo đậu nành chuyển gen thực sau: 5.5.1 Tách dịng Gly m Bd 30 K Tồn vùng mã hóa từ Gly m Bd 30 K cDNA lấy từ thư viên cDNA khuếch đại phản ứng PCR thiết bị GeneAmp PCR System (Applied Biosystem, Foster City, CA) Trong phương pháp PCR ta sử dụng Pfu polymerase với hai primer là: 5’-GAATTCGCGGCCGCATGGGTTTCCTTGTGT-3’ 5’GAATTCGCGGCCGCTCAAAGAGGAGAGTGA-3’ Đầu kết thúc 3’ primer gắn với nucleotide từ 3-8 (đối với primer 1) 1129 đến 1144 (đối với primer 2) chuỗi cDNA 5.5.2 Xây dựng vector biểu Vector biểu chọn plasmid pKS76 vi khuẩn Agrobacterium tumefacien Vector xây dựng gồm khung đọc mở hoàn chỉnh Gly m Bd 30 K cDNA, gen chịu điều khiển gen khởi động β-conglycinin gen kết thúc phaseolin (phaseolin termination region); gen thị chọn lọc để dễ dàng phân bíệt tế bào chuyển gen - gen kháng hygromycin (hygromycine loại kháng sinh cịn gen kháng hygromycine có vai trị enzyme phophotransferase) Gen kháng hygromycine có từ hai nguồn vi khuẩn (với gen khởi động T7) virus khảm bắp cải (với gen khởi động 35S) Hình 5.2 : Bản đồ plasmid pKS76 93 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 5.5.3 Chuẩn bị vi khuẩn trước cho lây nhiễm (biến nạp) với phôi thể soma Sau tạo vector biểu hiện, vi khuẩn cần nuôi cấy chuẩn bị trước cho lây nhiễm với mẫu Vi khuẩn nuôi cấy môi trường lỏng LB (V Nagaraju, 1998) (200 vòng/phút, 24 giờ) Dịch vi khuẩn ly tâm để lấy sinh khối tế bào vi khuẩn tốc độ 5000 vòng/phút phút điều kiện nhiệt độ phịng pha mơi trường pha lỗng Sau vi khuẩn rửa nhanh từ 3-5 lần nước cất vô trùng 5.5.4 Lây nhiễm mầm với vi khuẩn Mẫu cấy callus ngâm dung dịch vi khuẩn với thời gian phút, vớt ra, để khô giấy thấm vô trùng sau cấy lên mơi trường agar (SB103) khơng có hormon kháng sinh Phôi nuôi cấy tuần 260C đèn huỳnh quang 5.5.5 Chọn lọc thể biến nạp Mầm sau nuôi cấy tách theo dõi xem có Gly m Bd 30K hay không phương pháp blotting Mầm làm lạnh dung dịch nitơ, nghiền cối trích dung dịch đệm gồm 0.125 m Tris-HCl, pH 6,8; 0,4% [w/v] SDS; 20% [w/v] glycerol 0,2% [w/v] 2-mercaptoethanol) với tỉ lệ 1:5 [w/v] Các protein hòa tan tách SDS-PAGE lai màng nitrocellulose Màng dò kháng thể đơn dòng gắn với Gly m Bd 30K hay IgE từ huyết người Từ ta xác định cá thể chuyển gen thành công 5.5.6 Tái sinh thành hồn chỉnh phân tích đánh giá mức độ biểu Những dịng cho thấy có chuyển gen tái sinh thành tiếp tục theo dõi mức độ biểu chúng qua hệ Kết cho thấy ổn định gen chuyển gen đậu nành hiệu việc giảm Gly m Bd 30 K Kalinski cộng sử dụng kính hiển vi điện tử đánh dấu miễn dịch vàng để quan sát xem liệu có khác cấu trúc mức tế bào dòng Gly m Bd 30 K chuyển gen dịng khơng chuyển gen có chứa Gly m Bd 30 K Theo kết hình, ta thấy giống hình thái không bào dự trữ protein (protein storage vacuole – PSV) hai dòng Tuy nhiên Gly m Bd 30 K khơng xuất dịng chuyển gen xuất dịng khơng có chuyển gen Không bào dự trữ protein 94 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Không bào dự trữ protein Oil body Oil body Không bào dự trữ protein Hạt chất Không béo Hạt béo bào dự chất trữ protein Hình 5.3: Kết phân tích hai dịng chuyển gen khơng chuyển gen phương pháp pháp hiển vi điện tử đánh dấu miễn dịch vàng a) Dịng khơngchuyển gen b) Dịng chuyển gen 95 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Stef J Koppelman , Sue L Hefle, Detecting allergens in food,CRC Press- Woodhead Publishing Limited, Abington Hall, Abington, [2] Samuel B Lehrer, Rosalla Ayuso Gerald,Current Understanding of Food Allergens, New York Academy of Sciences, 964: 69–85 (2002) [3] Burks AW, Williams LW, Helm RM, Connaughton C, Cockrell G, O’Brien T (1991) J Allergy Clin Immunol 88, 172–179 [4] Jones, S M., Magnolfi, C F., Cooke, S K., Sampson, H A (1995), J Allergy Clin Immunol 96, 341–351 [5] Stanley JS, Burks AW, Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2, Arch Biochem Biophys 1997; 342:244±253 [6] Sloan AE, Powers ME A perspective on popular perceptions of adverse reactions to foods, J Allergy Clin Immunol 1986; 78:127-133 [7] Anderson JA, Sogn DD (eds.) Adverse reactions to foods, NIH Publication No.842442, 1984, pp 1-6 [8] Metcalfe DD, Food allergens, Clin Rev Allergy 1985; 3:331-349 [9] Lemanske RF, Taylor SL, Standardized extracts, Foods Clin Rev Allergy 1987; 5:23-36 [10] Bush RK, Taylor SL, Nordlee JA, Peanut sensitivity, Allergy Proc 1989; 10:261264 [11] Gillespie DN, Nakajima S, Gleich GJ, Detection of allergy to nuts by the radioallergosorbent test, J Allergy Clin Immunol 1976; 57:302-309 [12] Taylor SL, Busse WW, Sachs M1, Parker JL, Yunginger JW, Peanut oil is not allergenic to peanut sensitive individuals, J Allergy Clin Immunol 1981; 68:372-375 [13] Burks AW, Wllliams LW, Helm RM, Connaughton C, Cockrell G, O'Brien T 96 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Identification of a major peanut allergen, Ara h I, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges, J Allergy Clin Immunol 1991; 88:172-179 [14] Burks AW, Cockrell G, Stanley JS, Helm RM, Bannon GA, Recombinant peanut allergen Ara h I expression and IgE binding in patients with peanut hypersensitivit, J Clin Invest 1995; 96:1715-1721 [15] Burks AW, Williams LW, Connaughton C, Cockrell G, O'Brien T, Helm RM, Identification and characterization of a second major peanut allergen, Ara h II, utilizing the sera of patients with atopic dermatitis and positive peanut challenge, J Allergy Clin Immunol 1992; 90:962-969 [16] Eigenmann PA, Burks AW, Bannon GA, Sampson HA, Identification of unique peanut and soy allergens in sera adsorbed with cross-reacting antibodies, J Allergy Clin Immunol 1996; 98:969-978 [17] Rabjohn P, Helm E, Stanley JS, West CM, Sampson HA, Burks AW, et a, Molecular cloning and epitope analysis of the peanut allergen Ara h , J Clin Invest 1999; 103:535-542 [18] Burks AW, Shin D, Cockrell G, Stanley JS, Helm R, Bannon, GA, Mapping and mutational analysis of the IgE binding epitopes on Ara h I, a legume storage protein and a major peanut allergen, Eur J Biochem 1997; 245:334-339 [19] Aalberse RC, Structural biology of allergens, J Allergy Clin Immunol 2000; 106:228–38 [20] Chapman MD, Allergen nomenclature, In: Lockey RF, Bukantz SC, Bousquet J, eds, Allergens and allergen immunotherapy New York: Marcel Dekker, Inc, 2004; 51–64 [21] Maeyama K, Hohman RJ, Metzger H, Beaven MA, Quantitative relationships between aggregation of IgE receptors, generation of intracellular signals, and histamine secretion in rat basophilic leukemia (2H3) cells Enhanced responses with heavy water, Enhanced responses with heavy water J Biol Chem 1986; 261:2583–92 [22] Torigoe C, Inman JK, Metzger H, An unusual mechanism for ligand antagonism, Science 1998; 281:568–72 97 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh [23] Mita H, Yasueda H, Akiyama K, Affinity of IgE antibody to antigen influences allergen-induced histamine release, Clin Exp Allergy 2000; 30:1583–9 [24] Kleine Budde I, de Heer PG, van der Zee JS, Aalberse RC, The stripped basophil histamine release bioassay as a tool for the detection of allergen-specific IgE in serum, Int Arch Allergy Immunol 2001; 126:277–85 [25] Van der Zee JS, van Swieten P, Jansen HM, Aalberse RC, Skin tests and histamine release with P1-depleted Dermatophagoides pteronyssinus body extracts and purified P1, J Allergy Clin Immunol 1988; 81:884–96 [26] Maleki SJ, Chung SY, Champagne ET, Raufman JP, The effects of roasting on the allergenic properties of peanut proteins, J Allergy Clin Immunol 2000 [27] Maleki SJ, Viquez O, Jacks T et al, The major peanut allergen, Ara h 2, functions as a trypsin inhibitor, and roasting enhances this function, J Allergy Clin Immunol 2003; 112:190–5 [28] Maleki SJ, Hurlburt BK, Structural and functional alterations in major peanut allergens caused by thermal processing, J AOAC Int 2004; 87:1475–9 [9] [29] Stanley JS, King N, Burks AW, Huang SK, Sampson H, Cockrell G, Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Ara h 2, Arch Biochem Biophys 1997; 342:244-253 [30] Shin D, Compadre C, Maleki S, Kopper R, Sampson H, Huang S-K, Burks AW, Biochemical and structural analysis of the IgE binding sites on Ara h 1, an abundant and highly allergenic peanut protein, J Biol Chem 1998; 273:13753-13759 [31] Sampson HA, McCaskill CC, Food hypersensitivity and atopic dermatitis: evaluation of 113 patients, J Pediat 1985; 107-669 [32] Bock SA, Sampson HA, Atkins FM, Zeiger RS, Lehrer S, Sachs M, et al, Doubleblind, placebo-controlled food challenge (DBPCFC) as an office procedure: a manual, J Allergy Clin Immunol 1988; 82-986 [33] Sampson HA, Food sensitivity and the pathogenesis of atopic dermatitis, J Roy Soc Med 1997 98 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh [34] Langeland T, A clinical and immunological study of allergy to hen's egg white.III Allergens in hen's egg white studied by crossed radio- immunoelectrophoresis (CRIE), Allergy: Eur J Allergy Clin Immunol 1982; 37-521 [35] Hoffman DR, Immunochemical identification of the allergens in egg white, J Allergy Clin Immunol 1983; 71:481 [36] Holen E, Elsayed S, Characterization of four major allergens of hen egg-white by IEF/SDS-PAGE combined with electrophoretic transfer and IgE- immunoautoradiography, Int Arch Allergy Appl Immunol 1990; 91:136 [37] Bernhisel-Broadbent J, Dintzis HM, Dintzis RZ, Sampson HA, Allergenicity and antigenicity of chicken egg ovomucoid (Gal d III) compared with ovalbumin (Gal d I) in children with egg allergy and in mice, J Allergy Clin Immunol 1994; 93:1047 [38] Egge H, Peter-Katalinic J, Paz-Parente J, Strecker G, Montreuil J, Fournet B, Carbohydrate structures of hen ovomucoid A mass spectrometric analysis, FEBS Lett 1983; 156-357 [39] Matsuda T, Watanabe K, Nakamura R, Immunochemical studies on thermal denaturation of ovomucoid, Biochim Biophys Acta 1982 [40] Honma K, Aoyagi M, Saito K, Nishimuta T, Sugimoto K, Tsunoo H, et al, Antigenic determinants on ovalbumin and ovomucoid: comparison of the specificity of IgG and IgE antibodies , Arerugi Jpn J Allergol 1991; 40:1167 [41] Cooke SK, Sampson HA, Allergenic properties of ovomucoid in man, J Immunol 1997; 159:2026 [42] Honma K, Kohno Y, Saito K, Shimojo N, Tsunoo H, Niimi, Specificities of IgE, IgG and IgA antibodies to ovalbumin Comparison of binding activities to denatured ovalbumin or ovalbumin fragments of IgE antibodies with those of IgG or IgA antibodies, Int Arch Allergy Immunol 1994 [43] Kahlert H, Petersen A, Becker WM, Schlaak M, Epitope analysis of the allergen ovalbumin (Gal d II) with monoclonal antibodies and patients' IgE, Mol Immunol 1992; 29-1191 99 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh [44] Honma K, Kohno Y, Saito K, Shimojo N, Horiuchi T, Hayashi H, et al, Allergenic epitopes of ovalbumin (OVA) in patients with hen's egg allergy: inhibition of basophil histamine release by haptenic ovalbumin peptide, Clin Exp Immunol 1996; 103-446 [45] Docena GH, Fernandez R, Chirdo FG, Fossati C, Identification of casein as the major allergenic and antigenic protein of cow's milk, Allergy: Eur J Allergy Clin Immunol 1996; 51-412 [46] Kumosinski TF, Brown EM, Farrell HM, Jr, Three-dimensional molecular modeling of bovine caseins: alpha sl-casein, J Dairy Sci 1991 [45] T Ogawa, N Bando, H Tsuji, K Okajima, K Nishikawa, K Sasaoka, J Nutr Sci Vitaminol 37 (1991) 555-565 [46] T Ogawa, H Tsuji, N Bando, Y Kitamura, Y.-U Zhu, H Hirano, K Nishikawa, Biosci Biotech Biochem 57 (1993) 1030-1033 [47] T Ogawa, N Bando, H Tsuji, K Nishikawa, K Kitamura, Biosci, Biotech Biochem 59 (1995) 831^833 [48] H Tsuji, N Bando, M Hiemori, R Yamanishi, M Kimoto, K Nishikawa, T Ogawa, Biosci Biotech Biochem 61 (1997) 942-947 [49] H Tsuji, T Oka, M Kimoto, Y.-M Hong, Y Natori, T Ogawa, Biochim Biophys Acta 1309 (1996) 31-36 [50] F Sanger, E.F Nicklen, A.R Coulson, Proc Natl Acad Sci USA 74 (1977) 5463-5467 [51] T Katsube, M Adachi, N Maruyama, K Ichise, Y Takenaka, S Utsumi, Plant Physiol 109 (1995) 722-723 [52] H Tsuji, M Kimoto, H Watanabe, T Sasagawa, T Oka, H Yamashita, M Okita, Biochim Biophys Acta 1425 (1998) 628-631 [53] M Hiemori, N Bando, T Ogawa, H Shimada, H Tsuji, R Yamanishi, J Terao, Int Arch Allergy Immunol 122 (2000) 238-245 [54] K Inoue, A Motozaki, Y Takeuchi, M Nishimura, I Hara-Nishimura, Plant J (1995) 235-243 100 Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh 101 .. .Đồ án Công nghệ thực phẩm GVHD: Cô Vũ Thị Kim Hạnh Chương KHÁI QUÁT VỀ DỊ ỨNG THỰC PHẨM 1.1 Khái niệm dị ứng thực phẩm Dị ứng thực phẩm nghĩa thể có phản ứng miễn dịch khác thường loại thực phẩm. .. phản ứng miễn dịch chất gây dị ứng xâm nhập vào thể: Chất gây dị ứng xâm nhập vào thể cách thơng qua da, đường tiêu hóa hay đường hô hấp Với cá thể dị ứng với chất kể từ lúc phản ứng dị ứng bắt... đa số protein tổng đậu phộng Các chất gây dị ứng thứ yếu khác từ ara h3 đến ara h8 [39 ] Chất dị ứng Bảng 2.8: Các chất gây dị ứng đậu phộng [ 39] Phân tử pI Chức sinh học Họ protein lượng Tỉ