Hình 4.12: Giếng dùng trong phân tích Elisa (loại 96 giếng) d) Tiến hành:
Hình 4.13: Quy trình xác định hàm lượng Ara h 1 trong đậu phộng rang/luộc. Ủ qua đêm ở 4oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 10 phút Dừng phản ứng ezyme Đo OD 450nm nghiền Trích ly Ly tâm lấy phần nổi 12g đậu phộng DD PBS, NaCl 1M, pH 7.4 100 µl mAb 2F7 100µl 2C12 -bitotin 100µl O- pheylenediamine 50µl HCl Kết quả 100µl HPR- avidin Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa 100 µl 16000 v/ph 5 phút
Chuẩn bị dịch trích đậu phộng:
Để chuẩn bị đậu phộng rang ta lấy 12g đậu phộng tươi đem rang ở 177oC ứng với các khoảng thời gian là 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút.
Sau đó đem 2-3 g đậu phộng tươi và rang đi nghiền và trích ly ở 600C trong 10 phút với dịch trích gồm 20mM NaH2PO4, NaCl 1M (dung dịch phosphate buffer saline –PBS, pH = 7.4) và 1% sữa bột tách béo.
Tiếp theo đem dung dịch đi ly tâm 16000 vòng/ phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, lấy phần nổi rồi làm lạnh đến -200C.
Hàm lượng protein tổng trong dịch trích đựoc xác định bằng phương pháp Kielhdal hay Brafford.
Chuẩn bị mẫu
Tương tự như chuẩn bị mẫu với nồng độ chất chuẩn được chuẩn bị từ 0.01
µg/ml đến 10 µg/ml.
Chuẩn bị dung dịch kháng thể bắt:
Kháng thể 2F7 được pha loãng với tỉ lệ 1:1000 v/v trong dung dịch đệm carbonate 50 mM, pH=9.6 (gồm 15 mM Na2CO3 và 35 mM NaHCO3) [27].
Chuẩn bị dung dịch kháng thể phát hiện:
Kháng thể 2C12 được pha loãng đến nồng độ 1mg/1ml trong dung dịch đệm carbonate và được thêm vào 0.1 ml biotin-X-NHS mỗi ml (hóa chất của Calbiochem). Sau đó dung dịch được đem đi lắc đều trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Phản ứng được dừng bằng cách thêm vào 0.1 ml dung dịch NH4Cl 1M ứng với mỗi ml dung dịch kháng thể 2C12. Ta tiếp tục lắc đều hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem đi thẩm tích bằng 500ml dung dịch PBS với 0.01% thimersol, pH=7.4 ở 4oC. Sau đó, 500 ml dung dịch PBS và thimsersol khác sẽ được thay thế và thẩm tích một lần nữa trong 4 giờ. Kháng thể 2C12 được biotin hóa được ổn định bằng cách thêm vào 2% bovine serum albumin. Hỗn hợp được chia thành mỗi phần 0.5 ml và đem đi trữ ở -70oC [27,29]
Chuẩn bị dung dịch enzyme :
Enzyme horseadish peroxidase có gắn avidin sẽ được pha loãng trong dung dịch đệm với tỉ lệ 1:1000 [29].
Thực hiện trên thíết bị
100µl kháng thể bắt 2F7 được pha loãng trong dung dịch đệm và cho vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 40C [22]. Kháng thể bắt sẽ gắn chặt lên giếng. Sau đó ta rửa giếng 4 lần bằng dung dịch rửa để loại bỏ những kháng thể không gắn được lên giếng. Dung dịch rửa gồm 40ml dung dịch PBS 10mM và 0.05% Tween 20 pha trong 960 ml nước cất [21].
Ara h 1 Ara h 2 Gly m 1
Kháng thể bắt 2F7 4996D3 6G1
Kháng thể phát hiện 2C12 5048B3 1G10
Enzyme horseadish peroxidase/ streptavidin-peroxidase Cơ chất
100µl chất chuẩn hay chất cần phân tích được thêm vào giếng. Sau khi ủ trong 1 giờ ở 370C, giếng được rửa 4 lần. Những chất không kết hợp với kháng thể bắt sẽ bị rửa trôi [27].
100 µl kháng thể phát hiện 2C12 đã biotin hóa được thêm vào và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp tực ta rửa 4 lần để loại đi những kháng thể không liên kết [27].
100 µl dung dịch enzyme HRP-avidin được cho vào, ủ trong 1 giờ ở 37oC. Lúc này avidin trên enzyme sẽ liên kết vói biotin trên kháng thể phát hiện. Những enzyme không liên kết với kháng thể sẽ bị rửa khỏi giếng sau đó [27].
100 µl dung dịch citrat có chứa O-phenylenediamine (cơ chất của enzyme) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5-10 phút. Phản ứng xảy ra làm dung dịch từ không màu chuyển thành màu nâu/ cam/ vàng. Để dừng phản ứng ta sử dụng 100 µl HCl 2N [27].
Mật độ quang ở mỗi giếng sẽ được đo bởi một đầu đọc ở bước sóng 450nm (thiết bị spectramax 340 của Đức). Một đường cong chuẩn được xây dựng dựa trên sự thay đổi mất độ quang của dãy nồng độ chất chuẩn. Nồng độ của chất mẫu cần phân tích có thể xác định dựa trên đường chuẩn bằng phần mềm tính tóan của thiết bị.
e) Kết quả
Theo đồ thị ta thấy hàm lượng protein giảm dần theo thời gian rang.
Hàm lượng Ara h 1 trong quá trình rang tăng lên và đạt giá trị cao trong khoảng thời gian từ 10-15 phút với giá trị cao gấp 22 lần so với đậu phộng tươi (820 và 27 µg/mL), sau đó giảm xuống trong khoảng thời gian từ 20-30 phút [27].
Hình 4.14: Đồ thị thể hiện hàm lượng protei tổng và Ara h 1 theo thời gian rang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});