Gel polyacrylamide đuợc dùng với nồng độ 15%. Gel có độ dày 1mm, chiều dài 15 cm và chiều rộng 10 cm [47].
Lắp khuôn gel
Khuôn gel thường làm từ hai tấm thủy tinh khác nhau: một tấm hình chữ nhật, tấm khác có kích thước hoàn toàn tương tự nhưng được cắt bớt một phần ở một cạnh trừ hai góc, hai phần chừa lại này làm thành hai "tai" ("rabbit ear"). Phần cắt bớt của tấm kính là nơi ráp "lược" tạo các lỗ tải mẫu và sau đó, trong quá trình điện di, là nơi dung dịch đệm điện di kết nối với gel duy trì dòng điện giữa hai đầu (đầu có tai và đầu đáy) của bản gel [40].
Điện di trên gel
Nhuộm Coomassie brilliant blue
Định lượng bằng sắc khí khối phổ
Kết quả
Chuẩn bị mẫu chạy điện di
Dịch trích đậu phộng Tris 63 mM (pH 6.8); 1% DTT; 2% SDS; 0,01% bromphenol bule ; 40 % (v/v) glycerol 15 phút đầu : U=80V 1 giờ sau : U= 160V Chuẩn bị gel 15% 10 µL
Để lắp khuôn gel ta tiến hành thao tác như sau :
Ta rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol. iếp theo các tấm thủy tinh đuợc ráp theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao cho tạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào : Trước tiên ta đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi đặt tấm thủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khít nhau. Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, các mép bên và khe hở đáy bản gel có thể dán bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp). Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không cần kẹp [40].
Hình 4.5: Sơ đồ một mẫu khuôn bản gel polyacrylamide đơn giản [40].
Chú thích: Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy.
Chuẩn bị gel phân tách:
Ta thường sử dụng bản gel có độ dày 1 mm, rộng và dài 15 cm. Loại bản gel này cần khoảng 20 ml dịch nguyên liệu. Có thể dựa theo bảng dưới đây để chế tác gel phân tách (seperating gel) có nồng độ theo yêu cầu.
Bảng 4.1: Chuẩn bị gel phân tách theo nồng độ của gel [40] Thành phần (ml) Nồng độ của gel (%) 5% 8% 10% 12% 15% Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 5 5 5 5 5 Dung dịch acrylamide 30% 3.3 5.3 6.7 8 10 SDS 10% 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Ammonium persulfate (AP) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Nước 11.3 9.3 7.9 6.6 4.6
(Dung dịch acrylamide 30% gồm acrylamide 29% và bisacrylamide 1%)
Ta thêm vào dung dịch trên 10 ml TEMED rồi rót dịch vào khuôn gel đến 8/10 độ cao. Sau đó cho thêm nước cất hoặc ethanol một cách nhẹ nhàng lên lớp dung dịch acrylamide và chờ gel cứng.